Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

İnsan Kan-Beyin Bariyerini Modelleyen Üçlü Kültür Hücre Sistemi

Published: November 30, 2021 doi: 10.3791/63134
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 3, 3, 3, 2, 1, 1, 1
1Univ. Artois, UR 2465, Laboratoire de la Barrière Hémato-Encéphalique (LBHE), 2Queen Mary University of London, Department of Chemistry, 3Yamaguchi University Graduate School of Medicine, Department of Neurology and Clinical Neuroscience
* These authors contributed equally

Summary

Bu protokol, in vitro model bir insan kan-beyin bariyeri (BBB) oluşturmak için bir yöntem açıklar. Endotel hücreleri ve perisitler bir kesici uç filtrenin (kan bölmesi) her iki tarafına ekilir ve astrositler alt kuyucuğa (beyin bölmesi) ekilir. Karakterize edilen model, nanopartikül taşıma deneyleri için kullanılmıştır.

Abstract

İlaçların beyne verilmesi, beyin parankimine erişimi kontrol eden ve kısıtlayan kan-beyin bariyerinin (BBB) son derece spesifik ve kısıtlayıcı özellikleri nedeniyle bir zorluk olmaya devam etmektedir. Bununla birlikte, nanoteknolojilerin gelişmesiyle birlikte, ilaç dağıtımını iyileştirmek için yeni nanomalzemelerden oluşan büyük paneller geliştirildi ve klinik öncesi tahliller çerçevesinde beyin penetrasyonunu tahmin etmek için güvenilir in vitro mikrosistemlere duyulan ihtiyacı vurguladı. İşte BBB'yi yalnızca insan hücrelerini kullanarak modellemek için mikrofizyolojik bir sistem kurmak için basit bir yöntem. Konfigürasyonunda, model, beyin benzeri endotel hücreleri (BLEC'ler), perisitler ve astrositler, BBB özelliklerini sıkılaştırma bileşiklerine ihtiyaç duymadan daha fizyolojik bir şekilde indüklemek ve düzenlemek için gerekli üç ana BBB hücresel aktörü içeren üçlü bir kültürden oluşur. 6 günlük üçlü kültürden sonra hazır olan 12 delikli plaka formatında geliştirilen model, fiziksel özellikler, gen ve protein ifadelerinde karakterize edilir ve polimerik nanojel taşıma ölçümü için kullanılır. Model, sağlıklı ve patolojik koşullarda çok çeşitli deneyler için kullanılabilir ve molekül ve parçacık taşımacılığının klinik öncesi değerlendirmelerinin yanı sıra hücreler arası ve hücre içi kaçakçılık için değerli bir araçtır.

Introduction

Beyin kılcal endotel hücreleri (ECs) düzeyinde lokalize olan BBB, beyin homeostazını ve sinir hücrelerinin işlevini korumak için çok önemli olan beyin parankimine erişimi kontrol eder ve düzenler 1,2. Bununla birlikte, beyin patolojisi durumunda, beyin parankimine erişim eksikliği, terapötik stratejilerin geliştirilmesinde gerçek bir engel teşkil etmektedir.

BBB ECs, hücreler arası alanı kapatan, hücreler arası yolu 1,2,3 kontrol eden bir efflux pompaları, spesifik taşıyıcılar ve reseptörler sistemi ile ilişkili sıkı bağlantı (TJ) proteinleri de dahil olmak üzere karmaşık bir dizi özelliğe sahiptir. Dahası, tüm bu özellikler, BBB EC bazal membranına gömülü perisitler ve uç ayakları beyin kılcal damarlarını çevreleyen astrositlerle iletişim sayesinde indüklenir ve korunur 1,2,3. Bu nedenle, BBB'nin in vitro olarak incelenmesi, mimarisinin karmaşıklığı ve nörovasküler birimi (NVU) oluşturan farklı hücre tipleri arasındaki iletişim göz önüne alındığında bir zorluktur2. Dahası, farklı hücre tipleri BBB özelliklerinin indüksiyonu ve bakımı için çok önemlidir ve sonuç olarak BBB'den geçişin tahminini etkiler. Beyne ilaç dağıtımı için farklı stratejiler, BBB kısıtlı özelliklerini atlamak için büyük bir taktik paneli kullanılarak test edildi4. Daha yakın zamanlarda, nanoteknolojilerin ilerlemesiyle birlikte, ilaç taşıyıcıları 5,6 gibi uygulamalar için yeni malzemeler geliştirilmektedir. Daha yüksek yüklerine, azaltılmış toksisitelerine ve artan ilaçların biyoyararlanımına ek olarak, bu yeni nanomalzemeler, BBB'yi geçmek ve özellikle parankimdeki hücreleri hedeflemek için bir Truva atı stratejisi için işlevselleştirilebilir 5,6. Değerlendirilen farklı nanomalzeme türleri arasında, nanojeller, esas olarak kolloidal özellikleri ve kimyasal yapıyı uyaranlara duyarlı özellikleri 7,8,9,10,11,12,13,14,15 tanıtmak için uyarlama yetenekleri nedeniyle oldukça dikkat çekmiştir.

İn vitro modeller, ilaçların beyin penetrasyonunu tahmin etmek için insan hücrelerini kullanan preklinik çalışmalar için geliştirilmiştir16. Bu modellerin farklı ayarları mevcuttur, beyin EC'lerinin tek katmanlarından çoklu hücre sistemlerine kadar16. NVU hücrelerinin BBB indüksiyonu ve bakımındaki önemi ve patolojik ortama koordineli yanıt göz önüne alındığında, BBB in vitro modellerinin,tahminin alaka düzeyini artırmak için tüm bu kahramanları göz önünde bulundurması gerekir 2,17.

Mevcut yöntem, belirli hücresel ve insan moleküler mekanizmalarını incelemek için insan hücreleriyle tamamen geliştirilen insan BBB'sinin üçlü bir kültür in vitro modelinin kurulmasını açıklamaktadır. Fizyolojik olarak alakalı olmak için, model, BBB özelliklerini indüklemek ve sürdürmek için gerekli olan BBB'nin ana üç hücresel aktöründen (ECs, perisitler ve astrositler), sıkılaştırıcı bileşikler kullanılmadan ve in vitro BBB model16,18 olarak kabul edilmesi gereken bir dizi özellik göstermeden oluşur. Model, beyin penetrasyonunu tahmin etmek için ilaç ve parçacık taşımacılığının klinik öncesi çalışmaları için uygun, kan ve beyin bölmesini sınırlayan bir konfigürasyonda kurulmuştur. Modelin kullanışlılığı, polimerik nanojellerin taşınmasını ölçerek gösterilmiştir.

Protocol

Protokol, Fransız Yüksek Öğretim ve Araştırma Bakanlığı (referans: CODECOH DC2011-1321) ve yerel araştırma inceleme kurulu (Béthune Doğum Hastanesi, Beuvry, Fransa) tarafından onaylanmıştır. Endotel hücrelerinin (ECs) elde edilmesi için, Fransız Mevzuatına uygun olarak, göbek kordon kanı toplamak için donörün ebeveynlerinden yazılı ve bilgilendirilmiş onam alınmıştır. Perisitler, Referans19'a göre izole edilen Profesör Takashi Kanda (Yamaguchi Üniversitesi Tıp Enstitüsü, Ube, Japonya) tarafından Nöroloji ve Klinik Sinirbilim Bölümü) tarafından sağlanmaktadır. Birincil insan beyni korteks astrositleri ticari bir sağlayıcıdan satın alınır (bakınız Malzeme Tablosu).

1. Hücre kültürü

  1. Endotel hücrelerinin kültürlenmesi
    NOT: Endotel hücreleri (ECs), Pedroso ve ark.20 tarafından açıklanan yönteme göre, insan göbek kordon kanından izole edilen CD34 + hematopoetik kök hücrelerden türetilmiştir. ECS'nin endotel fenotipi Pedroso ve ark.20'de tanımlanmıştır.
    1. İnsan EC'lerini, fetal buzağı serumunun% 5'i (FCS),% 0.5'i gentamisin ve% 1'i endotel hücresi büyüme takviyesi (ECM) ile desteklenmiş endotel hücre ortamı kullanarak geliştirin (bkz.
    2. Alt kültürleme EC'leri için, modelin ayarlanmasından iki gün önce, bir tabağı 37 ° C'de 15 dakika boyunca 10 mL% 2 jelatin ile kaplayın ve ardından 20 mL sıcak ECM ile değiştirin. Önceden kaplanmış hücre kültürü kabında 1 milyon hücre içeren bir şişe EC'yi (hücreler, hücre donmadan önce adım 2.3.3'te açıklandığı gibi manuel olarak sayılmıştır) çözün.
    3. 37 ° C'de 3 saat sonra, ortamı yenileyin ve trikültürün nemlendirilmiş bir atmosferde% 5 CO 2 ve%21 O2 altında 37 ° C'de bir inkübatörün içinde ayarlanana kadar hücreleri koruyun.
  2. Perisitlerin kültürlenmesi
    NOT: Perisitler, Shimizu ve ark.19 tarafından yayınlanan protokole göre insan beyninden izole edilir, izolasyon prosedürü Kanda ve ark.21 tarafından modifikasyonlarla yayınlanan yöntemi izler.
    1. Dulbecco'nun 4.5 g / L glikoz (DMEM HG), FCS'nin% 10'u,% 1 de penisilin / streptomisin ve% 1 L-glutamin ile desteklenmiş modifiye Eagle ortamını kullanarak perisitleri yetiştirin (bkz.
    2. Perisit alt kültürlemesi için, modelin ayarlanmasından beş gün önce, oda sıcaklığında (RT) 1 saat boyunca 0.02 N asetik asit içinde 8 mL / çanak 100 μg / mL kollajen tip I çözeltisi ile iki kabı kaplayın ve ardından RT DMEM HG ile iki kez yıkayın. 10 mL ılık ortam içeren konik bir tüp içinde 1 milyon hücre içeren bir şişe perisiti çözün ve süspansiyonu 20 ° C'de 190 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj edin.
    3. Peleti 10 mL ılık ortamda ve tohumu 15 mL ılık ortam / tabak ile önceden doldurulmuş önceden kaplanmış hücre kültürü kaplarında yeniden askıya alın. Ortam 3 gün sonra yenilenir ve hücreler, trikültürün nemlendirilmiş bir inkübatörde% 5 CO 2 ve%21 O2 altında 37 ° C'de ayarlanmasına kadarkorunur.
  3. Astrositlerin kültürlenmesi
    1. Astrositleri, FCS'nin% 20'si, astrosit büyüme takviyesinin% 1'i ve% 1'i penisilin / streptomisin çözeltisi () ile desteklenmiş bir astrosit ortamı kullanarak yetiştirin (bkz.
    2. Astrositlerin alt kültürlenmesi için, modelin ayarlanmasından bir hafta önce, bir T75 hücre kültürü şişesini 37 ° C'de 1 saat boyunca 10 mL 2 μg /cm2 poli-L-lizin (PLL) ile kaplayın ve RT steril suyla iki kez yıkayın. 20 mL ılık ortamda 1 milyon hücre içeren bir şişe astrositi ve önceden kaplanmış T75 hücre kültürü şişesinde tohumu çözün.
      NOT: Ticari olarak elde edilen hücre şişeleri ~ 1 milyon hücrenin varlığını doğrulamaktadır, bu nedenle hücrelerin sayımı burada yapılmamıştır.
    3. Hücreleri nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de% 5 CO 2 ve%21 O2 altında tutun. Ortam 24 saat sonra ve daha sonra trikültürün ayarlanmasına kadar her 2 günde bir yenilenir.

2. Üçlü kültür modeli ayarı

NOT: Üç hücre tipinin montajı aynı gün içinde gerçekleştirilir. Trikültürün ayarlanmasından bir gün önce, geri döndürülmüş kesici uç filtreler üzerinde kollajen tip I kaplamayı gerçekleştirin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve astrositleri 12 kuyucuklu bir plakanın PLL ön kaplamalı kuyucuklarına tohumlayın.

  1. Astrositlerin kuyulara ekilmesi
    1. Kuyucukları, adım 1.3.2'de açıklandığı gibi 500 μL 2 μg/cm2 PLL çözeltisi ile kaplayın.
    2. Hücreleri 10 mL ılık fosfat tampon salin - kalsiyum ve magnezyum içermeyen 1X (1X PBS-CMF) (tablo 1) ile bir kez yıkayın, ardından 10 mL sıcak% 20 tripsin / EDTA (T / E) çözeltisi ile 37 ° C'de 3 dakika kuluçkaya yatırın ve hücreleri şişeden mekanik olarak ayırın. Süspansiyonu, 5 mL sıcak seyreltilmemiş FCS içeren konik bir tüpe aktarın.
      NOT: Sağlayıcının protokol22'sine göre, astrositlerin toplanması, şişeyi inkübatöre 1 dakika boyunca yerleştirerek ve ayrılmanın tamamlanmasına yardımcı olmak için şişeye dokunarak optimize edilebilir. Kalan hücreler 5 mL T/E nötralizasyon çözeltisi ile toplanmalı ve FCS içeren konik tüpe yerleştirilmelidir.
    3. Süspansiyonu 190 x g'de 20 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
    4. Hücre peletini 5 mL ılık'de yeniden askıya alın. Mikroskop altında manuel bir sayma odası kullanarak hücre süspansiyonunun 20 μL'sini 80 μL 1X PBS-CMF'de seyrelterek hücreleri sayın (bkz. Her PLL'de yaklaşık 40.000 hücre /cm2 plaka, 1.5 mL sıcak hacminde önceden kaplanmış kuyuda.
  2. Geri döndürülen kesici uç filtrelerde perisitlerin tohumlanması
    1. Geri döndürülmüş kesici uç filtrelerine, steril cımbız kullanılarak 25 mm yüksekliğinde kapalı bir kabın çevresine yerleştirilmiş 250 μL kollajen tip I çözeltisi (100 μg/mL) ekleyin. Steril koşullar altında kaplamayı RT'de 1 saat bekletin.
      NOT: Kullanılan çanağın, davlumbazın dışındayken sterilitenin korunmasını sağlamak ve geri döndürülen filtredeki çözeltiler ile kabın kapağı arasındaki teması önlemek için yeterince yüksek olması gerekir.
    2. Kollajen tip I solüsyonunu, aspirasyon sistemine bağlı bir cam pipetle dikkatlice çıkarın. 250 μL RT DMEM HG ile iki kez yıkayın ve ardından tüm çözeltiyi kesici uç filtrelerinden dikkatlice çıkarın. Kaplanmış kesici uç filtreleri, hücrelerin tohumlanmasına kadar steril koşullar altında RT'de bırakın.
      NOT: Kaplama prosedürü sırasında, membran hasarını önlemek için filtreye dokunmamaya dikkat edin. Kollajen tip I ile kaplandıktan sonra, kesici uç filtreleri RT'de gece boyunca saklanabilir.
    3. Trikültür ayarının yapıldığı gün, perisitleri 10 mL ılık 1X PBS-CMF ile iki kez yıkayın ve hücreleri 2 mL ılık tripsin ile inkübe edin. Mikroskop altındaki hücreleri gözlemleyerek tripsinin etkisini izleyin. Hücreler ayrılmaya başladığında, tripsini çıkarın ve mekanik ayrışmadan önce 5 mL sıcak ECM ekleyin.
    4. Mikroskop altında manuel bir sayım odası kullanarak hücre süspansiyonunun 20 μL'sini 80 μL 1X PBS-CMF'de seyrelterek hücreleri sayın ve önceden kaplanmış geri döndürülmüş kesici uç filtrelere250 μL'lik bir hacimde 44.500 hücre/cm2 tohumlayın.
    5. 1,5 mL sıcak ECM/kuyucuk içeren 12 delikli bir plakada steril cımbız kullanarak kesici uç filtrelerini dikkatlice geri döndürün. Kesici uç filtreleri artık diğer taraftan kaplanmaya hazırdır.
  3. Endotel hücrelerinin kesici uç filtreler üzerine tohumlanması
    1. Kesici uç filtrelerinin üst tarafını 500 μL hücre dışı matris bazlı hidrojel (1/48 v/v) ile kaplayın (bkz. 1 saat sonra, nemlendirilmiş bir inkübatörde% 5 CO 2 ve%21 O2 altında 37 °C'de, 500 μL RT DMEM HG ile bir kez yıkayın.
    2. 10 mL ılık 1X PBS-CMF ile bir kez yıkayın ve hücreleri 2 mL ılık tripsin ile inkübe edin. Hücreler ayrılmaya başladığında, tripsini çıkarın ve mekanik ayrışmadan önce 5 mL sıcak ECM ekleyin.
    3. Mikroskop altında manuel bir sayım odası kullanarak hücre süspansiyonunun 20 μL'sini 80 μL 1X PBS-CMF'de seyrelterek hücreleri sayın ve ECs'yi 500 μL sıcak ECM hacminde önceden kaplanmış kesici uç filtreler üzerinde 71.500 hücre/cm2 yoğunlukta tohumlayın.
    4. 'yi 1,5 mL sıcak ECM/kuyucuk ile değiştirin ve ardından tohumlanmış kesici uç filtrelerini (ECs + perisitler) astrositleri içeren kuyucuklara aktarın.
    5. Trikültür hücre sistemlerini nemlendirilmiş bir inkübatöre 37 °C'de% 5 CO 2 ve%21 O2 altında yerleştirin.
  4. BBB özelliklerinin indüksiyonu için üçlü hücre kültürünün korunması
    NOT: ECs'deki BBB özelliklerinin indüksiyonu için 6 günlük üçlü kültür gereklidir.
    1. Ortamı 6. güne kadar her gün yenileyin, bir aspirasyon sistemine bağlı bir cam pipet kullanarak ortamı üst ve alt bölmeden dikkatlice çıkarın.
    2. Üst bölmede 500 μL ve alt bölmede 1,5 mL'lik bir hacimde sıcak ECM ile hızlı bir şekilde değiştirin ve hücreleri% 5 CO 2 ve%21 O2 altında 37 ° C'de nemlendirilmiş bir inkübatöre gerikoyun.

3. BBB fenotip doğrulaması

NOT: 6 günlük üçlü kültürden sonra, ECs'de BBB fenotipini indüklemek için gereken süre, insan BBB modeli deneyler için hazırdır. Beyin benzeri endotel hücrelerinin (BLEC'ler) fiziksel bütünlüğü, BBB bütünlük belirteçlerine geçirgenlik testi kullanılarak değerlendirilen TJ proteinlerinin immünofloresan boyaması ile görselleştirilir. BBB fenotip doğrulaması, Deligne ve ark.,23'te açıklanan prosedüre göre genler / proteinler ekspresyon analizi ve efflux pompaları işlevselliğini de içerir. Perisitler ve astrositler, Deligne ve ark.'da açıklanan prosedüre göre ilgili boyama belirteçleri tarafından görselleştirilir. 202023.

  1. İmmünofloresan boyama
    1. Kesici uç filtrelerini ve astrositleri buz gibi soğuk metanol/aseton (50/50 v/v) içinde 1 dakika sabitleyin ve RT 1X PBS-CMF ile iki kez yıkayın.
    2. Membranı bir neşter kullanarak keserek filtreyi kesici uçtan dikkatlice ayırın. Deligne ve ark.23'e göre membran ve alt kuyucuklar üzerinde immünositokimya yapın.
      NOT: Engelleme adımı için, RT'de 30 dakika boyunca 250 μL SEA BLOCK Engelleme tamponu kullanın (Malzeme Tablosuna bakın).
  2. BBB bütünlük testi
    1. BLEC'lerin fiziksel bütünlüğünü, Sodyum floresein (NaF) ve 20 kDa Dextran (FD20) gibi farklı moleküler ağırlıklara sahip BBB bütünlük belirteçlerini kullanarak bir geçirgenlik testi ile değerlendirin (bkz.
      NOT: Deney, Deligne ve ark.23'te açıklanan prosedüre göre gerçekleştirilebilir.
  3. Efflux pompa işlevselliği
    1. Bir P-gp ve BCRP inhibitörü olan Elacridar ile ve Elacridar olmadan Rhodamine 123'ün (R123) hücre içi birikimini ölçerek P-glikoprotein (P-gp) ve meme kanseri direnç proteininin (BCRP) işlevselliğini değerlendirin (bkz.
      NOT: Deney, Deligne ve ark.23'te açıklanan prosedüre göre gerçekleştirilebilir.
  4. Gen ve protein ifadeleri
    1. Hücrelerin soğuk Ringer HEPES (RH) (Tablo 1) ile hızlı bir yıkamadan sonra buz üzerinde gen ve protein örneği toplama işlemini gerçekleştirin. EC numune toplamadan önce, ters çevrilmiş kesici uç filtreleri20'den perisitleri kazıyın.

4. Nanojel taşıma

NOT: Polimerik nanojellerin (NG'ler) luminalden trikültür BLEC modelinin abluminal bölmesine geçişini tahmin etmek için, 6. günde 24 saat boyunca luminal bölmeye 0.1 mg / mL NG çözeltisi eklenmiştir. İncelenen NG'ler, ortalama 8-10 nm büyüklüğünde floresan olarak etiketlenmiş N-İzopropilakrilamit (NIPAM ) bazlı hidrojellerdi (bkz.

  1. Nanojel tozunu tartın ve ECM'de 1 mg / mL'lik bir konsantrasyonda çözündürün. Çözümü 10 dakika boyunca sonikleştirin ve 0.2 μm PTFE filtresi kullanarak filtreleyin.
    NOT: Deney günü yeni bir NG çözeltisi hazırlayın.
  2. Luminal bölmedeki ortamı değiştirin ve 0.1 mg / mL'lik son konsantrasyon için üst bölmeye 50 μL NG çözeltisi ekleyin.
    NOT: Orijinal çözeltiden 1:10'luk bir seyreltme gerçekleştirin.
  3. 24 saatlik inkübasyondan sonra, luminal (20 μL) ve abluminal (200 μL) bölmelerden alikotları toplayın ve bunları siyah bir 96 delikli plakaya yerleştirin.
  4. 477/540 nm'de uyarma/emisyon dalga boylarının ayarlanmasını kullanarak floresanı bir floresan çok plakalı okuyucu (bkz. Malzeme Tablosu) ile siyah 96 delikli bir plaka kullanarak ölçün. Zamanında eklenen ilk çalışma çözümüne atıfta bulunulan geçiş yüzdesini hesaplayın = 0 h (t0)6,15.
    NOT: 96 delikli plakayı floresan ölçümüne hazırlamak için, abluminal bölmeden 200 μL çözelti ve luminal bölmeden ve t0 preparasyonundan 20 μL çözelti ekleyin (200 μL'lik son hacme ulaşmak için 180 μL ECM ekleyin). Ayrıca bir kalibrasyon eğrisi ve okuma plakasına bir boşluk ekleyin. Enstrümantal parametreler: Algılama yöntemi - Floresan, Optik Konum - Üst, Okuma Tipi - Son nokta, Uyarma dalga boyu - 477 nm, Emisyon dalga boyu - 540 nm, Hassasiyet - 100, Sarsıntı - 5 s için Çift Orbital.

Representative Results

İnsan üçlü kültürü BBB modelinin ayarlanması
İnsan BBB in vitro modelinin ayarlanması için gerekli protokol Şekil 1'de açıklanmıştır ve sırasına kesinlikle uyulması gereken ardışık adımları içerir. İlk olarak, üç hücre tipi, bir kesici uç filtre sistemine monte edilmeden önce hücre kültürü kaplarında (Şekil 1A) ayrı ayrı yetiştirilir. Üçlü kültür ayarı, ilk hücre tipi olan astrositlerin önceden kaplanmış alt kuyuya tohumlanmasıyla başlar. Ertesi gün, perisitler ve EC'ler sırasıyla kesici uç filtresinin önceden kaplanmış abluminal ve luminal yüzeylerine tohumlanır. Kesici uç filtresi daha sonra astrositlerin üzerine aktarılır. Model, ECs'deki BBB özelliklerini indüklemek için gereken süre olan 6 gün boyunca kültürde tutulur ve patentli ortak kültür modeli24'e göre her geçen gün bir ortam yenilenir. EC'ler daha sonra BLEC'ler olarak yeniden adlandırılır (Şekil 1B).

İnsan BBB modelinin karakterizasyonu
Üçlü hücre kültürü modeli, bir dizi BBB'ye özgü özelliğin varlığı ile karakterize edilmiştir. Her şeyden önce, immünositokimya verileri, trombosit kaynaklı büyüme faktörü reseptörü β (PDGFR-β) 25,26 ve perisitler için desmin ve astrositler için glial fibriler asidik protein (GFAP)26 gibi konvansiyonel belirteçlerin ekspresyonunu doğruladı (Şekil 2A). Bu nedenle, perisitler ve astrositlerle yapılan 6 günlük kültürden sonra, BLEC'lerin tek katmanı, VE-Kadherin'in yapışkan birleşim boyaması ile görselleştirilerek, hücre sınırlarında TJ proteinlerinin, Claudin-5 ve ZO-1'in sürekli bir lokalizasyonunu gösterir (Şekil 2A). TJ'lerin kurulumu, Şekil 2B'de gösterildiği gibi, düşük moleküler ağırlıklı BBB bütünlük belirteçleri, yani NaF (376 Da)16,27 ve yüksek moleküler ağırlık, yani FD20 (20 kDa)27 kullanılarak ölçülen düşük parasellüler geçirgenlik katsayıları ile ilişkilidir. Ölçülen değerler, ECs23,24,28'in tam kaynağını kullanan doğrulanmış BBB in vitro modellerle karşılaştırılabilir. Toplamda, bu sonuçlar, in vivo BBB'nin karakteristiği olan üçlü kültür BLEC monolayer'ın düşük parasellüler geçirgenliğini vurgulamaktadır. Ek olarak, BLEC'lerde R123 hücre içi birikim, efflux pompa inhibitörü Elacridar23,24'ün varlığında, yokluğu ile kontrol durumuna kıyasla anlamlı bir artış göstermiştir (Şekil 2C). Bu, BLEC'lerde aktif efflux pompa moleküllerinin, yani P-gp ve BCRP'nin varlığını gösterir.

BLEC'leri daha da karakterize etmek için, anahtar BBB özelliklerinin gen ekspresyonu ve protein seviyesi incelenmiştir (Şekil 3). Üçlü kültür modeli ile elde edilen veriler, kontrol modeli olarak kullanılan ECs ve perisitler24'ten oluşan doğrulanmış ve patentli ko-kültür modeli ile karşılaştırılmıştır. Astrositler, üçlü kültür modelinde ilk ko-kültür modeline eklenen üçüncü hücre tipini temsil eder. Bu nedenle, üçlü kültür BLEC'lerinin gen ekspresyon analizi (Şekil 3A), ko-kültür BLEC'leri ile karşılaştırıldığında, TJ proteinleri (claudin-5 ve zonula oklüdenleri-1) ve efflux pompaları (P-gp ve BCRP) gibi temel BBB özelliklerinin ekspresyonunun sürdürülmesini ve en çok çalışılan BBB taşıyıcılarının (glikoz taşıyıcı 1) ve reseptörlerin (transferrin reseptörü) yukarı regülasyonunu göstermiştir. Protein nicelleştirme verilerinin (Şekil 3B) transkripsiyonel sonuçlarla uyumlu olduğu bulunmuştur. Genel olarak, bu veriler, doğrulanmış ortak kültür modeline benzer şekilde üçlü kültür BLEC katmanında BBB özelliklerinin pozitif indüksiyonunu desteklemektedir. Toplamda, üçlü kültür modeli, in vitro mikrofizyolojik bir sistemin BBB'yi modellemesi için gerekli fiziksel ve metabolik özellikleri gösterir.

İlaç dağıtım stratejilerine uygulanabilirlik - nanojel taşınmasının ölçülmesi
Yeni beyin dağıtım stratejilerini incelemek için üçlü kültür modelini kullanma olasılığını değerlendirmek için, floresan etiketli NIPAM tabanlı nötr NG'lerin taşınması 6,15 olarak değerlendirildi. 0 zamanında, NG'ler luminal bölmeye 0.1 mg / mL'lik bir konsantrasyonda yerleştirildi (Şekil 4A). 24 saatlik inkübasyondan sonra, NG'lerin% 5.82'si abluminal bölmede bulundu (Şekil 4B), BLEC'leri geçme yeteneklerini kanıtladı.

Sonuçlar, bütünlük belirteçlerinde açıklandığı gibi küçük ve büyük bileşiklerin geçirgenliğini ölçmek ve polimerik NG'ler gibi nanomalzemelerin taşınmasını değerlendirmek için modelin uygunluğunu göstermektedir.

Figure 1
Şekil 1: İnsan BBB'sinin in vitro üçlü kültür modelinin ayarlanması için kritik adımların temsili. (A) BBB modelinin üç hücre bileşeninin faz-kontrast görüntüleri: endotel hücreleri (EC), perisitler (PC) ve astrositler (AC). Ölçek çubuğu = 250 μm. (B) Üçlü kültür insan BBB in vitro modelinin ayarlanması için şematik ve açıklayıcı zaman çizelgesi. Vurgulanan kutu, ters çevrilmiş kesici uç filtresinin kaplama prosedürünü temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Üçlü kültür BBB modelinin özelliklerinin değerlendirilmesi. (A) BLEC'ler (Claudin-5: CLD5, Zona Occludens-1: ZO1 ve VE-Cadherin: Ve-Cadh), perisitler (Trombosit Kaynaklı Büyüme Faktörü Reseptörü-β: PDGFR-β ve desmin) ve astrositler (Glial Fibriler Asidik Protein: GFAP) için ayırt edici belirteçlerin temsili immünoboyama görüntüleri. Ölçek çubuğu = 10 μm. (B) BLEC'lerin floresan BBB bütünlük belirteçlerine, Sodyum Floreseine (NaF, 376 Da, Pe: 0,61 ± 0,062) ve FITC-Dextran'a (FD20, 20 kDa, Pe: 0,04 ± 0,005) parasellüler geçirgenliği. N = 3; n = 9. ECS'de SEM (C) P-gp ve BCRP işlevselliğinin ortalama ±, hücre içi R123'ün Elacridar ile (% 124.2 ±% 3.39) ve Elacridar olmadan (% 100 ±% 8.79) ölçülmesiyle değerlendirildi. N = 4; n = 12. Ortalama ± SEM. p = eşlenmemiş bir t-testi kullanılarak 0.017. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Üçlü kültür modelinde ayırt edici belirteçlerin BLEC gen ekspresyonu ve protein düzeyinin ko-kültür BBB modeline göre değerlendirilmesi. (A) RPLP0 ekspresyonu ile normalleştirilen sıkı bağlantı proteinlerinin (Claudin-5: CLD5 ve Zona Occludens-1: ZO1), taşıyıcıların (Glikoz Taşıyıcı-1: GLUT1, P-glikoprotein: PGP ve Meme Kanseri Direnç Proteini: BCRP) ve büyük molekül reseptörlerinin (Transferrin Reseptörü: TRFR) gen ekspresyonu. N = 3; n = 9. (B) β-aktin ekspresyonu ile normalleştirilen sıkı bağlantı proteinlerinin (CLD5 ve ZO1), taşıyıcıların (GLUT1, PGP ve BCRP) ve büyük molekül reseptörlerinin (TRFR) protein seviyesi. N = 3; n = 9. Sem'± ortalama. (A) ve (B) için, değerler>1, üçlü kültür modelinde daha yüksek gen ekspresyonuna veya protein seviyelerine karşılık gelir. Kırmızı çizgi, iki modelin ekspresyon seviyesinin (genler veya proteinler) eşdeğer olduğu 1 değerine karşılık gelir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Üçlü kültür modelinde nanojel taşınmasının ölçülmesi. (A) Nanojel taşıma testinin şematik gösterimi. (B) Üçlü kültür modelinde 24 saatlik inkübasyondan sonra nanojel taşıma yüzdesi (% 5.82 ±% 0.09). N = 2; n = 6. Ortalama ± SEM. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Arabelleğin adı Kompozisyon Not
Moleküler Ağırlık
Fosfat Tampon Salin, Kalsiyum Magnezyum İçermez PBS-CMF Arjantin 8 g/L 58.4 Tüm bileşiği steril suya ekleyin ve tam çözünmeyi bekleyin. Elde edilen çözeltinin pH'ı 7.3-7.4 aralığında olmalıdır. 0,22 μm'lik bir membran kullanarak çözeltiyi filtlatın ve steril çözeltiyi 4 °C'de saklayın.
Kartal 0,2 g/B 74.55
KH2PO4 0,2 g/B 136.09
NaHPO4-12 H2O 2,87 g/L 358.14
Su
Zil HEPES RH Arjantin 8,8 g/L 58.4 Tüm bileşiği steril suya ekleyin ve tam çözünmeyi bekleyin. PH'ı 7,4'e ayarlayın (başlangıç çözeltisi pH'ı 6,8 civarındadır). 0,22 μm'lik bir membran kullanarak çözeltiyi filtlatın ve steril çözeltiyi 4 °C'de saklayın.
Kartal 0.387 g/L 74.55
CaCl2 0,244 g/L 110.99
MgCl 2 6H2 O 0.0406 g/L 203.3
NaHCO3 0,504 g/L 84.1
HEPES 1,19 g/L 238.3
Glikoz 0,504 g/L 180.16
Su

Tablo 1: Protokolde kullanılan farklı tamponların bileşimi.

Discussion

Beyin hastalıklarının tedavisi, ilaçların beyin parankimindeki hücresel ve moleküler hedeflerine ulaşmak için BBB'yi engelleme zorluğu göz önüne alındığında bir zorluk olmaya devam etmektedir.

Beyin hastalıkları için ilaç geliştirme şu anda düşük bir başarı oranı sergilemektedir, çünkü klinik öncesi modellerde umut verici sonuçlar veren ilaçların çoğu klinikte kullanıldığında herhangi bir fayda göstermemektedir. Deney için kullanılan hayvan sayısını azaltmayı amaçlayan "3R kuralını" takiben, beyin patolojilerini incelemek ve ilaçların beyin penetrasyonunu tahmin etmek için BBB'nin in vitro modelleri geliştirilmiştir29. BBB'nin in vitro modelleri esas olarak hayvan hücreleri kullanılarak geliştirilmiştir ve elde edilen sonuçların alaka düzeyini artırmak için daha sofistike hale gelmiştir16. İnsan hücrelerinin kullanımındaki önemli gelişmelerden biri, insan hastalık mekanizmalarını incelemek için hücresel ve moleküler düzeylerde inkar edilemez yeni bir anlayış ve daha fazla özgüllük getiriyor16. Bununla birlikte, ilgili modellerin geliştirilmesi, BBB in vitro model ayarlarının iyileştirilmesini ve hayvan modelleri sayesinde ortaya çıkan bilginin dikkate alınmasını gerektirir. Bu nedenle, BBB mimarisinin karmaşıklığını ve BBB'yi fizyolojik ve patolojik koşullar altında incelemek için hücre-hücre iletişiminin önemini göz önünde bulundurması gerekir30.

Burada sunulan protokol, beyin dokusuna erişim sınırlaması olmaksızın, BBB'nin üç ana hücre tipini içeren tam bir insan BBB in vitro modeli kurmak için bir yöntem tanımlamaktadır. Çoklu hücre sistemi olarak, sıkma bileşiklerinin yapay kullanımı olmadan, ancak bunun yerine hücre-hücre iletişimi tarafından indüklenen BBB özelliklerinin indüksiyonu ve korunması, fizyolojik olarak daha alakalı ve BBB özelliklerinin in vivo indüksiyonu ile uyumludur31. Bu nedenle, protokolün kronolojisine saygı gösterilmesi, protokolün başarısı için çok önemlidir. Ayrıca, üçlü kültürün ayarlanması sırasında ve üç hücre tipi bir araya getirildikten sonra kuluçka süreleri, protokolün ana kritik adımlarını temsil eder.

EC'lerdeki BBB özellikleri, ortak kültür modeli24 için açıklandığı gibi, perisitlerle ortak kültür tarafından indüklenir. Bu nedenle, kesici uç filtresinin arka tarafındaki perisitlerin kültürü en kritik noktadır ve BBB özelliklerinin indüksiyonu için yeterli perisitlere sahip olmama riski altında protokolün sıkı bir şekilde takip edilmesini gerektirir. Her şeyden önce, kaplama prosedürü ve ayrıca hücre tohumlaması sırasında, filtrenin iyi bir şekilde kaplanmasını sağlamak ve hücreleri kaybetmemek için Petri kabının kapağının kaplama ile temas etmemesine ve ayrıca hücreler tohumlandıktan sonra ortama dikkat edilmelidir (adım 2.2.1 ve 2.2.4). Ayrıca, perisitler tohumlandıktan sonra, diğer taraftaki EC'lerin kaplanması ve tohumlanması için kesici uç filtresini geri döndürmeden önce perisitlerin bağlanması için belirtilen süreyi beklemek önemlidir (adım 2.2.4) (adım 2.2.5 ve 2.3). Tohumlandıktan sonra, hücre-hücre iletişimi yoluyla BBB özelliklerini indüklemek için altı gün gerekir (adım 2.4).

Model, sınırlı geçirgenlik açısından doğrulanmıştır (sıkı bağlantıların ayarlanmasıyla ilişkili), çünkü üçlü kültür modelinin EC'leri, doğrulanmış ortak kültür modeline benzer BBB bütünlük belirteçlerine geçirgenlik değerleri gösterir ve ayrıca doğrulanmış hayvan veya insan modellerinde ölçülür 16,27,32. Ayrıca, bir in vitro BBB modelinin doğrulanması, sınırlı geçirgenliğe ek olarak, NVU'nun diğer hücre tiplerine yanıt vermeyi ve fonksiyonel reseptörlerin ve taşıyıcıların ekspresyonunu gerektirir16. Ek olarak, model tekrarlanabilir ve bir hücre sıralama yöntemi gerektirmeden her hücre tipi üzerinde ayrı ayrı çok sayıda analiz (gen ve protein ekspresyonu, floresan boyama, toksisite testleri) gerçekleştirmek için birden fazla kesici uç filtresi ve kuyucuk üretir.

Model, kesici uç filtresinin her iki tarafında bir hücre tipine sahip olmak için 0,4 μm gözenek boyutunda bir filtre kullanılarak geliştirilmiştir. Kesici uç filtre sistemi, hücre-hücre iletişiminin fizyolojik koşullarda, iyi içeren astrositler üzerine aktarılarak incelenmesine izin verdi. Sistemdeki astrositlerin varlığı, in vitro model 24'teki ilk ortak kültüre kıyasla artı bir değeri temsil eder. Gerçekten de, astrositlerin BBB fizyolojisindeki önemi göz önüne alındığında, bu üçüncü hücre tipi, BBB içindeki hücre-hücre iletişiminin daha iyi anlaşılmasını sağlar. Ayrıca, üçlü hücre kültürü sistemi, astrositlerin önemli bir rol oynadığı inme gibi patolojik durumlarda da incelenebilir33,34,35. Ek olarak, kesici uç filtresinin her iki tarafındaki BLEC'lerin / perisitlerin tasarımı, beyin kanseri23 gibi patolojik durumları taklit etmek için diğer hücre tiplerine kolayca yerleştirilebilir.

Kesici uç filtresinin gözenek boyutu, BBB genelinde hücre geçişi gibi bazı deneylerle sınırlamalar getirebilir. Bununla birlikte, modelin daha büyük bir gözenek boyutuna sahip gelişimi, BBB36'yı taklit etmek için fizyolojik olarak ilgili olmayan çoklu katmanların değil, fizyolojik bir tek katmanlı ECs oluşumunun sağlanmasını sağlamak için protokolün uyarlanmasını gerektirir.

Modelin uygulanabilirliği, çok hücreli bir sistem kullanarak taşıma deneyi yapma olasılığını sergileyen NG'lerin taşıma deneyi kullanılarak gösterilmiştir. Bununla birlikte, taşıma deneyi için bir kontrol bileşiğine veya molekülüne sahip olmanın zorluklarının farkında olunmalı, her nanoyapı benzersiz bir özellik kümesi (moleküler ağırlık, yük, şekil, fiziksel özellikler, protein korona oluşumu) sergilediğinden, NG'lerle karşılaştırılabilir özellikleri paylaşmalıdır.

Modelin bir sınırlaması, EC'lerin farklılaşmasını ve TJ proteinlerinin ekspresyonunu etkilediği gösterilen kesme gerilmesinin olmamasıdır37. Bununla birlikte, beyin kılcal damarını taklit eden akışkan bir sistem geliştirmek, çoklu hücre sistemine belirli bir cihaz gerektiren akışkan bir parça eklemenin karmaşıklığı göz önüne alındığında zordur. Dahası, belirli bir cihaz genellikle ticari olarak temin edilemez ve birçok kopyaya izin vermez, böylece akışkan sistemleri yüksek verimli kullanım için daha az uyarlanmış hale getirir.

Özetle, insan hücrelerinden oluşan bu üçlü kültür sistemi, BBB'nin mimarisini in vitro olarak yeniden üretir. Bileşiklerin kapsamlı bir şekilde taranması için kullanılabilecek birçok kesici ucun üretilmesini sağlar.

Disclosures

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Acknowledgments

Bu çalışma, Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 araştırma ve inovasyon programı tarafından, Marie Skłodowska-Curie Yenilikçi Eğitim Ağı (ITN) (Fellowship Eleonora Rizzi) olan NANOSTEM projesinin bir parçası olarak, 764958 No'lu hibe anlaşması kapsamında verilmektedir. Bu çalışma 'Conseil régional du Nord-Pas-de-Calais' (Clémence Deligne Bursu), "Société Française de lutte contre les Cancers et les leucémies de l'Enfant et de l'adolescent" (SFCE), "l'étoile de Martin" Derneği ve Dernek"Cassandra contre la leucémie" tarafından verilmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Culture
Astocyte Medium (AM) ScienCell  1801
Astrocyte Growth Supplement ScienCell  1852 Astrocyte Growth Supplement is provided in the AM set.
Cell culture dish 100 mm Corning  430293 100 mm x 20 mm; dish used for the thawing of ECs and PCs before the triculture setting
Cell culture dish 150 mm Corning  430599 The height of these dishes (25 mm) allows the seeding of PCs in the reverted insert for the setting of the triculture model.
Collagen I  Corning 354236 Rat tail 
Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco 31600-083 Powder
Endothelial Cell Growth Supplement ScienCell  1051 Endothelial Cell Growth Supplement is provided in the ECM set.
Endothelial Cell Medium (ECM) ScienCell  1001
Fetal Calf Serum  Sigma F7524
Gelatin Sigma G2500 2% gelatin from porcine skin in PBS-CMF
Gentamicin BiochromA6 A-2712
Glucose Sigma G6152 Powder
Glutamine Merck 1002891000
Human Brain Cortex Astrocytes ScienCell  1800-SC
Malassez cell counting chamber vWR HECH40453702 The count was performed manually.
Matrigel Corning 354230 Extracellular matrix-based hydrogel
Penicillin/Streptomycin ScienCell  0503 Penicillin/Streptomycin solution is provided in the ECM and AM sets.
Poly-L-lysine ScienCell  0413
Steritop Millipore System SCGPT0SRE 0.22 µm pore size
Transwell insert  Corning 3401 0.4 µm pore polycarbonate filter 
Trypsin/EDTA neutralization solution ScienCell  0113
Trypsin/EDTA solution ScienCell  0103
Immunocytochemistry
SEA BLOCK blocking buffer ThermoScientific 37527
Alexa Fluor 568 anti-Mouse secondary antibody Thermofisher A11031 Dilution 1:500
Alexa Fluor 568 anti-Rabbit secondary antibody Thermofisher A11036 Dilution 1:500
Anti-Claudin-5 primary antibody InVitrogen 34-1600 Dilution 1:100
Anti-Desmin primary antibody Abcam ab6322 Dilution 1:200
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein primary antibody Dako Z0334 Dilution 1:500
Anti-Platelet-Derived Growth Factor-β primary antibody Abcam ab51090 Dilution 1:200
Anti-VE-cadherin primary antibody Abcam ab207732 Dilution 1:200
Anti-Zona Occludens-1 primary antibody InVitrogen 61-7300 Dilution 1:200
Normal Goat Serum Sigma G6767
ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI Invitrogen  P36962
Gene expression
NucleoSpin Rna/Protein Macherey Nagel Kit Macherey-Nagel 740,933,250
96 multiplate well Biorad HSP9601
iSCRIPT Biorad 1708841
Sealer sheet  Biorad MSB1001
SsoFast EvaGreen Supermix Biorad 172-5201
Protein expression
2x Laemli Sample Buffer Biorad 161-0737 Add 50 µL of bMercaptoetanol to 950 µL of Laemmli Buffer and store at -20°C. Dilute 1:1 with the protein sample for the assay.
Anti-Breast Cancer Resistance Protein primary antibody Abcam ab207732 Pre-treatment 15 minutes at RT under agitation; dilution 1:1000, O.N. at 4°C
Anti-Claudin-5 primary antibody Abcam ab15106 Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C
Anti-Glucose Transporter 1 primary antibody Millipore 07-1401 Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C
Anti-Mouse secondary antibody Dako P0447 Dilution 1:5000 in TBS-Tween
Anti-P-glycoprotein primary antibody Genetex GTX23364 Pre-treatment 15 minutes at RT under agitation; dilution 1:400, 3 hours at RT
Anti-Rabbit secondary antibody Dako P0448 Dilution 1:8000 in TBS-Tween
Anti-Transferrin Receptor primary antibody Abcam ab84036 Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C
Anti-Zona occludens-1 primary antibody Abcam ab216880 Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C
Criterion TGX Gel  Biorad 5678083
ECL Prime Solution Amersham  RPN2236 Revelation solution to keep in the dark
Phospatase inhibitor cocktail 2 Sigma P5726
Phospatase inhibitor cocktail 3 Sigma P0044
Protease Inhibitor Sigma P8340
Protein Standards Biorad 161-0373 Molecular weight markers
RIPA 10x Millipore 20-188
TBS 10x Biorad 1706435
TRIS-Glycine Biorad 1610771
Tween Biorad 1706531
BBB integrity assay
Sodium Fluorescein Ampresco 0681 λex= 490 nm; λem= 525 nm  
Elacridar Sigma SML0486 GF120918
FITC-Dextran 20 kDa Sigma FD-20S λex= 490 nm; λem=  525 nm  
Rhodamine 123 Sigma R8004 λex= 501 nm; λem= 538 nm  
SynergyTM H1  BioTek Instruments Fluorescent multiplate reader
Nanogel Transport
Syringe Terumo SS+01T1 1 mL syringe 
Filter FisherScientific 15161499 0.2 µm PTFE membrane filter, 15 mm diameter
N-Isopropylacrylamide (NIPAM)-based hydrogels   The nanogels (NGs) used in the study are provided by our collaborator in Queen Mary University London, Department of Chemistry. The NGs are covalently tagged with a fluorescent molecule (λex= 477 nm; λem= 540 nm). NGs are freeze dried and shipped as powder, in this state they are stable at room temperature for long period of time. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37, 13-25 (2010).
  2. Profaci, C. P., Munji, R. N., Pulido, R. S., Daneman, R. The blood-brain barrier in health and disease: Important unanswered questions. The Journal of Experimental Medicine. 217 (4), 20190062 (2020).
  3. Abbott, N. J. Blood-brain barrier structure and function and the challenges for CNS drug delivery. Journal of Inherited Metabolic Disease. 36 (3), 437-449 (2013).
  4. Kreuter, J. Drug delivery to the central nervous system by polymeric nanoparticles: What do we know. Advanced Drug Delivery Reviews. 71, 2-14 (2014).
  5. Zhang, W., Mehta, A., Tong, Z., Esser, L. L.Advanced science. 8 (10), Weinheim, Baden-Wurttemberg, Germany. 2003937 (2021).
  6. Vashist, A., et al. Nanogels as potential drug nanocarriers for CNS drug delivery. Drug Discovery Today. 23 (7), 1436-1443 (2018).
  7. Lombardo, S. M., Schneider, M., Türeli, A. E., Günday Türeli, N. Key for crossing the BBB with nanoparticles: The rational design. Beilstein Journal of Nanotechnology. 11, 866-883 (2020).
  8. Bernardo-Castro, S., et al. Therapeutic nanoparticles for the different phases of ischemic stroke. Life. 11 (6), Basel, Switzerland. 482 (2021).
  9. Salinas, Y., Castilla, A. M., Resmini, M. An L-proline based thermoresponsive and pH-switchable nanogel as a drug delivery vehicle. Polymer Chemistry. 9 (17), 2271-2280 (2018).
  10. Liu, P., Pearce, C. M., Anastasiadi, R. M., Resmini, M., Castilla, A. M. Covalently crosslinked nanogels: An NMR study of the effect of monomer reactivity on composition and structure. Polymers. 11 (2), 353 (2019).
  11. Preman, N. K., Jain, S., Johnson, R. P. ”Smart” polymer nanogels as pharmaceutical carriers: A versatile platform for programmed delivery and diagnostics. ACS Omega. 6 (8), 5075-5090 (2021).
  12. Cuggino, J. C., Blanco, E. R. O., Gugliotta, L. M., Alvarez Igarzabal, C. I., Calderón, M. Crossing biological barriers with nanogels to improve drug delivery performance. Journal of Controlled Release Official Journal of the Controlled Release Society. 307, 221-246 (2019).
  13. Basso, J., et al. Hydrogel-based drug delivery nanosystems for the treatment of brain tumors. Gels. 4 (3), Basel, Switzerland. 62 (2018).
  14. Harilal, S., et al. Revisiting the blood-brain barrier: A hard nut to crack in the transportation of drug molecules. Brain Research Bulletin. 160, 121-140 (2020).
  15. Papadimitriou, S. A., Robin, M. P., Ceric, D., O'Reilly, R. K., Marino, S., Resmini, M. Fluorescent polymeric nanovehicles for neural stem cell modulation. Nanoscale. 8 (39), 17340-17349 (2016).
  16. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
  17. Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (8), 650-661 (2007).
  18. Reichel, A., Begley, D. J., Abbott, N. J. An overview of in vitro techniques for blood-brain barrier studies. Methods in Molecular Medicine. 89, 307-324 (2003).
  19. Shimizu, F., et al. Peripheral nerve pericytes modify the blood-nerve barrier function and tight junctional molecules through the secretion of various soluble factors. Journal of Cellular Physiology. 226 (1), 255-266 (2011).
  20. Pedroso, D. C., et al. Improved survival, vascular differentiation and wound healing potential of stem cells co-cultured with endothelial cells. PLoS One. 6 (1), 16114 (2011).
  21. Kanda, T., Iwasaki, T., Yamawaki, M., Ikeda, K. Isolation and culture of bovine endothelial cells of endoneurial origin. Journal of Neuroscience Research. 49 (6), 769-777 (1997).
  22. Data sheet on human astrocytes culture. Technical resources from ScienCell. , Available from: https://www.sciencellonline.com/human-astrocytes.html#product_tabs_technicalresources (2021).
  23. Deligne, C., et al. Development of a human in vitro blood-brain tumor barrier model of diffuse intrinsic pontine glioma to better understand the chemoresistance. Fluids and Barriers of the CNS. 17 (1), 37 (2020).
  24. Cecchelli, R., et al. A stable and reproducible human blood-brain barrier model derived from hematopoietic stem cells. PLoS One. 9 (6), 99733 (2014).
  25. Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. Blood-Brain Barrier: From physiology to disease and back. Physiological Reviews. 99 (1), 21-78 (2019).
  26. Daneman, R., Prat, A. The Blood-Brain Barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), 020412 (2015).
  27. Deli, M. A., Ábrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: Physiology, pathology, and pharmacology. Cellular and Molecular Neurobiology. 25 (1), 59-127 (2005).
  28. Heymans, M., Figueiredo, R., Dehouck, L., Francisco, D., Sano, Y., Shimizu, F., Kanda, T., Bruggmann, R., Engelhardt, B., Winter, P., Gosselet, F., Maxime, C. Contribution of brain pericytes in blood-brain barrier formation and maintenance: A transcriptomic study of co-cultured human endothelial cells derived from hematopoietic stem cells. Fluids Barriers CNS. 17, 48 (2020).
  29. Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , (1959).
  30. Neuhaus, W. In Vitro Models of the Blood-Brain Barrier. Handbook of Experimental Pharmacology. 265, 75-110 (2021).
  31. Hoheisel, D., Nitz, T., Franke, H., Wegener, J., Hakvoort, A., Tilling, T., Galla, H. J. Hydrocortisone reinforces the blood-brain properties in a serum free cell culture system. Biochemical and Biophysical Research Communications. 247 (2), 312-315 (1998).
  32. Drolez, A., et al. Selection of a relevant in vitro blood-brain barrier model to investigate pro-metastatic features of human breast cancer cell lines. PloS One. 11 (3), 0151155 (2016).
  33. Neuhaus, W., Gaiser, F., Mahringer, A., Franz, J., Riethmüller, C., Förster, C. The pivotal role of astrocytes in an in vitro stroke model of the blood-brain barrier. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 352 (2014).
  34. Mysiorek, C., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-α activation protects brain capillary endothelial cells from oxygen-glucose deprivation-induced hyperpermeability in the blood-brain barrier. Current Neurovascular Research. 6 (3), 181-193 (2009).
  35. Culot, M., et al. Cerebrovascular protection as a possible mechanism for the protective effects of NXY-059 in preclinical models: An in vitro study. Brain Research. 1294, 144-152 (2009).
  36. Vandenhaute, E., Drolez, A., Sevin, E., Gosselet, F., Mysiorek, C., Dehouck, M. -P. Adapting co-culture in vitro models of the blood-brain barrier for use in cancer research: Maintaining an appropriate endothelial monolayer for the assessment of transendothelial migration. Laboratory Investigation. 96 (5), 588-598 (2016).
  37. Cucullo, L., Hossain, M., Puvenna, V., Marchi, N., Janigro, D. The role of shear stress in Blood-Brain Barrier endothelial physiology. BMC Neuroscience. 12, 40 (2011).

Tags

Biyoloji Sayı 177
İnsan Kan-Beyin Bariyerini Modelleyen Üçlü Kültür Hücre Sistemi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rizzi, E., Deligne, C., Dehouck, L., … More

Rizzi, E., Deligne, C., Dehouck, L., Bilardo, R., Sano, Y., Shimizu, F., Kanda, T., Resmini, M., Gosselet, F., Dehouck, M. P., Mysiorek, C. A Triple Culture Cell System Modeling the Human Blood-Brain Barrier. J. Vis. Exp. (177), e63134, doi:10.3791/63134 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter