הפרוטוקול הנוכחי מתאר הזרקת תאי intratibia osteosarcoma כדי ליצור מודלים עכבר הנושאים אוסטאוסרקומה אורתוטופית ונגעים גרורות ריאתיות.
Osteosarcoma הוא סרטן העצם העיקרי הנפוץ ביותר אצל ילדים ומתבגרים, עם ריאות כאתר גרורתי הנפוץ ביותר. שיעור ההישרדות של חמש שנים של חולי אוסטאוסרקומה עם גרורות ריאתיות הוא פחות מ -30%. לכן, השימוש של מודלים עכבר מחקה את התפתחות osteosarcoma בבני אדם הוא בעל משמעות רבה להבנת המנגנון הבסיסי של קרצינוגנזה osteosarcoma וגרורות ריאתי לפתח טיפוליים חדשניים. כאן, נהלים מפורטים מדווחים כדי ליצור את מודלים עכבר גרורות אוסטאוזרקומה ריאות העיקרי באמצעות הזרקת intratibia של תאי osteosarcoma. בשילוב עם bioluminescence או מערכת הדמיה חיה רנטגן, מודלים אלה עכבר חי מנוצלים כדי לפקח ולכמת את צמיחת osteosarcoma וגרורות. כדי להקים מודל זה, מטריצת קרום מרתף המכילה תאי osteosarcoma נטען במזרק מיקרו נפח והוזרק לתוך שוקה אחת של כל עכבר אתימי לאחר שהיה מורדם. העכברים הוקרבו כאשר האוסטאוסרקומה העיקרית הגיעה למגבלת הגודל בפרוטוקול שאושר על ידי IACUC. הרגליים הנושאות אוסטאוסרקומה והריאות עם נגעי גרורות הופרדו. מודלים אלה מאופיינים בתקופת דגירה קצרה, צמיחה מהירה, נגעים חמורים ורגישות בניטור התפתחות נגעים גרורתיים ראשוניים ובריאתיים. לכן, אלה הם מודלים אידיאליים לחקר הפונקציות והמנגנונים של גורמים ספציפיים אוסטאוסרקומה קרצינוגנזה וגרורות ריאתיות, מיקרו-סביבה של הגידול, והערכה של היעילות הטיפולית ב- vivo.
אוסטאוסרקומה היא סרטן העצמות העיקרי הנפוץ ביותר בקרב ילדים ומתבגרים 1,2, אשר בעיקר חודר לרקמה שמסביב, ואפילו גרורות לריאות כאשר החולים מאובחנים. גרורות ריאתיות הן האתגר העיקרי לטיפול באוסטיוסרקומה, ושיעור ההישרדות של חמש שנים של חולי אוסטאוסרקומה עם גרורות ריאתיות נשאר נמוך כמו 20%-30%-30%3,4,5. עם זאת, שיעור ההישרדות של חמש שנים של אוסטאוסרקומה ראשונית הוגדל לכ -70% מאז שנות השבעים עקב כניסתו של כימותרפיה6. לכן, יש צורך דחוף כדי להבין את המנגנון הבסיסי של אוסטאוסרקומה קרצינוגנזה וגרורות ריאתיות לפתח טיפולים חדשניים. היישום של מודלים עכבר המחקים בצורה הטובה ביותר את התקדמות osteosarcoma בבני אדם הוא בעל משמעות רבה7.
מודלים בעלי חיים osteosarcoma נוצרים על ידי ספונטני, המושרה הנדסה גנטית, השתלה, וטכניקות אחרות. מודל האוסטאוסרקומה הספונטני משמש לעתים רחוקות בשל זמן היווצרות הגידול הארוך, שיעור התרחשות הגידול הלא עקבי, תחלואה נמוכה ויציבות ירודה 8,9. למרות מודל osteosarcoma המושרה נגיש יותר להשיג מאשר osteosarcoma ספונטני, היישום של מודל osteosarcoma המושרה מוגבל כי הגורם המעורר ישפיע על microenvironment, הפתוגנזה, ואת המאפיינים הפתולוגיים של osteosarcoma10. מודלים מהונדסים עוזרים להבין את הפתוגנזה של סרטן שכן הם יכולים לדמות טוב יותר את הסביבות הפיזיולוגיות והפתולוגיות האנושיות; עם זאת, מודלים בעלי חיים מהונדסים יש גם את המגבלות שלהם בשל הקושי, לטווח ארוך, ועלות גבוהה של שינוי מהונדס. יתר על כן, אפילו במודלים המקובלים ביותר של בעלי חיים מהונדסים שנוצרו על ידי p53 ושינוי גנים Rb, רק 13.6% מהסרקומה התרחשה בארבע עצמות הגפיים11,12.
השתלה היא אחת השיטות הנפוצות ביותר לייצור מודלים גרורתיים גרורתיים ראשוניים ורחוקים בשנים האחרונות בשל התמרון הפשוט שלה, קצב היווצרות הגידול היציב והומוגניותטובה יותר 13. ההשתלה כוללת השתלה הטרוטופית והשתלות אורתוטופיות על פי אתרי ההשתלה. בהשתלה הטרוטופית של אוסטאוסרקומה, תאי האוסטאוסרקומה מוזרקים מחוץ לאתרי האוסטאוסרקומה העיקריים (עצם) של בעלי החיים, בדרך כלל מתחת לעור, תת עורית14. למרות ההשתלה ההטרוטופית היא פשוטה ללא צורך לבצע ניתוח בבעלי חיים, האתרים שבהם תאי osteosarcoma מוזרקים אינם מייצגים את המיקרו-סביבה של אוסטאוסרקומה אנושית בפועל. השתלה אורתוטופית אוסטאוסרקומה היא כאשר תאי האוסטאוסרקומה מוזרקים לעצמות של בעלי חיים, כגון שוקה15,16. בהשוואה לשתלים ההטרוטופיים, שתלי אוסטאוסרקומה אורתוטופיים מאופיינים בתקופת דגירה קצרה, צמיחה מהירה ואופי שוחק חזק; לכן, הם מודלים בעלי חיים אידיאליים עבור מחקרים הקשורים osteosarcoma17.
בעלי החיים הנפוצים ביותר הם עכברים, כלבים ודגי זברה18,19. המודל הספונטני של osteosarcoma משמש בדרך כלל בכלבים כי osteosarcoma הוא אחד הגידולים הנפוצים ביותר בכלבים. עם זאת, היישום של מודל זה מוגבל בגלל זמן היווצרות הגידול הארוך, שיעור הגידול הנמוך, הומוגניות ירודה ויציבות. דגי זברה משמשים לעתים קרובות לבניית מודלים מהונדסים או נוקאאוט גידול בגלל הרבייה המהירה שלהם20. אבל גנים של דגי זברה שונים מהגנים האנושיים, ולכן היישומים שלהם מוגבלים.
עבודה זו מתארת את ההליכים המפורטים, אמצעי זהירות, ותמונות מייצגות לייצור osteosarcoma העיקרי בשוקה עם גרורות ריאתי באמצעות הזרקת intratibia של תאי osteosarcoma בעכברים אתימיים. שיטה זו יושמה כדי ליצור את osteosarcoma העיקרי בשוקת העכבר להערכת יעילות טיפולית, אשר הראה רבייה גבוהה21,22.
הזרקה אורתוטופית של תאי אוסטאוסרקומה היא מודל אידיאלי לחקר הפונקציה והמנגנון של גורמים ספציפיים ב- osteosarcoma carcinogenesis ופיתוח כדי להעריך את היעילות הטיפולית. כדי למנוע הבדלים בצמיחת הגידול, רוב תאי האוסטאוסרקומה הפעילים ב 80%-90% במפגש עם אותו מספר מוזרקים בקפידה לתוך השוקה של כל עכבר, וזמן טריפ?…
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה נתמך על ידי מענקים מ(1) תוכנית מו”פ המפתח הלאומית של סין (2018YFC1704300 ו-2020YFE0201600), (2) הקרן הלאומית למדעי הטבע (81973877 ו-82174408).
Automatic cell counter | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Counting cells |
Anesthesia machine | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | R500IP | The Equipment of Anesthesia mice |
BALB/c athymic mice | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd. | / | animal |
Basement Membrane Matrix | Shanghai Uning Bioscience Technology Co., Ltd | 356234, BD, Matrigel | re-suspende cells |
Bioluminescence imaging system | Shanghai Baitai Technology Co., Ltd | Vieworks | tracking the tumor growth and pulmonary metastasis, if the injection cell is labeled by luciferase |
Centrifuge tube (15 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | Centrifuge the cells |
isoflurane | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | VETEASY | Anesthesia mice |
MEM media | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | LM-E1141 | Cell culture medium |
Micro-volume syringe | Shanghai high pigeon industry and trade Co., Ltd | 0-50 μL | Inject precise cells into the tibia |
Phosphate-buffered saline | Beyotime Biotechnology | ST447 | wash the human osteosarcoma cells |
1ml syringes | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd | 20200411 | drilling |
143B cell line | ATCC | CRL-8303 | osteosarcoma cell line |
Trypsin (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | trypsin treatment of cells |
Trypan blue | Beyotime Biotechnology | ST798 | Staining cells to assess activity |
vector (pLV-luciferase) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | VL3613 | Plasmid |
Lipofectamine 2000 | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 11668027,Thermo fisher | Plasmid transfection reagent |
X-ray imaging system | Brook (Beijing) Technology Co., Ltd | FX PRO | X-ray images were obtained to detect tumor growth |