Injection intratibiale de cellules d’ostéosarcome pour générer des modèles murins d’ostéosarcome orthotopique et de métastases pulmonaires
Summary
Le présent protocole décrit l’injection intratibia de cellules d’ostéosarcome pour générer des modèles murins portant des lésions d’ostéosarcome orthotopique et de métastases pulmonaires.
Abstract
L’ostéosarcome est le cancer primitif des os le plus fréquent chez les enfants et les adolescents, les poumons étant le site métastatique le plus courant. Le taux de survie à cinq ans des patients atteints d’ostéosarcome présentant des métastases pulmonaires est inférieur à 30%. Par conséquent, l’utilisation de modèles murins imitant le développement de l’ostéosarcome chez l’homme est d’une grande importance pour comprendre le mécanisme fondamental de la cancérogenèse de l’ostéosarcome et des métastases pulmonaires afin de développer de nouvelles thérapies. Ici, des procédures détaillées sont rapportées pour générer les modèles murins primaires d’ostéosarcome et de métastases pulmonaires par injection intratibia de cellules d’ostéosarcome. Combinés au système d’imagerie en direct par bioluminescence ou rayons X, ces modèles murins vivants sont utilisés pour surveiller et quantifier la croissance et les métastases de l’ostéosarcome. Pour établir ce modèle, une matrice de membrane basale contenant des cellules d’ostéosarcome a été chargée dans une seringue à micro-volume et injectée dans un tibia de chaque souris atymique après avoir été anesthésiée. Les souris ont été sacrifiées lorsque l’ostéosarcome primaire a atteint la limite de taille dans le protocole approuvé par l’IACUC. Les jambes porteuses d’ostéosarcome et les poumons présentant des lésions de métastases ont été séparés. Ces modèles se caractérisent par une courte période d’incubation, une croissance rapide, des lésions sévères et une sensibilité dans la surveillance du développement des lésions métastatiques primaires et pulmonaires. Par conséquent, ce sont des modèles idéaux pour explorer les fonctions et les mécanismes de facteurs spécifiques dans la cancérogenèse de l’ostéosarcome et les métastases pulmonaires, le microenvironnement tumoral et évaluer l’efficacité thérapeutique in vivo.
Introduction
L’ostéosarcome est le cancer primitif des os le plus fréquent chez les enfants et les adolescents 1,2, qui s’infiltre principalement dans les tissus environnants et même métastase dans les poumons lorsque les patients sont diagnostiqués. Les métastases pulmonaires sont le principal défi pour le traitement de l’ostéosarcome, et le taux de survie à cinq ans des patients atteints d’ostéosarcome atteints de métastases pulmonaires reste aussi bas que 20% -30%3,4,5. Cependant, le taux de survie à cinq ans de l’ostéosarcome primaire a été augmenté à environ 70% depuis les années 1970 en raison de l’introduction de la chimiothérapie6. Par conséquent, il est urgent de comprendre le mécanisme fondamental de la cancérogenèse de l’ostéosarcome et des métastases pulmonaires pour développer de nouvelles thérapies. L’application de modèles murins qui imitent le mieux la progression de l’ostéosarcome chez l’homme est d’une grande importance7.
Les modèles animaux d’ostéosarcome sont générés par le génie génétique spontané et induit, la transplantation et d’autres techniques. Le modèle d’ostéosarcome spontané est rarement utilisé en raison du long temps de formation de la tumeur, du taux d’occurrence tumorale incohérent, de la faible morbidité et de la faible stabilité 8,9. Bien que le modèle d’ostéosarcome induit soit plus accessible à obtenir que l’ostéosarcome spontané, l’application du modèle d’ostéosarcome induit est limitée car le facteur inducteur affectera le microenvironnement, la pathogenèse et les caractéristiques pathologiques de l’ostéosarcome10. Les modèles transgéniques aident à comprendre la pathogenèse des cancers puisqu’ils peuvent mieux simuler les environnements physiologiques et pathologiques humains; cependant, les modèles animaux transgéniques ont également leurs limites en raison de la difficulté, du long terme et du coût élevé de la modification transgénique. De plus, même dans les modèles animaux transgéniques les plus largement acceptés générés par la modification du gène p53 et Rb, seulement 13,6% du sarcome s’est produit dans les quatre os des membres11,12.
La transplantation est l’une des méthodes de production de modèles de cancer métastatique primaire et distant les plus couramment utilisées ces dernières années en raison de sa manœuvre simple, de son taux de formation de tumeurs stable et de sa meilleure homogénéité13. La transplantation comprend la transplantation hétérotopique et la transplantation orthotopique selon les sites de transplantation. Dans la transplantation hétérotopique d’ostéosarcome, les cellules d’ostéosarcome sont injectées à l’extérieur des sites primaires d’ostéosarcome (os) des animaux, généralement sous la peau, par voie sous-cutanée14. Bien que la transplantation hétérotopique soit simple sans qu’il soit nécessaire d’effectuer une intervention chirurgicale chez les animaux, les sites où les cellules d’ostéosarcome sont injectées ne représentent pas le microenvironnement réel de l’ostéosarcome humain. La transplantation orthotopique d’ostéosarcome se produit lorsque les cellules de l’ostéosarcome sont injectées dans les os des animaux, tels que le tibia15,16. Par rapport aux greffes hétérotopiques, les greffes d’ostéosarcome orthotopique se caractérisent par une courte période d’incubation, une croissance rapide et une forte nature érosive; par conséquent, ce sont des modèles animaux idéaux pour les études liées à l’ostéosarcome17.
Les animaux les plus couramment utilisés sont les souris, les chiens et les poissons-zèbres18,19. Le modèle spontané de l’ostéosarcome est généralement utilisé chez les chiens, car l’ostéosarcome est l’une des tumeurs les plus courantes chez les chiens. Cependant, l’application de ce modèle est limitée en raison du long temps de formation de la tumeur, du faible taux de tumorigenèse, de la faible homogénéité et de la stabilité. Les poissons-zèbres sont souvent utilisés pour construire des modèles tumoraux transgéniques ou knockout en raison de leur reproduction rapide20. Mais les gènes du poisson-zèbre sont différents des gènes humains, de sorte que leurs applications sont limitées.
Ce travail décrit les procédures détaillées, les précautions et les images représentatives pour produire l’ostéosarcome primaire dans le tibia avec métastases pulmonaires par injection intratibia de cellules d’ostéosarcome chez des souris atymiques. Cette méthode a été appliquée pour créer l’ostéosarcome primaire dans le tibia de la souris pour l’évaluation de l’efficacité thérapeutique, qui a montré une reproductibilité élevée21,22.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’injection orthotopique de cellules d’ostéosarcome est un modèle idéal pour étudier la fonction et le mécanisme de facteurs spécifiques dans la cancérogenèse et le développement de l’ostéosarcome afin d’évaluer l’efficacité thérapeutique. Pour éviter les différences dans la croissance tumorale, la plupart des cellules actives d’ostéosarcome à 80% -90% confluent avec le même nombre sont soigneusement injectées dans le tibia de chaque souris, et le temps de trypsinisation cellulaire est stri…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été soutenue par des subventions de (1) National Key R&D Program of China (2018YFC1704300 et 2020YFE0201600), (2) National Nature Science Foundation (81973877 et 82174408).
Materials
| Automatic cell counter | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Counting cells |
| Anesthesia machine | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | R500IP | The Equipment of Anesthesia mice |
| BALB/c athymic mice | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd. | / | animal |
| Basement Membrane Matrix | Shanghai Uning Bioscience Technology Co., Ltd | 356234, BD, Matrigel | re-suspende cells |
| Bioluminescence imaging system | Shanghai Baitai Technology Co., Ltd | Vieworks | tracking the tumor growth and pulmonary metastasis, if the injection cell is labeled by luciferase |
| Centrifuge tube (15 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | Centrifuge the cells |
| isoflurane | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | VETEASY | Anesthesia mice |
| MEM media | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | LM-E1141 | Cell culture medium |
| Micro-volume syringe | Shanghai high pigeon industry and trade Co., Ltd | 0-50 μL | Inject precise cells into the tibia |
| Phosphate-buffered saline | Beyotime Biotechnology | ST447 | wash the human osteosarcoma cells |
| 1ml syringes | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd | 20200411 | drilling |
| 143B cell line | ATCC | CRL-8303 | osteosarcoma cell line |
| Trypsin (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | trypsin treatment of cells |
| Trypan blue | Beyotime Biotechnology | ST798 | Staining cells to assess activity |
| vector (pLV-luciferase) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | VL3613 | Plasmid |
| Lipofectamine 2000 | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 11668027,Thermo fisher | Plasmid transfection reagent |
| X-ray imaging system | Brook (Beijing) Technology Co., Ltd | FX PRO | X-ray images were obtained to detect tumor growth |
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