Injeção de células osteossarcoma intratibiais para gerar modelos de osteossarcoma ortotópico e metástase pulmonar

Summary

O presente protocolo descreve a injeção de célula de osteossarcoma intratibia para gerar modelos de camundongos com osteossarcoma ortotópico e lesões de metástase pulmonar.

Abstract

O osteossarcoma é o câncer ósseo primário mais comum em crianças e adolescentes, sendo os pulmões o local metastático mais comum. A taxa de sobrevivência de cinco anos de pacientes com osteossarcoma com metástase pulmonar é inferior a 30%. Portanto, a utilização de modelos de camundongos imitando o desenvolvimento do osteossarcoma em humanos é de grande importância para a compreensão do mecanismo fundamental da osteossarcoma carcinogênese e metástase pulmonar para desenvolver novas terapêuticas. Aqui, procedimentos detalhados são relatados para gerar os modelos primários de osteossarcoma e metástase pulmonar através da injeção de intratibia de células osteossarcoma. Combinados com o sistema de bioluminescência ou imagem viva de raios-X, esses modelos de camundongos vivos são utilizados para monitorar e quantificar o crescimento e a metástase do osteossarcoma. Para estabelecer esse modelo, uma matriz de membrana de porão contendo células osteossarcoma foi carregada em uma seringa de micro volume e injetada em uma tíbia de cada rato atímico após ser anestesiada. Os camundongos foram sacrificados quando o osteossarcoma primário atingiu a limitação de tamanho no protocolo aprovado pela IACUC. As pernas com osteossarcoma e os pulmões com lesões de metástase foram separados. Esses modelos são caracterizados por um curto período de incubação, crescimento rápido, lesões graves e sensibilidade no monitoramento do desenvolvimento de lesões metastáticas primárias e pulmonares. Portanto, estes são modelos ideais para explorar as funções e mecanismos de fatores específicos na carcinogênese osteossarcoma e metástase pulmonar, o microambiente tumoral e avaliar a eficácia terapêutica in vivo.

Introduction

O osteossarcoma é o câncer ósseo primário mais comum em crianças e adolescentes ^1,2, que se infiltra principalmente no tecido circundante, e até mesmo metástase nos pulmões quando os pacientes são diagnosticados. A metástase pulmonar é o principal desafio para a terapia osteossarcoma, e a taxa de sobrevivência de cinco anos de pacientes com osteossarcoma com metástase pulmonar permanece tão baixa quanto 20%-30%^3,4,5. No entanto, a taxa de sobrevivência de cinco anos de osteossarcoma primário foi aumentada para cerca de 70% desde a década de 1970 devido à introdução da quimioterapia⁶. Portanto, é urgentemente necessário entender o mecanismo fundamental da osteossarcoma carcinogênese e metástase pulmonar para desenvolver novas terapias. A aplicação de modelos de camundongos que melhor imitam a progressão do osteossarcoma em humanos é de grande significado⁷.

Os modelos animais osteossarcoma são gerados por engenharia genética espontânea e induzida, transplante e outras técnicas. O modelo de osteossarcoma espontâneo raramente é utilizado devido ao longo tempo de formação do tumor, taxa de ocorrência de tumor inconsistente, baixa morbidade e baixa estabilidade ^8,9. Embora o modelo de osteossarcoma induzido seja mais acessível para obter do que o osteossarcoma espontâneo, a aplicação do modelo osteossarcoma induzido é limitada porque o fator indutor afetará o microambiente, a patogênese e características patológicas da osteossarcoma¹⁰. Modelos transgênicos estão ajudando a entender a patogênese dos cânceres, pois podem simular melhor os ambientes fisiológicos e patológicos humanos; no entanto, os modelos animais transgênicos também têm suas limitações devido à dificuldade, a longo prazo e alto custo de modificação transgênica. Além disso, mesmo nos modelos de animais transgênicos mais amplamente aceitos gerados pela modificação genética p53 e rb, apenas 13,6% do sarcoma ocorreu nos ossos de quatro membros^11,12.

O transplante é um dos métodos de produção de câncer metastáticos primários e distantes mais utilizados nos últimos anos devido à sua manobra simples, taxa de formação de tumores estáveis e melhor homogeneidade¹³. O transplante inclui transplante heterotópico e transplante ortotópico de acordo com os locais de transplante. No transplante heterotópico osteossarcoma, as células osteossarcoma são injetadas fora dos sítios osteossarcoma primários (osso) dos animais, comumente sob a pele, subcutâneamente¹⁴. Embora o transplante heterotópico seja simples sem a necessidade de realizar cirurgia em animais, os locais onde as células osteossarcoma são injetadas não representam o microambiente osteossarcoma humano real. Transplante ortotópico osteossarcoma é quando as células osteossarcoma são injetadas nos ossos dos animais, como a tíbia^15,16. Em comparação com os enxertos heterotópicos, os enxertos de osteossarcoma ortotópicos são caracterizados por um curto período de incubação, crescimento rápido e forte natureza erosiva; portanto, são modelos animais ideais para estudos relacionados ao osteossarcoma¹⁷.

Os animais mais usados são camundongos, cães e zebrafish^18,19. O modelo espontâneo de osteossarcoma é geralmente usado em caninos porque o osteossarcoma é um dos tumores mais comuns em caninos. No entanto, a aplicação desse modelo é limitada devido ao longo tempo de formação do tumor, à baixa taxa de tumorigênese, à má homogeneidade e à estabilidade. Zebrafishes são frequentemente usados para construir modelos de tumor transgênicos ou nocaute por causa de sua reprodução rápida²⁰. Mas os genes dos zebrafish são diferentes dos genes humanos, então suas aplicações são limitadas.

Este trabalho descreve os procedimentos detalhados, precauções e imagens representativas para a produção do osteossarcoma primário na tíbia com metástase pulmonar por injeção intratibia de células osteossarcoma em camundongos atrímicos. Este método foi aplicado para criar o osteossarcoma primário na tíbia do camundongo para avaliação da eficácia terapêutica, que apresentou alta reprodutibilidade^21,22.

Protocol

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo comitê de bem-estar animal da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Xangai. Camundongos atrímicos balb/c machos de quatro semanas de idade foram aclimatados por uma semana antes da cirurgia para injeção ortotópica de células osteossarcoma. Os camundongos foram alojados em gaiolas de camundongos ventiladas individualmente com cinco ratos por gaiola em um ciclo claro/escuro de 12 horas com acesso ad libitum à alimentação spf e água estéril. <p …

Representative Results

Modelos pulmonares ortotópicos (primários) bem sucedidos (primários) e metastáticos dependem da injeção ortotópica precisa das células osteossarcoma. Aqui, um modelo ortotópico (primário) de osteossarcoma através da injeção de célula osteossarcoma intratibial foi desenvolvido com sucesso. A Figura 3A mostra um rolamento ortotópico representativo (primário) osteossarcoma, e a Figura 3B mostra um representante isolado ortotópico (primári…

Discussion

A injeção ortotópica de células osteossarcoma é um modelo ideal para estudar a função e o mecanismo de fatores específicos na carcinogênese e desenvolvimento da osteossarcoma para avaliar a eficácia terapêutica. Para evitar diferenças no crescimento do tumor, a maioria das células de osteossarcoma ativas a 80%-90% confluentes com o mesmo número são cuidadosamente injetadas na tíbia de cada rato, e o tempo de experimentação celular é estritamente controlado sem afetar a viabilidade celular. Como as aglo…

Materials

Automatic cell counter	Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd	IC1000	Counting cells
Anesthesia machine	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	R500IP	The Equipment of Anesthesia mice
BALB/c athymic mice	Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd.	/	animal
Basement Membrane Matrix	Shanghai Uning Bioscience Technology Co., Ltd	356234, BD, Matrigel	re-suspende cells
Bioluminescence imaging system	Shanghai Baitai Technology Co., Ltd	Vieworks	tracking the tumor growth and pulmonary metastasis, if the injection cell is labeled by luciferase
Centrifuge tube (15 mL)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	430790, Corning	Centrifuge the cells
isoflurane	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	VETEASY	Anesthesia mice
MEM media	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	LM-E1141	Cell culture medium
Micro-volume syringe	Shanghai high pigeon industry and trade Co., Ltd	0-50 μL	Inject precise cells into the tibia
Phosphate-buffered saline	Beyotime Biotechnology	ST447	wash the human osteosarcoma cells
1ml syringes	Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd	20200411	drilling
143B cell line	ATCC	CRL-8303	osteosarcoma cell line
Trypsin (0.25%)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	25200056, Gibco	trypsin treatment of cells
Trypan blue	Beyotime Biotechnology	ST798	Staining cells to assess activity
vector (pLV-luciferase)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	VL3613	Plasmid
Lipofectamine 2000	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	11668027,Thermo fisher	Plasmid transfection reagent
X-ray imaging system	Brook (Beijing) Technology Co., Ltd	FX PRO	X-ray images were obtained to detect tumor growth