Summary
Er is een methode vastgesteld om rustige neurale stamcellen in gekweekte Drosophila-hersenexplantaten te reactiveren. Met behulp van deze methode kan de rol van systemische signalen worden losgekoppeld van weefselintrinsieke signalen in de regulatie van neurale stamcelrust, in- en uitgang.
Abstract
Neurale stamcellen (NSC's) hebben het vermogen om zich te vermenigvuldigen, te differentiëren, apoptose te ondergaan en zelfs rust in en uit te gaan. Veel van deze processen worden gecontroleerd door het complexe samenspel tussen NSC intrinsieke genetische programma's met NSC extrinsieke factoren, lokaal en systemisch. In het genetische modelorganisme, Drosophila melanogaster, schakelen NSC's, bekend als neuroblasten (NBs), over van rust naar proliferatie tijdens de embryonale naar larvale overgang. Gedurende deze tijd komen larven uit hun eierschalen en beginnen te kruipen, op zoek naar voedingsstoffen in de voeding. Als reactie op diervoeding produceert het vetlichaam, een endocriene orgaan met lipideopslagcapaciteit, een signaal, dat systemisch wordt vrijgegeven in de circulerende hemolymfe. Als reactie op het van het vetlichaam afgeleide signaal (FBDS) worden Drosophila insuline-achtige peptiden (Dilps) geproduceerd en vrijgegeven uit neurosecretoire neuronen en glia in de hersenen, wat leidt tot downstream activering van PI3-kinase groeisignalering in NBs en hun gliale en tracheale niche. Hoewel dit het huidige model is voor hoe NB's overschakelen van rust naar proliferatie, blijft de aard van de extrinsieke cue van FBDS ongrijpbaar. Om beter te begrijpen hoe NB extrinsieke systemische signalen de exit van rust reguleren, werd een methode ontwikkeld om vroege larvale hersenen in vitro te kweken voordat dieren zich voeden. Met deze methode kunnen exogene factoren worden geleverd aan de cultuurmedia en NB exit uit rusttest. We ontdekten dat exogene insuline voldoende is om NBs te reactiveren vanaf rust in explantaten van de hele hersenen. Omdat deze methode zeer geschikt is voor grootschalige schermen, streven we ernaar om extra extrinsieke signalen te identificeren die NB-rust versus proliferatiebeslissingen reguleren. Omdat de genen en routes die NSC-proliferatiebeslissingen reguleren evolutionair geconserveerd zijn, kunnen de resultaten van deze test inzicht geven in het verbeteren van regeneratieve therapieën in de kliniek.
Introduction
Stamcellen zijn van groot belang vanwege hun potentieel voor gebruik in regeneratieve geneeskunde 1,2. Veel dieren, vooral die met een lang leven, onderhouden stamcellen in hun volwassen weefsels. Deze residente stamcellen functioneren om weefselhomeostase te behouden en worden gebruikt voor reparatie na lichamelijk letsel of ziekte 3,4. De meeste stamcellen bij volwassen dieren zijn rustig, een relatief slapende toestand die wordt gekenmerkt door celcyclusstop en inactivatie van groeisignalering5. Als reactie op extrinsieke signalen verlaten stamcellen de rust, gaan ze de celcyclus in en beginnen ze dochter nakomelingen te genereren die specifiek zijn voor hun weefseltype. Om bijvoorbeeld een effectieve immuunrespons op te zetten, induceren antigeen-presenterende cellen rustige naïeve T-cellen om de celcyclus binnen te gaan en klonaal uit te breiden6. Als reactie op schade aan de skeletspieren komen spiersatellietstamcellen in de celcyclus en genereren dochtermyoblasten om beschadigde myofibrillen te vervangen 5,7. Hoewel het duidelijk is dat rustige stamcellen reageren op extrinsieke signalen, blijft in veel gevallen de aard van de extrinsieke cue onduidelijk, evenals het mechanisme van cue-geïnduceerde stamcelactivering. Het verkrijgen van een beter begrip van hoe rustige stamcellen reageren op extrinsieke signalen en de celcyclus ingaan, zal helpen bij de ontwikkeling van betere stamceltherapieën in de kliniek en de wetenschappelijke kennis vergroten.
Al tientallen jaren worden modelorganismen gebruikt om de genen en celsignaleringsroutes bloot te leggen die de proliferatie van stamcellen tijdens de ontwikkeling en op volwassen leeftijd reguleren. In Drosophila delen neurale stamcellen (NSC's), bekend als neuroblasten (NBs), zich tijdens de ontwikkeling om alle neuronen en glia te genereren die uiteindelijk integreren en het neurale circuit vormen dat nodig is voor de hersenfunctie 8,9. Net als andere stamcellen delen NB's zich asymmetrisch om zichzelf te vernieuwen en, in sommige gevallen, symmetrisch om de stamcelpool uit te breiden. NBs worden gespecificeerd tijdens embryogenese en de meeste komen tegen het einde in rust, samenvallend met afnemende maternale voedingsvoorraden (figuur 1). Nadat de embryogenese is voltooid, komen de larven uit en beginnen ze zich te voeden. Als reactie op diervoeding reactiveren NB's uit rust en hervatten celdelingen 10,11,12,13,14,15,16. Omdat het Drosophila CNS relatief eenvoudig is en omdat NBs op bepaalde tijden rust in- en uitstappen, blijkt het gebruik van Drosophila om de regulatie van rust, in- en uitgang te onderzoeken, ideaal.
Figuur 1: Relatieve proliferatie van CB NBs (centrale hersen neuroblasten, rood) en MB NBs (mushroom body neuroblasts, blauw) over ontwikkelingstijd. Aan het einde van de embryogenese stoppen de meeste NB's (rode lijn) met proliferatie en komen ze in rust. De rust gaat door totdat vers uitgekomen larven hun eerste volledige maaltijd consumeren. De tijdsfocuspunten voor deze methodologie worden aangegeven in rode cirkels (1, rust en 2, reactivering). MB NBs (blauw) zijn een subset van centrale hersenen NBs die zich voortdurend verdelen tijdens de ontwikkeling (4 per hersenhelft). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Als reactie op diervoeding worden PI3-kinase- en TOR-groeisignaleringsroutes actief in NBs en in hun gliale en tracheale niche 10,11,15,16. Wanneer voedingsstoffen uit de voeding worden teruggetrokken of wanneer de niveaus van PI3-kinase worden verlaagd, slagen DE's er niet in om te reactiveren en wordt de groei van glia en luchtpijp ook verminderd 10,11,15,16. Het huidige model stelt dat NB-reactivering wordt gekoppeld aan larvale groei door het vetlichaam, dat een systemisch signaal afgeeft als reactie op diervoeding 12,17,18. Dit signaal, dat ongrijpbaar blijft, bevordert waarschijnlijk de expressie en afgifte van Drosophila insuline-achtig peptide (Dilps) in de hersenen, wat leidt tot de stroomafwaartse activering van PI3-kinase in NB's en hun gliale en tracheale niche. Om de aard van de systemische cue(s) beter te begrijpen, ontwikkelden we een methode om rustige NB's in gekweekte hersenexplantaten te reactiveren. Met deze methode kan reactivering van NBs worden getest in afwezigheid van systemische signalen van het hele dier. Exogene factoren kunnen worden teruggeleverd aan de kweekmedia en NB-reactivering getest op basis van de opname van het thymidine-analoog, EdU. Met behulp van deze methode hebben we vastgesteld dat exogene insuline voldoende is om rustige NB's in hersenexplantaten te reactiveren. Toekomstig werk zal gericht zijn op het identificeren van aanvullende factoren die, wanneer ze weer worden toegevoegd, nb-rust in hersenexplantaten positief of negatief reguleren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Drosophila larven collectie
OPMERKING: Bereid de gistplaat, druivenpasta en het Fly-appartement voordat u begint:
- Gistpasta: Meng in een kleine container 5 g actieve droge gist met 10 ml water om een pasta te vormen die de consistentie van pindakaas heeft. Bedek de gistpasta met plasticfolie en gebruik een elastiekje om het stevig aan de container te bevestigen.
OPMERKING: Verse gistpasta zal uitzetten in de container en zal van het deksel springen tenzij stevig bevestigd. Gistpasta gaat enkele dagen mee bij kamertemperatuur (RT). - Druivenplaten: Volg het recept voor het maken van druivenplaten (tabel 1). Als u platen gebruikt die bij 4 °C zijn opgeslagen, zorg er dan voor dat u de platen voorverwarmt voor gebruik door ze gedurende 1 uur bij RT te plaatsen.
- Meng water (750 ml) en agar (18,75 g) in een kolf van 4 l, draaikrans en autoclaaf gedurende 20 minuten (vloeistofcyclus).
- Meng het druivensap (250 ml) en sucrose (25 g) in een kolf van 1 L met een grote roerstaaf op een verwarmd bord (laag vuur). Wanneer de sucrose is opgelost, zet u het vuur uit, wacht u tot de kolf kan worden aangeraakt voordat u Tegosept (10%, 4 ml) en propionzuur (5 ml) toevoegt. Houd de roerstaaf aan.
- Wanneer het autoclaveren is voltooid, laat u het afkoelen totdat de kolf kan worden aangeraakt (~ 60 °C) en mengt u vervolgens de druivensapmix.
- Meng alle oplossingen in één kolf en laat roeren op het bord.
- Pipetteer de oplossing in deksels van kleine petrischalen (35 mm). Pipetteer ongeveer 9 ml per deksel of totdat een bolle koepel is verkregen.
- OPTIONEEL: Druk de deksels om eventuele bubbels te verwijderen.
- Wanneer de platen stollen, stapelt u de druivenplaten in een doos met een luchtdicht deksel en plaatst u de doos op 4 °C. Platen kunnen maximaal 1 maand worden bewaard.
- Fly condo: Pons ~ 20 gaten in een 6-ounce vierkante bodem polypropyleen Drosophila fles met behulp van een 18 G naald.
- Breng volwassen vliegen (~ 100 OregonR of een ander genotype) over naar een vliegappartement en sluit het appartement af met een druiven-agarplaat bedekt met een beetje gistpasta. Plaats de schar naar het midden van de plaat en bevestig de plaat met laboratoriumtape op het appartement.
- Keer de container om zodat de druivenagarplaat op de bodem ligt en plaats deze gedurende 24 uur in een incubator van 25 °C (figuur 2).
Figuur 2: Visuele weergave van omgekeerde vliegenfles (condo) met mannelijke en vrouwelijke Drosophila-volwassenen . De plastic fles heeft kleine lekke banden, gegenereerd met een naald van 18 G, voor zuurstofuitwisseling. De mond van de fles is afgesloten met een agar druivensap dop en wordt omgekeerd en bewaard in een incubator van 25 °C. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Vervang na 24 uur de druiven-agarplaat en vervang deze door een nieuwe plaat bedekt met gistpasta. Wissel snel de twee platen terwijl je continu lichtjes op de bank op de flat tikt, zodat de volwassen vliegen niet ontsnappen.
- Onderzoek de plaat met het oog en beoordeel het aantal embryo's op de plaat. Drosophila-embryo's zijn langwerpig en wit met twee snaarachtige aanhangsels.
- Als er heel weinig embryo's op de plaat liggen (minder dan 100), gooi de plaat dan weg (schraap de agar uit in het vliegafval en bewaar het plastic deksel voor hergebruik). In veel gevallen zullen volwassen vrouwtjes niet veel embryo's leggen op de eerste nacht in een nieuw appartement. Als dit het geval is, geef de volwassen vliegen dan nog eens 24 uur om te acclimatiseren.
- Als er een groot aantal embryo's op de plaat ligt (minstens 100), bewaar het dan en verwijder voorzichtig de gistpasta met behulp van een spatel met platte bodem.
- Zodra de gistpasta is verwijderd, gebruikt u een metalen plectrum om alle larven handmatig van de druivenplaat te verwijderen onder een ontleedmicroscoop. Bij het bekijken van de plaat onder een ontleedmicroscoop, moeten kruipende larven worden waargenomen, evenals embryo's.
- Verwijder alle larven door de metalen plectrum naar de zijkant van één larve te borstelen. Larven zijn kleverig en blijven aan de plectrum plakken. Zodra één larve op de pluk zit, kunnen extra larven gemakkelijk worden opgepikt door de larve op het gereedschap te gebruiken om meer te hechten.
OPMERKING: Larven houden zich graag aan elkaar vast. Op dit punt maakt het niet uit of larven beschadigd raken. Deze larven worden weggegooid. - Na het plukken en verwijderen van alle larven, plaatst u de plaat terug in de incubator van 25 °C. Zorg ervoor dat u de plaat in een grotere container plaatst die kan worden verzegeld. Plaats natte papieren handdoeken op de bodem van de grotere container om vocht binnen te houden.
- Na 30-60 minuten, neem de plaat terug naar de ontleedmicroscoop en pluk nu voorzichtig ~ 20-25 larven van dezelfde druivenagarplaat om ervoor te zorgen dat de geplukte larven vers worden uitgebroed binnen een tijdvenster van 30-60 minuten.
- Dompel de punt van het gereedschap met de 20-25 vers uitgekomen larven onder in een petrischaal (60 mm) gevuld met 1-2 ml 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 2 minuten.
- Na 2 minuten kantel je de schaal schuin om de vloeistof op de bodem te poolen. Borstel met een kleine kwast de larven uit de vloeistof op de bodem van de petrischaal.
- Verzamel alle larven op de kwast en breng de larven over naar een nieuwe petrischaal (60 mm) met 1-2 ml 70% ethanol. Herhaal stap 1.15 om larven te verzamelen met een penseel en breng ze over naar een nieuwe petrischaal met 1-2 ml 1x PBS.
2. Cultuurmedia en gereedschapsvoorbereiding
- Spuit de bank en het werkgebied in met 70% ethanol en laat drogen.
- Spuit de snijgereedschappen, tangen en twee glazen horlogeschalen in met 70% ethanol en laat ze drogen op de bank.
- Maak de aangevulde Schneider's media (SSM, tabel 2) en plaats deze op ijs.
- Pipetteer 1 ml RVS in elk van de glazen horlogeschalen.
- Breng met behulp van een micropipette met een steriele punt de vers uitgekomen larven van de plaat PBS over naar de SSM in de eerste glazen horlogeschaal. Breng met behulp van een micropipette met een steriele punt de vers uitgekomen larven over naar het SSM in de tweede glazen horlogeschaal.
3. Dissecties en hersenculturen
- Zodra de larven zich in de tweede glazen horlogeschaal met SSM bevinden, ontleedt u de hersenen uit de larven met behulp van een tang en een ontleedmicroscoop. Pas de vergroting indien nodig aan.
- Gebruik de ene tang om de mondhaken te pakken en pak met de andere voorzichtig het lichaam halverwege vast en trek in de tegenovergestelde richting (figuur 3) om de larve in twee stukken te splitsen.
OPMERKING: De hersenen bevinden zich direct achter de mondhaken. Merk op dat er andere weefsels rond de hersenen kunnen zijn. Wees heel voorzichtig bij het verwijderen van deze weefsels, omdat dit kan leiden tot beschadiging van de hersenen
Figuur 3: Drosophila larven in een glazen horlogeschaal met SSM. Tangen zijn goed gepositioneerd voor dissectie. De locatie van de larvale hersenen (donkergrijs) is achter de mondhaken (zwart) en beide worden in de larve weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Zodra 15-20 hersenen zijn ontleed, voegt u 1 ml SSM toe aan een put van een steriele kweekbak met 12 putten. Breng de vers ontleedde hersenen over in het SSM met behulp van een micropipette en een steriele punt (figuur 4A).
- Plaats de hersenen in de SSM-media in de 12-well kweekbak in een incubator bij 25 °C gedurende 24 uur (figuur 4A).
Figuur 4: Hersenkweek en immunostaining. (A) Hele hersenen in een 12-well kweekschaal met 1 ml SSM. De kweekschaal wordt vervolgens gedurende 24 uur in een incubator van 25 °C geplaatst. (B) 72-well mini-tray die hersenexplantaten vasthoudt tijdens immunostaining. Hersenen worden gewassen en oplossingen overgedragen met behulp van een P20 micropipette ingesteld op 10 μL. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
4. Proliferatietest, hersenfixatie en antilichaamkleuring
- Maak de volgende dag 1 ml EdU SSM-oplossing. Pipetteer 10 μL van een 10 mM-voorraad 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) met 990 μL SSM (uiteindelijke EdU-concentratie gelijk aan 0,1 mM) in een steriele microcentrifugebuis en meng. Nadat de incubatietijd van 24 uur is voltooid, pipetteert u de 1 ml EdU SSM in één put van de steriele kweekbak met 12 putten.
- Breng de hersenen met behulp van een micropipette met een steriele punt over van de put met alleen SSM naar de nieuwe put met de EdU SSM-oplossing. Incubeer gedurende 1 uur bij 25 °C.
- Breng vervolgens de EdU-gelabelde hersenen over naar een andere put in dezelfde kweekbak met 1 ml fixeermiddel (4% paraformaldehyde, zie tabel 3 voor recept) gedurende 20 minuten.
LET OP: Paraformaldehyde is een biologisch gevaar en moet op de juiste manier worden verwijderd. - Breng na fixatie de hersenen snel over naar de putten van een 72-well mini-tray met behulp van een micropipette. Elke put kan 10 hersenen en 10-15 μL vloeistof bevatten (figuur 4B). Zodra de hersenen zijn overgebracht naar de mini-tray (niet meer dan 10 hersenen per put), verwijder de fix en spoel de hersenen 3 keer in 10 μL van 1x PBT (fosfaatbuffer, pH 7,4 met 0,1% Triton-X 100).
OPMERKING: Spoelen betekent 10 μL 1x PBT pipetteren op de hersenen, verwijderen en 3 keer herhalen. - Was vervolgens de hersenen 3 keer gedurende 10 minuten elk, opnieuw in 10 μL 1x PBT. Zorg ervoor dat de hersenen te allen tijde bedekt zijn met wat vloeistof.
- Nadat de wasbeurten zijn voltooid, pipetteer 10 μL blokkerende oplossing (1x PBT met 10% normaal geitenserum) op de hersenen. Dek het bakje af en sluit het af met een strook parafilm rond de rand.
- Eenmaal verzegeld, plaats de mini-tray in een afgesloten doos met natte handdoeken om een vochtige omgeving te bieden om verdamping te voorkomen. Plaats de doos met de lade een nacht op 4 °C.
- Maak de volgende dag een primaire antilichaamoplossing.
OPMERKING: In dit protocol werd konijn anti-krabbel gebruikt om celmembranen te labelen en ratten anti-deadpan om neuroblasten te labelen, hoewel een willekeurig aantal andere primaire antilichamen kon worden gebruikt.- Om de primaire antilichaamoplossing te maken, maakt u eerst verdunningen van primaire antilichamen in de blokkerende oplossing. Konijn anti-krabbel wordt bijvoorbeeld gebruikt bij een eindconcentratie van 1:1000. Verdun daarom eerst het antikrabbelantilichaam van het konijn op 1:100 (1 μL antilichaam plus 99 μL blokkerende oplossing). Rat-deadpan wordt gebruikt bij een eindconcentratie van 1:100. Verdun daarom eerst het rat-deadpan-antilichaam op 1:10 (1 μL antilichaam plus 9 μL blokkerende oplossing).
OPMERKING: Deze verdunningen kunnen langdurig bij 4 °C worden bewaard als natriumazide (0,05%) ook wordt toegevoegd om de bacteriegroei te remmen. - Tel vervolgens het aantal putten dat hersenen bevat. Het aantal putten bepaalt het volume van de primaire antilichaamoplossing dat moet worden gemaakt. Als er bijvoorbeeld 2 hersenputten zijn, bereid dan 20 μL primaire antilichaamoplossing voor (voor 10 putjes, 100 μL, enz.). Om een primaire antilichaamoplossing van 20 μL te maken, voegt u 2 μL van elke primaire antilichaamverdunning en 16 μL van de blokkerende oplossing toe.
OPMERKING: De uiteindelijke concentratie van elk van de primaire antilichamen is respectievelijk 1:1000 en 1:100. Kortom, maak de eerste verdunning van primaire antilichamen in een concentratie zodat de tweede verdunning altijd 1:10 is om tot de respectievelijke eindconcentraties te komen. In dit geval 1:1000 voor konijn anti-krabbel en 1:100 voor rat anti-deadpan.
- Om de primaire antilichaamoplossing te maken, maakt u eerst verdunningen van primaire antilichamen in de blokkerende oplossing. Konijn anti-krabbel wordt bijvoorbeeld gebruikt bij een eindconcentratie van 1:1000. Verdun daarom eerst het antikrabbelantilichaam van het konijn op 1:100 (1 μL antilichaam plus 99 μL blokkerende oplossing). Rat-deadpan wordt gebruikt bij een eindconcentratie van 1:100. Verdun daarom eerst het rat-deadpan-antilichaam op 1:10 (1 μL antilichaam plus 9 μL blokkerende oplossing).
- Verwijder de blokkerende oplossing met de micropipette ingesteld op 10 μL en pipetteer 10 μL primaire antilichaamoplossing in elke put.
- Dek het bakje af met parafilm en plaats het terug in de afgesloten doos met natte handdoeken. Incubeer een nacht bij 4 °C.
OPMERKING: Schudden is niet nodig en wordt sterk afgeraden. Antilichamen zullen de hersenen binnendringen zonder te schudden of te mengen. - Verwijder de volgende dag de primaire antilichaamoplossing met behulp van een micropipette en spoel de hersenen 3 keer met 10 μL 1x PBT. Was vervolgens de hersenen 4 keer met 10 μL van 1x PBT gedurende 10 minuten elk. Bereid tijdens de wasbeurten van 10 minuten de secundaire antilichaamoplossing voor.
- Om de secundaire antilichaamoplossing te maken, kiest u secundaire antilichamen die de primaire antilichamen herkennen. In dit protocol werden geiten anti-konijn Alexa Fluor 488 en geit anti-rat Alexa 555 gebruikt.
- Pipetteer 1 μL van elk van de secundaire antilichamen in een microcentrifugebuis met 298 μL van de blokkerende oplossing om de eindconcentratie 1:300 voor elk secundair antilichaam te maken.
- Verwijder na de laatste 10 minuten wassen de 1x PBT en pipetteer 10 μL van de secundaire antilichaamoplossing in elk putje. Sluit het bakje af met parafilm en plaats het terug in de doos met vochtige handdoeken. Incubeer een nacht bij 4 °C.
OPMERKING: Maak u geen zorgen over het verwijderen van elke laatste μL in de putjes tussen spoelingen, wasbeurten of bij het toevoegen van primaire en secundaire antilichaamoplossingen. De hersenen zullen altijd ondergedompeld blijven in een paar μL vloeistof, wat prima is. - Verwijder de volgende dag de secundaire antilichaamoplossing met behulp van een micropipette en spoel de hersenen 3 keer met 10 μL elk van 1x PBT. Was vervolgens de hersenen 4 keer met 10 μL elk van 1x PBT gedurende 10 minuten elk.
- Bereid tijdens de wasbeurten van 10 minuten de EdU-reactiemix voor om de opname van EdU te detecteren. Bereid de EdU-reactiemix volgens de richtlijnen van de fabrikant.
- Verwijder na de laatste wasbeurt de 1x PBT en pipetteer 10 μL van de EdU-reactiemix in elke put met de hersenen. Sluit de microwellplaat af met parafilm en dek af met aluminiumfolie. Laat het bord 30 minuten op de bank liggen.
- Spoel na 30 minuten de hersenen 3 keer met 10 μL elk van 1x PBT en was de hersenen 3 keer met 10 μL elk van 1x PBT gedurende 5 minuten elk.
- Verwijder na de laatste wasbeurt de 1x PBT en pipetteer 10 μL van een montagemediumoplossing op basis van glycerol. Sluit de plaat af en plaats deze 's nachts op 4 °C.
5. Montage en beeldvorming van de hersenen
- Bereid de volgende dag microscoopglaasjes (25 mm x 75 mm x 1 mm): Lijm (bijv. secondelijm) een 22 mm x 22 mm x 1 mm vierkant afdekglas aan elk uiteinde van de microscoopglaasje om een 'brug' te maken waarover de grotere 22 mm x 50 mm x 1 mm coverslip zal worden geplaatst om een ruimte te maken tussen de dia en de grotere coverslip (figuur 5A). Deze ruimte zorgt ervoor dat de hersenen net genoeg beweging hebben om correct te worden georiënteerd, terwijl wordt voorkomen dat het wordt verpletterd.
Figuur 5: Schema van microscoopglaasje, oriëntatie en celtypen in het larvale brein. (A) Visuele weergave van microscoopglaasje waarop een larvaal brein is gemonteerd en klaar is om te worden afgebeeld. (B) Er wordt ook aangetoond dat een richtlijn wordt gebruikt voor weefseloriëntatie. (C) Microscoopglaasje klaar voor beeldvorming op een confocale microscoop. (D) Cartoon met enkele van de celtypen in de larvale hersenen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Na het lijmen van de afdekglazen van 22 mm x 22 mm x 1 mm op de microscoopglaasjes, pipetteer 9,3 μL van de op glycerol gebaseerde montagemedia-oplossing met één brein uit een put van de microwellplaat en plaats deze op het midden van de dia (figuur 5A).
OPMERKING: Larvale hersenen kunnen zich hechten aan de pipetpunt, dus wees voorzichtig. Om adhesie te voorkomen, begint u met het aanzuigen van de antifade en vervolgens het aspirateren van de enkele hersenen tegen het einde van het volume van 9,3 μL. - Zodra de hersenen op de dia staan, plaatst u voorzichtig de 22 mm x 50 mm x 1 mm afdekplaat bovenop. Plaats de hersenen zoals te zien in figuur 5B. Beweeg de coverslip voorzichtig rond om de hersenen te oriënteren. Het monster is dan klaar voor beeldvorming.
- Gebruik een confocale microscoop uitgerust met een hoge vergroting en een hoog numeriek diafragma objectief (Figuur 5C) om de beste beelden te verkrijgen. Bijvoorbeeld: 60x of 63x, 1.4 NA olie-immersielens.
- Stel je de hersenen voor met het dorsale oppervlak dat zich het dichtst bij de coverslip (en objectief) bevindt. Verkrijg de Z-stapels door de hele hersenhelft vanaf het ventrale oppervlak (het verst van het doel verwijderd) met intervallen van 1 μm of Z-stapgrootte.
OPMERKING: Gebruikte lasers zijn afhankelijk van de secundaire antilichamen. In dit protocol waren de gebruikte laserlijnen 488 nm om krabbelvlekken te detecteren, 555 nm om Deadpan te detecteren en 633 nm om EdU te detecteren.
- Stel je de hersenen voor met het dorsale oppervlak dat zich het dichtst bij de coverslip (en objectief) bevindt. Verkrijg de Z-stapels door de hele hersenhelft vanaf het ventrale oppervlak (het verst van het doel verwijderd) met intervallen van 1 μm of Z-stapgrootte.
6. Data-analyse
- Gebruik Fiji open-source software om hersenhelften te analyseren en gebruik de Fiji cell counter plugin om de cellen te tellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vers uitgekomen OregonR wild-type hersenen werden ontleed en gedurende 24 uur gekweekt in aangevulde Schneider's media (SSM) met insuline. Weefsels werden gefixeerd en gekleurd volgens het protocol. Primaire antilichamen gegenereerd tegen Deadpan (Dpn) om NBs te detecteren en Scribble om celmembranen te labelen werden gebruikt. Het thymidine-analoog 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine (Edu) werd toegevoegd om S-fase entry en NB-reactivering te detecteren. We vonden grote Edu positieve en Dpn positieve OS's na 24 uur in cultuur (figuur 6A-C). Vervolgens werden vers uitgekomen OregonR wild-type hersenen gedurende 24 uur gekweekt in aangevulde Schneiders-media zonder insuline. Na 24 uur in cultuur vonden we geen grote Edu-positieve en Dpn-positieve NB's anders dan de vier paddenstoellichaam-NB's en één ventrolaterale NB (figuur 6D-F). Het paddenstoellichaam en de ventrolaterale neuroblasten zijn een subset van de neuroblasten van de centrale hersenen die zich continu delen tijdens de embryonale naar larvale overgang. We concluderen dat exogene insuline voldoende is om neuroblasten te reactiveren vanuit rust in hersenexplantaten gekweekt in schneiders media.
Tijdens confocale beeldvorming werden af en toe enkele hersenhelften met schade waargenomen. De schade die we aantroffen bestond uit kleine tot grote gaatjes in het geëxplanteerde hersenweefsel (figuur 6G,H). Deze weefsels werden uitgesloten van de analyse. Naast het 24-uurstijdpunt werden hersenen ook met succes gekweekt gedurende 48 uur (gegevens niet getoond). Na 48 uur in cultuur vonden we een verdere toename van het aantal Dpn-positieve EdU-positieve CB NBs en een toename van het aantal hersenen met weefselschade. Dit suggereert dat het kweken van hersenen op lange termijn waarschijnlijk haalbaar is; er moet echter grote zorg worden besteed aan het voorkomen van weefselschade.
Figuur 6: Confocale beeldvorming. (A-C) Exogene insuline is voldoende om rustige NBs te reactiveren. (A) Een maximale intensiteitsprojectie van één hersenhelft met Deadpan (Dpn) en Edu-positieve NBs na 24 uur cultuur in aanwezigheid van insuline. (B) Een enkele Z-slice afbeelding van dezelfde hersenhelft met Scribble (Scrib) immunostaining markerende celmembranen. (C) Hoge vergroting van NB in de inzet in paneel B. Eenkanaals grijswaardenafbeeldingen met kleursamenvoeging rechtsonder. (D-F) NBs blijven rustig in afwezigheid van exogene insuline. (D) Een maximale intensiteitsprojectie van één hersenhelft die Dpn- en Edu-positieve NB's laat zien na 24 uur cultuur in afwezigheid van insuline. (E) Een enkele Z-stack van dezelfde hersenhelft met Scrib immunostaining. (F) Hoge vergroting van NB in de inzet in paneel E. Eenkanaals grijswaardenafbeeldingen met kleursamenvoeging rechtsonder. Pijlpunt duidt een van de 4 MB NB's aan, die continu delen en geen rust in en uit gaan (zie figuur 1). (G,H) Voorbeelden van beschadigde hersenexplantaten, niet gebruikt in de analyse. (G) Een enkele Z-plak van een hersenhelft met grote gaten in het weefsel. (H) Een enkel Z-plakje van een hersenhelft vertoont kleine gaatjes in het weefsel. Schaalbalk: 10 μm. De witte stippellijn geeft de middellijn aan. Anterior is up, en posterior is down. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Ingrediënt/Hoeveelheid | 1 L (~125 druivenplaten) |
| Druivensap | 250 ml |
| Sacharose | 25 gr |
| Water | 750 ml |
| Bacto Agar | 18,75 g |
| Tegosept (10%) | 4 ml |
| Propionzuur | 5 ml |
Tabel 1: Recept voor het maken van druivenplaten. Volg de stappen die worden beschreven in paragraaf 1.2.
| Ingrediënt (startconcentratie) | Om 5 ml te maken | Eindconcentratie |
| Schneider's Drosophila media | 3,89 ml | |
| Foetaal runderserum (100%) | 500 μL | 10% |
| Glutamine (200m) | 500 μL | 20 meter |
| Penicilline (5000 eenheden / ml), streptomycine (50.000 μg / ml) | 100 μL | 1000 U/ml pen, 1 mg/ml streptokokken |
| Insuline (10 mg/ml) | 10 μl | 0,02 mg/ml |
| glutathion (50 mg/ml) | 5 μl | 0,05 mg/ml |
| Voeg in een steriele kap, met behulp van steriele techniek, alle ingrediënten samen in een conische buis van 14 ml. Leg het op ijs tot gebruik. | ||
Tabel 2: Recept voor het maken van aanvullende Schneider's media (SSM). De tabel geeft het volume weer van alle ingrediënten die nodig zijn voor het bereiden van 5 ml SSM.
| Recept voor het maken van fixatief | ||
| Ingrediënt (startconcentratie) | Om 40 ml te maken | Eindconcentratie |
| EM-kwaliteit formaldehyde 16% | 10 ml | 4% |
| PEM buffer pH 7,0 | 29,96 ml | |
| Triton X-100 | 40 ml | 0.10% |
| Meng alle ingrediënten door elkaar. Aliquot 1 ml in microcentrifugebuizen en bewaren bij -20 °C. Vries de aliquots niet opnieuw in na het ontdooien. | ||
| Recept voor PEM buffer | ||
| Ingrediënt (startconcentratie) | Om 100 ml te maken | Eindconcentratie |
| BUIZEN pH 6,8 (500 mM) | 20 ml | 100m |
| EGTA (500m) | 2 ml | 10 meter |
| MgSO4 (1 m) | 100 ml | 1mm |
| Water | 77,9 ml | |
Tabel 3: Recept voor het maken van fixatieve en PEM buffer. De tabel bevat de chemische stoffen en hun respectieve concentraties voor het bereiden van fixatieve en PEM-buffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier beschreven methode om hersenexplantaten te kweken, kan in de meeste laboratoriumomgevingen worden uitgevoerd. De benodigde tools, evenals de procedure en gegevensverzameling, zijn eenvoudig en ongecompliceerd. Met deze methode kan men een verscheidenheid aan hypothesen testen, waaronder die met betrekking tot de celsignaleringscascades en extrinsieke factoren die NB-reactivering en proliferatie reguleren. Hier, met behulp van wild-type OregonR-dieren, vonden we dat exogene insuline voldoende was om NBs te reactiveren vanaf rust onafhankelijk van andere dierspecifieke systemische signalen. Met behulp van het GAL4/UAS-systeem kan men ook insulineroutecomponenten op een celtypespecifieke manier uitschakelen of overexpressie uitdrukken om de rol van PI3-kinase-signalering bij NB-reactivering beter te begrijpen. Naast het gebruik van genetica kunnen de componenten in de media ook worden gemanipuleerd om extrinsieke signalen of signalen die NB-reactivering en proliferatie bevorderen, verder te testen. Men zou bijvoorbeeld de hypothese kunnen testen dat de toevoeging van het steroïde hormoon ecdyson het percentage NB-reactivering en proliferatie in cultuur zou verhogen.
Hoewel deze methode eenvoudig is, ondervonden we al vroeg verschillende technische problemen. De eerste technische moeilijkheid was schade aan ontleedde, niet-gefixeerde hersenen tijdens mediaveranderingen. We ontdekten dat het overbrengen van hersenen naar een nieuwe put van de kweekschaal in plaats van de media in de put te veranderen, resulteerde in minder weefselschade omdat gaten in de hersenen ontstonden toen media uit de put werden verwijderd en de explantaten aan de bodem van de put kleefden. Om dit probleem op te lossen, werden hersenen in oplossing overgebracht met behulp van een pipet en bleven daarom continu ondergedompeld. Een ander technisch aspect dat werd veranderd, was de sterilisatie van ontleedgereedschappen. Een masker en handschoenen werden te allen tijde gedragen. Ethanol (70%) werd gebruikt om de dissectiegereedschappen en dissectiebakken te spuiten. Hierdoor kon de bacteriële belasting tot een minimum worden beperkt. De stappen voor de fixatie moeten worden uitgevoerd in een zo steriel mogelijke omgeving, bij voorkeur een steriele kap, en met nauwkeurige en uiterst zachte bewegingen. De laatste moeilijkheid die we tegenkwamen was dat de hersenen plakkerig waren. Vaak kleefden hersenen aan de binnenwanden van de pipetpunt wanneer we probeerden ze op de microscoopglaasjes te plaatsen voor beeldvorming. Om dit probleem op te lossen, hebben we de hersenoverdrachtsmethode tussen de microwell-minilade naar de microscoopglaasje aangepast zoals hierboven beschreven, waarbij de pipetpunt werd gevuld met bevestigingsmedia voordat de hersenen in de pipetpunt werden gespiratificeerd. Deze methode smeerde de pipetpunt met de op glycerol gebaseerde montagemedia en verminderde het plakken aanzienlijk.
Methoden om Drosophila hersenexplantaten te kweken zijn eerder gepubliceerd 12,19,20,21,22. Een methode gepubliceerd door Prithviraj et al. rapporteert het kweken van late larvale en vroege pophersenen. In dit geval werd het steroïde hormoon ecdyson toegevoegd aan de kweekmedia en werden de hersenen tot 10 uur20 in cultuur gehouden. Bobstock et al. rapporteren het kweken van hersenen van late L1 / vroege L2-dieren en live imaging NBs gedurende enkele uren in het ventrale zenuwstreng. Ze melden ook problemen bij het omgaan met hersenen van jonge larven21. Siller et al. rapporteren het kweken van larvale hersenen en het gebruik van live-cell imaging om spindeldynamiek te testen tijdens neuroblastdelingen in midden- tot late larvale stadia19. Alle eerder gepubliceerde methoden richten zich op tijdstippen na het vers uitgekomen larvale stadium vóór het voederen van dieren, met één uitzondering. In Britton et al. wordt gemeld dat NBs reactiveren vanuit rust wanneer hersenexplantaten worden gecocultiveerd met vetlichaam12. Verrassend genoeg melden Britton et al. ook dat exogene insuline niet voldoende was om rustige NB's te reactiveren, in tegenstelling tot wat hier wordt gemeld. Vandaar het leggen van de basis voor het idee dat een FBDS nodig is voor NB-reactivering. Ten tijde van het Britton-artikel waren NB-specifieke moleculaire markers nog niet beschikbaar en het is duidelijk dat de morfologie van de hersenen na 3 dagen in cultuur is aangetast. Hier bieden we een eenvoudige methode om NBs in hersenexplantaten te reactiveren door eenvoudig exogene insuline aan de kweekmedia toe te voegen. Een belangrijke waarschuwing is dat de hoeveelheid insuline die aan de cultuur wordt toegevoegd, de fysiologische omstandigheden ver overtreft. Hoge niveaus van insuline kunnen leiden tot hogere niveaus van PI3-kinase pathway activiteit in hersenceltypen in vitro in vergelijking met in vivo omstandigheden.
Omdat de cultuurmedia gemakkelijk kunnen worden gemanipuleerd door verschillende factoren toe te voegen, kan deze techniek worden gebruikt om toekomstige hypothesen met betrekking tot extrinsieke signalering en NB-rust, in- en uitgang aan te pakken. Deze methode kan ook worden gebruikt voor grootschalige screening, hetzij RNAi of op basis van geneesmiddelen. Voor grootschalige screening zou het het beste zijn om transgene dieren te gebruiken die fluorescerende verslaggevers tot expressie brengen. Hierdoor kan men antilichaamkleuring omzeilen, wat tijdsintensief is. Over het algemeen kon men na het oefenen 10 culturen van elk 3 hersenen in 30 minuten opzetten. In een week kan het redelijk zijn om 150 verschillende omstandigheden te screenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen tegenstrijdige belangen.
Acknowledgments
We erkennen het LSAMP Bridges to Doctorate-programma voor financiering (CNK) en NIH / NIGMS (R01-GM120421 en R35-GM141886). We zijn Dr. Conor Sipe dankbaar voor figuur 1. We bedanken ook alle Siegrist-lableden voor hun voortdurende steun en mentorschap. We bedanken in het bijzonder Chhavi Sood en Gary Teeters voor hun zorgvuldige lezing van het manuscript en voor het geven van commentaar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 µL Pipette tips | Denville Sci | P2102 | |
| 1000 µL Pipette tips | Denville Sci | P2103-N | |
| 1000 µL Pipettor | Gilson | P1000 | |
| 16% paraformaldehyde (10 x 10 mL) | Electron Microscopy Sciences | 2912.60.0000 | Used for Fixation of Larval Brains |
| 20 µL Pipette | Gilson | P20 | |
| 200 µL Pipette tips | Denville Sci | 1158U56 | |
| 24-well multiwell culture plates | Fisher Scientific | 50-197-4477 | |
| 35 mm Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-100A | Grape Plate Ingredients |
| 4 °C refrigerator | Fisher Scientific | Provides an ideal temperature for >24 h incubations in antibody solution | |
| 63x Objective | Lecia | ||
| Active dry yeast | Most supermarkets | ||
| Agarose | Fisher Scientific | 214010 | Grape Plate Ingredients |
| Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647 dye | Thermo Fisher Scientific | C10340 | to label proliferating cells |
| Confocal Microscope | Leica | SP8 | |
| Coverslips 22 mm x 22 mm x 1 mm , 10 pack of 4 oz | Fisher Scientific | 12-544-10 | Two Coverslips are super glued to the ends of the microscope slide. This creates a space that allows for the brains to float in antifade while being imaged. |
| Coverslips, 22 mm x 50 mm x 1 mm | Fisher Scientific | 12-545E | The coverslip is placed on two square coverslips on the microscope slide ensuring that the brain in the antifade does not move while imaging. |
| Dissecting microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Ethanol 200 proof (100%), Decon Labs, 1 gallon bottle | Fisher Scientific | 2701 | Used to wash off the larvae before the 24 hr hold in culture medium |
| Fetal Bovine Serum (10%) | Sigma | F4135-100ML | Supplement for cell culture media. |
| Fine forceps for dissection | Fine Science Tools | 11295-20 | Forcepts used in disections. They work best when sharpened. |
| Fly Bottles for Crossing | Genessee Scientific | 32-130 | This bottle is used as a container that lets the flies lay eggs on the grape plate. |
| Glass Dissection Dish (3 well) | These are no longer available | ||
| Glutathione | Sigma | G6013 | Provides oxidative protection during cell culture. |
| Goat Serum | Sigma | G9023- 10ML | Blocking Agent |
| Grape Plates | Made in house | Made in house | Grape juice/agarose plates for collecting freshly hatched eggs |
| Image J | Imagej.net/fiji/downloads | Free Download: https://fiji.sc | Imaging platform that is used to count cells and Edu reactivation |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | Ensures that the temperature, humidity, and light exposure is exactly the same throughout experiment. | |
| Insulin | Sigma | I0516 | Independant variable of the experiment |
| Laminar flow hood | For aliquoting culture media | ||
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | Provides support during cell culture |
| Nunc 72-well Microwell Mini Trays | Fisher Scientific | 12-565-154 | Immunostaining steps are performed in this tray |
| Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | Film used to seal plates in order to prevent evaporation |
| Pen-Strep | Sigma | P4458-100ml | Antibiodics used to prevent bacterial contamination of cells during culture. |
| Phosphate Buffer, pH7.4 | Made in house | Made in house | Solvent used to wash the brains after fixing and staining steps |
| Pick | Fine Science Tools | 10140-01 | Used to pick larvae off of the grape plate |
| Propionic acid | Fisher Scientific | A-258 | Grape Plate Ingredients |
| Rabbit 405 | Abcam | ab175653 | Antibodies used for immunostaining |
| Rat 555 | Abcam | ab150166 | Antibodies used for immunostaining |
| Rb Scribble | A Gift from Chris Doe | Antibodies used for immunostaining | |
| Rt Deadpan | Abcam | ab195173 | Antibodies used for immunostaining |
| Schneiders Culture Medium | Life Tech | 21720024 | Contains nutrients that help the cells grow and proliferate |
| SlowFade Diamond Antifade (5 x 2 mL) | Life Tech | S36963 | Reagent that provides protection against fading fluorophores |
| Sterile Water | Autoclave Milli-Q water made in house | Needed for Solutions | |
| Sucrose | Fisher | S2-12 | Grape Plate Ingredients |
| Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Superglue | Most supermarkets | ||
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | Grape Plate Ingredients |
| Triton-X 100 | Sigma | T9284-100ML | PBT |
| Welch's 100% grape grape juice | Most supermarkets | Grape Plate Ingredients |
References
- Suman, S., Domingues, A., Ratajczak, J., Ratajczak, M. Z. Potential clinical applications of stem cells in regenerative medicine. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1201, 1-22 (2019).
- Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
- Daley, G. Q. Stem cells and the evolving notion of cellular identity. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370, 20140376 (2015).
- Rodrigues, M., Kosaric, N., Bonham, C. A., Gurtner, G. C. Wound healing: A cellular perspective. Physiological Reviews. 99, 665-706 (2019).
- van Velthoven, C. T. J., Rando, T. A. Stem cell quiescence: Dynamism, restraint, and cellular idling. Cell Stem Cell. 24, 213-225 (2019).
- Chapman, N. M., Boothby, M. R., Chi, H. Metabolic coordination of T cell quiescence and activation. Nature Reviews Immunology. 20, 55-70 (2020).
- Wosczyna, M. N., Rando, T. A. A muscle stem cell support group: Coordinated cellular responses in muscle regeneration. Developmental Cell. 46, 135-143 (2018).
- Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139, 4297-4310 (2012).
- Kang, K. H., Reichert, H. Control of neural stem cell self-renewal and differentiation in Drosophila. Cell and Tissue Research. 359, 33-45 (2015).
- Chell, J. M., Brand, A. H. Nutrition-responsive glia control exit of neural stem cells from quiescence. Cell. 143, 1161-1173 (2010).
- Sousa-Nunes, R., Yee, L. L., Gould, A. P. Fat cells reactivate quiescent neuroblasts via TOR and glial insulin relays in Drosophila. Nature. 471, 508-512 (2011).
- Britton, J. S., Edgar, B. A. Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms. Development. 125, 2149-2158 (1998).
- Lin, S., et al. Extremes of lineage plasticity in the Drosophila brain. Current biology : CB. 23, 1908-1913 (2013).
- Sipe, C. W., Siegrist, S. E. Eyeless uncouples mushroom body neuroblast proliferation from dietary amino acids in Drosophila. Elife. 6, 26343 (2017).
- Speder, P., Brand, A. H. Systemic and local cues drive neural stem cell niche remodelling during neurogenesis in Drosophila. Elife. 7, 30413 (2018).
- Yuan, X., Sipe, C. W., Suzawa, M., Bland, M. L., Siegrist, S. E. Dilp-2-mediated PI3-kinase activation coordinates reactivation of quiescent neuroblasts with growth of their glial stem cell niche. PLoS Biology. 18, 3000721 (2020).
- Colombani, J., et al. A nutrient sensor mechanism controls Drosophila growth. Cell. 114, 739-749 (2003).
- Geminard, C., Rulifson, E. J., Leopold, P. Remote control of insulin secretion by fat cells in Drosophila. Cell Metabolism. 10, 199-207 (2009).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Molecular Biology of the Cell. 16, 5127-5140 (2005).
- Prithviraj, R., Trunova, S., Giniger, E. Ex vivo culturing of whole, developing Drosophila brains. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e4270 (2012).
- Bostock, M. P., et al. An immobilization technique for long-term time-lapse imaging of explanted drosophila tissues. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 590094 (2020).
- Datta, S. Activation of neuroblast proliferation in explant culture of the Drosophila larval CNS. Brain Research. 818, 77-83 (1999).
