Summary
Los hongos entomopatógenos han ganado importancia como agentes de control biológico de plagas de insectos agrícolas. En este estudio, la producción en masa de un número suficiente de propágulos infecciosos resistentes de aislados sudafricanos de Metarhizium robertsii y M. pinghaense para su aplicación comercial contra plagas de insectos se llevó a cabo con éxito utilizando productos de granos agrícolas.
Abstract
Los hongos entomopatógenos del complejo de especies Metarhizium anisopliae han ganado importancia como agentes de control biológico de plagas de insectos agrícolas. El aumento de la resistencia de las plagas a los insecticidas químicos, las crecientes preocupaciones con respecto a los efectos negativos de los insecticidas en la salud humana y la contaminación ambiental causada por los plaguicidas han llevado a un impulso mundial para encontrar nuevas estrategias sostenibles para la protección de cultivos y el control de plagas. Anteriormente, se han realizado intentos de cultivo masivo de especies de hongos entomopatógenos (EPF) como Beauveria bassiana . Sin embargo, solo se han realizado intentos limitados para el cultivo masivo de Metarhizium robertsii y M. pinghaense para su uso contra plagas de insectos. Este estudio tuvo como objetivo producir en masa un número suficiente de propágulos infecciosos resistentes de aislados sudafricanos de M. robertsii y M. pinghaense para su aplicación comercial. Se utilizaron tres productos de granos agrícolas, avena en copos, cebada en copos y arroz, como sustratos de fermentación sólida EPF. Se utilizaron dos métodos de inoculación, suspensiones conidiales y el cultivo fúngico líquido de blastosporas para inocular los sustratos sólidos. Se observó que la inoculación mediante suspensiones conidiales era relativamente menos efectiva, ya que se observaron mayores niveles de contaminación en los sustratos sólidos en relación con el uso del método de inoculación de blastosporas. Se encontró que la avena en escamas no era un sustrato de crecimiento adecuado tanto para M. robertsii como para M. pinghaense, ya que no se cosecharon conidios secos del sustrato. Se encontró que la cebada en escamas favorecía la producción de M. robertsii conidia sobre la de M. pinghaense, y se cosechó un promedio de 1,83 g ± 1,47 g de M. robertsii conidia seca y cero gramos de M. pinghaense conidia del sustrato. Se encontró que los granos de arroz favorecen la producción en masa conidial de los aislados de M. pinghaense y M. robertsii , con un promedio de 8,2 g ± 4,38 g y 6 g ± 2 g cosechados del sustrato, respectivamente.
Introduction
Los hongos entomopatógenos (EPF) han ganado importancia como agentes protectores de cultivos en el control biológico de importantes plagas de insectos agrícolas 1,2. Los entomopatógenos, que se producen de forma natural en el suelo, causan epizootias en las poblaciones de diversas especies de plagas3. Las especies de EPF son específicas del huésped y plantean relativamente pocos riesgos en términos de atacar a especies no objetivo, y no son tóxicas para el medio ambiente4. Los EPF tienen un mecanismo único para invadir su huésped, así como para propagarse y persistir en su entorno inmediato1. Atacan al huésped principalmente a través de esporas asexuales que se adhieren y penetran en la cutícula del huésped para invadir y proliferar en el hemocoel del huésped. El huésped finalmente muere debido al agotamiento de los nutrientes de la hemolinfa o como resultado de la toxemia causada por los metabolitos tóxicos liberados por el hongo. Después de la muerte, en condiciones ambientales ideales, el hongo emerge en la superficie externa (micosis manifiesta) del cadáver huésped 5,6.
La creciente preocupación por los efectos negativos de los residuos químicos en la salud humana, la contaminación ambiental y el desarrollo de resistencia a las plagas ha llevado a la campaña mundial para reducir los insumos de insecticidas de base química y encontrar estrategias alternativas, novedosas y sostenibles para la protección de cultivos y el control de plagas 6,7,8 . Esto ha brindado oportunidades para desarrollar insecticidas a base de microbios para su uso en programas de Manejo Integrado de Plagas (MIP), que son estrategias ecológicamente más favorables que el control químico convencional 3,8.
Para desarrollar un agente de control microbiano exitoso para una plaga agrícola, primero se debe aislar, caracterizar, identificar y confirmar su patogenicidad para la plaga objetivo. Sin embargo, se requiere un método fácil y rentable para la producción a gran escala del agente microbiano para producir un producto viable para su uso en programas de control biológico 9,10,11,12,13. La producción en masa de cantidades sustanciales de entomopatógenos de buena calidad depende de la cepa microbiana, el medio ambiente, la plaga objetivo, la formulación, el mercado, la estrategia de aplicación y el producto final deseado 14,15,16. EPF se puede producir en masa utilizando la fermentación de sustrato líquido para producir blastosporas o el proceso de fermentación de sustrato sólido para producir conidios aéreos 6,17,18. Sin embargo, el proceso de producción y formulación en masa de entomopatógenos influye directamente en la virulencia, el costo, la vida útil y la eficacia de campo del producto final. Para un uso exitoso en MIP, el proceso de producción de los entomopatógenos debe ser fácil de ejecutar, requerir mano de obra mínima, producir una concentración de alto rendimiento de propágulos virulentos, viables y persistentes, y ser de bajo costo 4,13,14,16.
Comprender los requerimientos nutricionales de los entomopatógenos es importante para el cultivo masivo con todos los métodos de cultivo 4,12. Los componentes nutricionales del medio de producción tienen un impacto significativo en los atributos de los propágulos resultantes, incluyendo la eficacia del biocontrol, el rendimiento, la tolerancia a la desecación y la persistencia 8,19,20,21. La optimización de los procedimientos de producción está diseñada para abordar estos factores22. Para la EPF, los principales requisitos para un buen crecimiento, esporulación y producción en masa de conidios fúngicos son la humedad adecuada, la temperatura óptima de crecimiento, el pH, el intercambio gaseoso de CO2 y O2, y la nutrición, incluidas las buenas fuentes de fósforo, carbohidratos, carbono y nitrógeno18.
Jaronski y Jackson18 describen el método de fermentación de sustrato sólido como el método de aproximación más eficiente y más cercano al proceso natural para la producción de EPF en relación con el método de fermentación de sustrato líquido porque, en condiciones naturales, el conidio fúngico se transmite sobre estructuras erectas sólidas, como la superficie de los cadáveres de insectos. Los productos agrícolas y los subproductos que contienen almidón se utilizan principalmente para la producción en masa de hongos hipocreales, ya que los hongos descomponen fácilmente el almidón a través de la secreción de enzimas hidrolíticas altamente concentradas de sus puntas hifales, para penetrar en la sustancia sólida y acceder a los nutrientes presentes en la sustancia 11,17,18,23 . Los productos de grano también proporcionan los requisitos para una producción saludable de biomasa porque, cuando se hidratan y esterilizan, los sustratos pueden absorber más nutrientes de cualquier medio líquido 16,18,24.
Anteriormente, varios estudios intentaron cultivar en masa especies de EPF como Beauveria bassiana (Bals). Vuil., Cordyceps fumosorosea (Wize) Kelper B. Shrestha & Spatafora, Verticillium lecanii (Zimm.) Viegas y algunos de los Metarhizium anisopliae (Metschn.) El complejo de especies de Sorokin se aísla sobre diversos sustratos 16,23,24. Tales aislados producidos en masa y desarrollados comercialmente incluyen Green Muscle® (cepa IMI 330189), desarrollado a partir de M. anisopliae var Metarhizium acridum (Driver & Milner) J.F. Bisch, Rehner & Humber, Metarhizium 69 (Meta 69 cepa ICIPE69), y Real Metarhizium 69 (L9281), desarrollado a partir de M. anisopliae, y Broadband® (cepa PPRI 5339) y Eco-Bb®, desarrollado a partir de B. bassiana25,26 . Sin embargo, se han hecho intentos limitados para el cultivo de masas Metarhizium robertsii J.F. Bisch., S.A. Rehner & Humber y Metarhizium pinghaense Chen & Guo. Estos dos aislados fueron seleccionados en un estudio previo como los más efectivos para el control de la cochinilla, Pseudococcus viburni Signoret (Hemiptera: Pseudococcidae)27. Por lo tanto, el estudio actual tuvo como objetivo formular y producir en masa un número suficiente de propágulos infecciosos resistentes de los aislados locales de M. robertsii y M. pinghaense para su aplicación comercial contra plagas de insectos. El método de fermentación de sustrato sólido se utilizó para producir en masa los conidios fúngicos para ambos aislados de EPF. Se utilizaron dos métodos de inoculación de EPF, utilizando suspensiones conidiales y el cultivo fúngico líquido de blastosporas, para inocular los sustratos sólidos.
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Protocol
1. Fuente de cepas fúngicas
- Utilice cepas fúngicas aisladas sudafricanas de M. pinghaense 5 HEID (número de acceso de GenBank: MT367414/MT895630) y M. robertsii 6EIKEN (MT378171/MT380849), recolectadas de huertos de manzanas en la provincia occidental del Cabo, Sudáfrica.
- Cultivar cultivos de cada aislado de EPF en 60 g de medio de agar dextrosa Sabouraud, complementado con 1 g de extracto de levadura (SDAY) y 10 μL de estreptomicina.
NOTA: Incubar cultivos de EPF a una temperatura controlada de ± 25 °C en la oscuridad.
2. Metarhizium pinghaense e inoculación de suspensión conidial de M. robertsii
- Preparación de los sustratos sólidos
- Utilice dos productos agrícolas, a saber, avena en copos y cebada en copos, como medios de crecimiento para los dos aislados de EPF y bolsas de autoclave (305 mm × 660 mm) como bolsas de fermentación.
- Use una pequeña tubería de desechos de policloruro de vinilo (1000 mm × 50 mm) para crear un cuello para la bolsa de fermentación en el extremo abierto de la bolsa de autoclave y use cinta de autoclave para asegurar la tubería a la bolsa.
- Cierre la tubería con un tapón de algodón estéril para permitir un intercambio de gases suficiente durante la fermentación.
- Pesar los granos secos (200 g) tanto de la avena en copos como de la cebada en escamas y colóquelos en las bolsas de fermentación, y a cada bolsa, agregue 100 ml de agua destilada y mezcle bien el contenido de las bolsas.
- Deje reposar los granos húmedos durante 15-30 minutos para absorber la humedad antes del autoclave y la esterilización. Prepare seis bolsas para cada tipo de grano y, para evitar la contaminación, coloque las bolsas en otras bolsas de autoclave y autoclave los sustratos a 121 ° C durante 55 min.
- Preparación del inóculo de suspensión conidial
- Cosechar conidios fúngicos de 2-3 semanas de edad de cultivos fúngicos de M. pinghaense y M. robertsii mediante raspado, utilizando una cuchilla quirúrgica estéril.
- Suspender los conidios fúngicos recolectados en 20 ml de agua destilada estéril, suplementada con Tween 20 al 0,05%, y mezclar con vórtice las suspensiones conidiales durante 2 min.
- Preparar 20 mL de suspensiones conidiales, con una concentración de 1 × 107 conidios/mL, e inocular los sustratos sólidos de avena en copos y cebada en copos, respectivamente.
NOTA: Utilice un hemocitómetro para determinar las concentraciones conidiales.
- Inoculación de los sustratos sólidos
- Abra cada bolsa quitando los tapones de cuello de algodón y agregue la suspensión conidial de 20 ml preparada al sustrato en autoclave enfriado.
- Cierre las bolsas nuevamente, usando los tapones para el cuello, y masajee el contenido de la bolsa para permitir que el inóculo fúngico se mezcle uniformemente con el sustrato de grano.
- Incubar las bolsas de fermentación a una temperatura controlada de ± 25 °C, y asegurar un intercambio gaseoso suficiente entre el cultivo y el medio ambiente.
NOTA: Este procedimiento debe realizarse bajo un gabinete de flujo laminar.
- Fase de fermentación
- Masajee manualmente los sustratos de grano en las bolsas de fermentación 2 días después de la inoculación e incubación, cuando se produce un crecimiento micelial visible y el sustrato ha comenzado a ser agrupado por el hongo en crecimiento.
NOTA: Esto se hace para mezclar los gránulos inoculados para permitir que la ramificación micelial tenga lugar durante las primeras etapas tempranas del crecimiento vegetativo de los hongos. - Use un rodillo de cocina para manipular el lecho de sustrato para evitar la heterogeneidad física de los lechos de sustrato de grano y el grosor de la cama de la masa de sustrato.
NOTA: El proceso promueve el metabolismo fúngico, que optimiza la producción de esporas fúngicas, y maximiza el área de superficie, promoviendo el rendimiento conidial18. - Deje que el proceso de fermentación continúe hasta por 4-5 semanas, y revise las bolsas de fermentación cada 2 días para detectar la presencia de cualquier crecimiento vegetativo blanco que pueda desarrollarse durante el proceso de fermentación, lo que puede afectar en gran medida el rendimiento de los conidios fúngicos.
NOTA: Terminar inmediatamente la fermentación en las bolsas de fermentación que contengan cualquier sobrecrecimiento vegetativo blanco, y secar los cultivos de hongos18.
- Masajee manualmente los sustratos de grano en las bolsas de fermentación 2 días después de la inoculación e incubación, cuando se produce un crecimiento micelial visible y el sustrato ha comenzado a ser agrupado por el hongo en crecimiento.
3. Inoculación de blastosporas
- Producción e inoculación de blastosporas
- Preparar un medio de cultivo líquido, que contenga 1 L de agua destilada, 30 g de glucosa, 20 g de extracto de levadura, 4 g de fosfato diábsico potásico (K2HPO4), 15 mL de licor de maíz empinado y 10 μg/mL del antibiótico Estreptomicina, tanto para el M. pinghaense como para el M. robertsii.
- Primero, caliente el agua destilada, apague antes de alcanzar el punto de ebullición y agregue cada uno de los ingredientes, excepto la estreptomicina, al agua caliente en la olla. Lleve el medio a ebullición suave durante 3-4 minutos, y revuelva constantemente el medio para permitir la mezcla adecuada de los ingredientes y evitar la sedimentación de algunos de los ingredientes en el fondo de la olla.
- Vierta un total de 100 ml del medio en nueve matraces diferentes de 250 ml y coloque un tapón de algodón en cada matraz, y cubra el algodón con papel de aluminio como tapón (Figura 1A).
- Autoclave el medio en los matraces durante 55 min a 121 °C. Después del autoclave, deje que el medio en los matraces se enfríe y agregue 10 mg/ml de estreptomicina al medio en cada matraz (Figura 1B).
- Recolecte de dos a tres bucles bacterianos de conidios fúngicos de placas de cultivo de hongos de 2-3 semanas de edad para los aislados de EPF, M. pinghaense y M. robertsii, y transfiéralos a cada medio líquido de 100 ml en los matraces de 250 ml, en condiciones estériles, y selle los matraces.
- Incubar los matraces de cultivo líquido a ± 25 °C, en un agitador orbital a 140 rpm durante 3 días, y cesar la incubación una vez que los cultivos muestren signos de alta turbidez con crecimiento de blastosporas fúngicas (Figura 1C).
- Para detectar cualquier posible contaminación bacteriana de los cultivos, extraiga una muestra de 100 μL de cada matraz de cultivo líquido después de 24 h durante la incubación y la placa en tres placas SDA por aislado. Incubar las placas durante 48 h, a una temperatura controlada de ± 25 °C.
- Preparación del sustrato sólido
- Use arroz blanco hervido de grano largo como medio de sustrato sólido para las blastosporas de M. pinghaense y M. robertsii (adaptado de Jaronski y Jackson18).
- Prepare las bolsas de fermentación como se detalla anteriormente, en los pasos 2.1.1-2.1.3, y para cada bolsa, agregue 1 kg de arroz y 300 ml de agua destilada estéril.
- Mezcle suavemente el contenido de las bolsas de fermentación y colóquelas en bolsas exteriores en autoclave en posición vertical, y en autoclave a 121 ° C durante 55 min. Después del autoclave, deje que los sustratos se enfríen durante ± 45 minutos en condiciones estériles.
- Inoculación y fermentación
- Retire el cierre de cada uno de los matraces de cultivo líquido de M. pinghaense y M. robertsii bajo un flujo laminar y encienda el borde de cada matraz durante 10 s.
- Vierta los cultivos líquidos de 100 ml en las bolsas de fermentación retirando los tapones de algodón de sus cuellos (Figura 2). Vuelva a colocar los tapones de algodón y cubra la parte superior del cuello de la bolsa con papel quirúrgico asegurado con una banda elástica.
NOTA: Determine la concentración de blastosporas para cada matraz utilizando un hemocitómetro, y use concentraciones de blastosporas de 1 × 107 - 5 × 108 blastosporas/ml para inocular los sustratos28. - Gire la parte superior de la bolsa y mezcle el contenido de la bolsa agitando y manipulando ligeramente el sustrato mediante masaje, e incube las bolsas a ± 25 ° C, aplanando el sustrato en las bolsas para evitar la formación de camas gruesas18.
- Romper el sustrato en las bolsas de fermentación masajeando el contenido de las bolsas, 2-3 días después de la inoculación y la incubación, cuando se había producido un crecimiento micelial visible y la unión del sustrato por el hongo (adaptado de la técnica de Jaronski y Jackson18).
NOTA: Permita que la fermentación continúe durante 4 semanas.
Figura 1: Medio de cultivo líquido en matraces de 250 ml. (A) Antes del autoclave. (B) Después del autoclave y la inoculación con esporas de EPF. (C) Medio turbio con blastosporas fúngicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Medio de cultivo líquido de blastospora preparado. (A) Metarhizium robertsii y (B) Metarhizium pinghaense antes de la inoculación del arroz como sustrato sólido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
4. Secado de cultivos fúngicos
- Seque los cultivos de hongos durante 10-12 días después de la fermentación, antes de su uso en ensayos, transfiriendo los cultivos esporulados en bolsas de papel marrón de 26-30 kg (30 x43 x 15250 cm 3).
- Para mejorar la resistencia a la tracción de las bolsas de papel, corte horizontalmente un tercio de la parte superior de cada bolsa y forre la parte inferior de la bolsa (Figura 3A, B).
Figura 3: Preparación de bolsas de papel, procedimiento de secado de cultivos y embalaje. (A,B) Preparación de bolsas de papel marrón. El procedimiento de secado de los cultivos de especies de Metarhizium cultivados en (C, E) arroz hervido y (D, F) cebada en escamas. (G) Bolsas de papel cerradas con grapas para crear una estructura triangular de carpa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Desmenuza suavemente el sustrato en cada bolsa de fermentación, corta la esquina de cada bolsa y transfiere todo el cultivo a las bolsas de papel a través del espacio dejado por la esquina de corte (Figura 3C-F). Para evitar el escape excesivo de esporas de hongos en el aire, realice este proceso lentamente.
NOTA: Realice este proceso en condiciones estériles, utilizando flujo laminar, para evitar la contaminación. - Etiquete cada bolsa de papel y doble sobre el extremo superior de cada bolsa dos veces y cierre con grapas para crear una estructura de carpa triangular, y coloque las bolsas en tendederos de alambre para permitir un secado adecuado y uniforme, a una temperatura controlada de ± 25 ° C y una humedad baja del 30-40%.
- Gire las bolsas diariamente para permitir un secado uniforme de los cultivos y para evitar cualquier rebrote vegetativo que pueda tener lugar, lo que reduciría el rendimiento de las esporas de hongos cosechables.
- Pese cada bolsa de secado después de cada 2 días durante el proceso de secado y continúe el proceso de secado de cada bolsa hasta que se observe poco o ningún cambio en la masa de las bolsas entre los días sucesivos.
5. Cosecha de conidios fúngicos
- Cosechar conidios fúngicos mecánicamente de los cultivos utilizando tres tamices anidados, un tamiz de prueba (ETS) malla n.º 35 (con apertura de 500 μm), anidado en un tamiz de prueba (con apertura de 212 μm), anidado en la malla ETS n.º 100 (con apertura de 150 μm), montado en una bandeja de recolección.
- Cargue la muestra de cultivo seco en el tamiz de malla ETS no. 35 lentamente y coloque una tapa en el tamiz para evitar la liberación de conidios fúngicos en el aire.
- Agregue 10-12 canicas de vidrio a los tamices para ayudar al paso de los conidios fúngicos a través de las pantallas de malla y evitar la retención de los conidios en el tamiz, lo que puede resultar en una reducción de la recuperación de esporas.
- Tape y selle las juntas del tamiz con cinta adhesiva eléctrica para evitar el escape de polvo conidial.
- Coloque los tamices en un agitador vibratorio, equipado con una almohadilla adhesiva, para asegurar la bandeja de recolección y los tamices, durante 20-25 minutos, a un movimiento de 560-640 vibraciones por minuto (Figura 4).
NOTA: Técnica adaptada de Jaronski y Jackson18.
Figura 4: Recolección de esporas de hongos de cultivos secos de Metarhizium robertsii en arroz y cebada en escamas. (A) 10-12 canicas de vidrio añadidas a los tamices para ayudar al paso de los conidios fúngicos a través de las pantallas de malla. M. robertsii conidia cosechada de cultivos en (B) arroz, y (C) en escamas apenas. (D) Tamices en una coctelera vibratoria. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Retire los tamices de prueba de la bandeja de recolección, recoja los conidios y guarde los conidios recolectados en bolsas herméticas e impermeables al agua con cierre de cremallera para su almacenamiento a largo plazo (3-6 meses).
6. Cuantificación de los conidios fúngicos producidos
- Mida y registre la masa de cada sustrato de grano antes de la cosecha de los conidios fúngicos de cada sustrato.
- Mida el peso total de los conidios recolectados restando la masa de las esporas recolectadas de la masa del sustrato sólido.
NOTA: El rendimiento total de los conidios involucra no solo los conidios cosechados, sino también los conidios fúngicos que quedan en el sustrato sólido. - Pesar el sustrato y retirar 10 g del sustrato pesado. Suspender los 10 g del sustrato en Tween 20 al 0,05% y diluir en 10 mL de agua destilada estéril.
- Mezcle la suspensión durante 2 minutos y use un hemocitómetro para hacer el recuento de esporas para determinar el número de conidios lavados del sustrato.
- Realice diluciones adicionales transfiriendo 1000 μL de la suspensión conidial lavada de 10 ml a 9 ml de agua destilada estéril para formar 10 ml de suspensiones de dilución.
- Mezcle las suspensiones conidiales durante 2 min y determine las concentraciones conidiales.
NOTA: Siga el procedimiento y la fórmula descritos por Inglis, Enkerli y Goettel30 para determinar la concentración conidial de las suspensiones. - Recoger y suspender un total de 0,1 g del polvo conidial recogido de cada cultivo en 10 ml de agua destilada estéril suplementada con Tween 20 al 0,05%, y mezclar con vórtice la suspensión conidial durante 2 min, y determinar la concentración conidial utilizando un hemocitómetro.
- Realice diluciones adicionales transfiriendo 1000 μL de la suspensión conidial de 10 mL a 9 mL de agua destilada estéril para formar las diluciones de suspensión de 10 mL.
- Vórtice-mezclar las suspensiones conidiales durante 2 min, calcular las concentraciones conidiales y determinar el número de conidios por gramo.
- Multiplique el número de conidios por gramo de polvo cosechado por la masa inicial del polvo conidial cosechado. Multiplicar el número de conidios lavados del sustrato por el peso total del sustrato gastado, siendo el sustrato del que se cosecharon los conidios.
- Sume los dos valores dados y divídalos por el peso seco inicial del sustrato para calcular el número de conidios por kg o g del sustrato18.
NOTA: Los cálculos se realizaron principalmente para el sustrato de arroz. Se realizó la prueba de germinación o viabilidad conidial tanto para los aislados de M. pinghaense como para M . robertsii para determinar la viabilidad de los conidios producidos.
7. Análisis de datos
- Utilizar un programa informático adecuado para realizar el análisis estadístico de los resultados obtenidos.
NOTA: El análisis estadístico de los datos se realizó utilizando STATISTICA versión 13.5.0.17.
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Representative Results
Se observó una disminución en la masa de contenido de los cultivos de arroz tanto para el M. pinghaense como para el M. robertsii a lo largo del tiempo durante la etapa de secado de los cultivos de hongos, sin que se observara ningún cambio o poco en la masa una vez que los cultivos estaban secos (Figura 5). El polvo de conidios fúngicos secos cosechados tanto del M. pinghaense como del M. robertsii se muestra en la Figura 6.
Figura 5: El cambio en la masa de contenido de bolsa de los cultivos Metarhizium robertsii y M. pinghaense en arroz (intervalo de confianza del 95%) durante 10 días (ANOVA; F5,35 = 2,21; p = 0,08). Diferentes letras sobre las barras indican la diferencia significativa (p < 0,05) obtenida en masa de contenido de bolsa a lo largo de los días. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Conidios cosechados. (A) Conidios cosechados en la bandeja de recolección. (B) Metarhizium robertsii. (C) M. pinghaense. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
No se observaron diferencias significativas en el polvo conidial promedio que se cosechó de cada tipo de grano tanto para M. pinghaense como para M. robertsii. Los conidios secos cosechados para ambos tuvieron un promedio de >90% de viabilidad conidial tanto para M. pinghaense como para M. robertsii. Sobre el sustrato de arroz, M. pinghaense produjo un promedio de 8,2 g ± 4,38 g de polvo conidial, que superó ligeramente la cantidad que se obtuvo para M. robertsii (6 g ± 2 g). Se cosechó un promedio de 1,83 g de ± 1,47 g de M. robertsii conidia seco del sustrato de cebada en escamas, mientras que no se cosechó M. pinghaense del sustrato. No se cosecharon conidios fúngicos secos del sustrato de avena en escamas para M. pinghaense o M. robertsii (Figura 7).
Figura 7: Cantidad media de conidios en polvo. La cantidad media de conidios en polvo de Metarhizium pinghaense y M. robertsii, medida en gramos (intervalo de confianza del 95%) cosechada de los tres sustratos sólidos: arroz hervido, cebada en copos y avena en copos (ANOVA: F2,27 = 2,82 ; p = 0,08). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Se observó una diferencia significativa en el promedio estimado de conidios por gramo, cosechado de los granos de arroz, entre M. pinghaense (3,51 x 107/g ± 0,43 x 107/g) y M. robertsii (4,31 x 107/g ± 0,38 x 107/g). M. robertsii tuvo un recuento promedio de conidios por gramo ligeramente más alto que M. pinghaense (Figura 8).
Figura 8: Conidios promedio por gramo. El promedio estimado de conidios por gramo para Metarhizium pinghaense y M. robertsii (intervalo de confianza del 95%) de los cultivos de arroz (ANOVA: F 1,7 = 8,47; p = 0,02). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
No se observaron diferencias significativas en el número estimado de conidios presentes en el sustrato de arroz gastado entre M. pinghaense (5,02 x 107/mL ± 1,47 x 107/mL) y M. robertsii (3,70 x 107/mL ± 0,91 x 107/mL) (Figura 9). Sin embargo, M. pinghaense tenía un número ligeramente mayor de conidios presentes en el sustrato de arroz que M. robertsii.
Figura 9: Promedio de conidios fúngicos. Los conidios fúngicos promedio estimados de Metarhizium pinghaense y M robertsii (intervalo de confianza del 95%) de los cultivos (F1,7 = 2,45 ; p = 0,16) presentes en los sustratos de cultivo de arroz gastados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
No se observaron diferencias significativas en el rendimiento global estimado de los conidios entre el M. pinghaense (5,09 x 107/g ± 1,35 x 107/g) y el M. robertsii (3,55 x 107/g ± 0,85 x 107/g) obtenidos de los cultivos de sustrato de arroz. Sin embargo, M. pinghaense produjo un rendimiento conidial ligeramente mayor que M. robertsii, lo que produjo un rendimiento conidial más bajo (Figura 10).
Figura 10: Rendimiento total de los conidios. El rendimiento total estimado de conidios de Metarhizium pinghaense y M. robertsii (intervalo de confianza del 95%) de los cultivos en arroz (F1,7 = 3,91; p = 0,09). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La integración exitosa de agentes microbianos para el control biológico de importantes plagas de insectos agrícolas en un agroecosistema depende tanto del éxito como de la facilidad de producción en masa de los entomopatógenos como primer paso en condiciones de laboratorio. La producción en masa de EPF es importante para la aplicación a gran escala y la disponibilidad de productos EPF para programas de MIP utilizando control biológico 9,10,11,12,13. El éxito de la producción en masa de diferentes aislados de EPF está influenciado por los componentes nutricionales del sustrato o medio de producción, que afectan significativamente los atributos de los conidios resultantes, incluida su eficacia, tolerancia a la desecación, persistencia en el campo y rendimiento conidial 8,19,20,21 . Por lo tanto, es importante desarrollar el conocimiento de los requisitos nutricionales de los entomopatógenos producidos en masa durante el proceso de cultivo y fermentación29.
En el estudio actual, la producción en masa de M. robertsii y M. pinghaense se llevó a cabo utilizando tres productos agrícolas diferentes como sustratos de fermentación: arroz hervido, cebada en copos y avena en copos. Se observó que los tres sustratos de grano diferentes influían significativamente en el rendimiento conidial de los aislados de hongos. El arroz hervido fue altamente favorable para la producción en masa de ambos aislados, mientras que los granos de cebada en escamas favorecieron la producción de M. robertsii solamente . Las observaciones se realizaron en base al rendimiento de polvo de conidios fúngicos secos después de la fermentación. Poco o nada, los conidios se cosecharon de la avena en copos después de la fermentación. Se encontró que la avena en escamas retiene niveles más altos de humedad en las bolsas de fermentación durante el proceso de fermentación, lo que podría haber resultado en el bajo rendimiento observado del grano como sustrato para la producción de M. pinghaense y M. robertsii. El sustrato de avena en escamas era propenso a un crecimiento micelial vegetativo blanco de los aislados de hongos en algunos casos, lo que influyó en gran medida en el rendimiento conidial, ya que la esporulación no se produjo en las bolsas de fermentación que contenían el crecimiento excesivo. También se observó que las bolsas de fermentación con el sustrato de avena en copos tenían altos niveles de contaminación bacteriana en relación con las bolsas de fermentación que contenían sustratos de cebada en copos.
Se observaron altos niveles de contaminación por hongos saprófitos o levaduras en relación con la producción en masa de M. pinghaense utilizando cebada en escamas como sustrato. La contaminación fúngica saprofítica se observó en una etapa posterior del proceso de fermentación a través del crecimiento y la conidiogénesis de un hongo distinto al utilizado para inocular el sustrato. El diagnóstico de la contaminación del sustrato en una etapa inicial de la fermentación, antes de la esporulación conidial, fue difícil. Se cree que la contaminación bacteriana y por levaduras durante el proceso de fermentación se manifiesta por parches húmedos en el sustrato, y tanto la avena en escamas como los granos de cebada tienden a absorber y retener la humedad durante más tiempo que los granos de arroz. Esta fue una limitación para usar estos dos sustratos como sustratos de fermentación para la producción en masa de los dos aislados de Metarhizium .
Las observaciones realizadas durante el presente estudio mostraron que el tipo de método de inoculación utilizado para inocular cada sustrato de grano afectó la producción conidial. Se encontró que el método de inoculación en suspensión conidial era relativamente menos efectivo, ya que la avena en copos inoculada y la cebada en escamas mostraron un mayor nivel de contaminación en relación con cuando se utilizó el método de inoculación de blastosporas cultivadas con líquido en granos de arroz. A diferencia del método de inoculación de blastosporas cultivadas en líquido, el método de suspensión conidial no permite la detección de posibles contaminantes en las suspensiones antes de la inoculación de los sustratos, lo que resulta en los altos niveles de contaminación que se observaron en las bolsas de fermentación. Jaronski y Jackson18 describieron varios factores que podrían conducir a la posible contaminación de los sustratos utilizados, como la falta de esterilización completa del sustrato, la inoculación no estéril y el manejo inadecuado del sustrato de fermentación en las bolsas. La contaminación observada en las bolsas de fermentación que contienen cebada en copos y avena en copos también podría haber sido el resultado de una falta de esterilización completa del sustrato, que podría haber ocurrido durante el proceso de autoclave. Jaronski y Jackson18 también describieron el uso de suspensiones conidiales como inoculantes como desventajosos, ya que resulta en mayores posibilidades de contaminación durante la cosecha conidial de un medio de agar.
En el campo, durante la infección de huéspedes adecuados, el hongo primero acumula biomasa en el hemocoel de los insectos a través de la proliferación, antes de su aparición y esporulación en la superficie sólida externa de los insectos30. Tal proceso se imitó cuando se utilizó el método de fermentación líquido-blastospora. En consecuencia, el caldo representaba el hemocoel del insecto, la inoculación del caldo con conidios fúngicos representaba el contacto inicial y la infección del insecto, y la formación de blastosporas en el caldo representaba la proliferación del proceso de blastospora que ocurre dentro del hemocoel del insecto infectado. La inoculación final de los granos de arroz y la esporulación del hongo en los granos a lo largo del tiempo representaron lo que ocurre en la cutícula del insecto una vez que el hongo comienza a emerger del interior del cadáver del insecto. Esto posiblemente puede explicar por qué el método de fermentación de blastosporas líquidas funcionó mejor que el método de inoculación de suspensión conidial.
Jaronski y Jackson18 describieron la avena en escamas y los granos de cebada en escamas como los granos agrícolas preferidos para el cultivo masivo de especies de Metarhizium , en comparación con los granos de arroz, ya que se encontró que los dos tipos de granos mantenían su contenido de humedad durante el proceso de fermentación. Sin embargo, el estudio actual contradice las observaciones y conclusiones de los investigadores antes mencionados, ya que no se encontró que tanto la avena en escamas como la cebada en escamas fueran buenos sustratos sólidos de fermentación para M. pinghaense o M. robertsii. Se encontró que el arroz era un buen sustrato de grano para ambos aislados, ya que no se descomponía en pequeñas partículas que pudieran mezclarse con el producto final, como se sugirió en estudios anteriores.
El estudio actual ha demostrado que los aislados de la especie Metarhizium pueden cultivarse con éxito y producirse en masa utilizando granos de arroz y que los diferentes granos tienden a influir en la esporulación conidial y el rendimiento de manera diferente. Esto podría deberse al hecho de que los diferentes granos difieren en términos de dicha composición nutricional, por ejemplo, las proporciones de carbono: nitrógeno y la concentración de carbono. Se sabe que la concentración de carbono y la relación carbono-nitrógeno de un medio de crecimiento afectan el rendimiento de los conidios, así como su calidad en términos de viabilidad y virulencia22. También se ha demostrado que las técnicas de inoculación utilizadas para inocular los sustratos influyen en el grado de éxito alcanzado en la producción en masa de aislados de EPF sobre sustratos específicos de granos agrícolas. Por lo tanto, la técnica de fermentación de blastosporas líquidas descrita en el presente estudio se recomienda como el mejor método de inoculación para sustratos de granos agrícolas para la producción en masa de aislados de M. pinghaense y M. robertsii . El uso de este método permite la posible detección de contaminación antes del uso de los inoculantes, lo que puede dificultar la producción en masa del aislado de EPF deseado en relación con el uso de la técnica de inoculación de suspensión conidial. También se recomienda que los granos de arroz se utilicen como sustratos sólidos para la producción en masa de conidios de M. pinghaense y M. robertsii, en lugar de cebada en copos y avena en copos. La técnica descrita es importante para la futura producción en masa y la aplicación comercial de los conidios en condiciones de campo contra importantes plagas de insectos en los agroecosistemas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Hort Pome, Hort Stone y al Programa de Tecnología y Recursos Humanos para la Industria (THRIP: TP14062571871) por financiar el proyecto.
ORCID:
Letodi L. Mathulwe http://orcid.org/0000-0002-5118-3578
Antoinette P. Malan http://orcid.org/0000-0002-9257-0312
Nomakholwa F. Stokwe http://orcid.org/0000-0003-2869-5652
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Tween 20 | Lasec | Added to conidial suspensions to allow fungal spores to mix with water | |
| 20 mL McCartney bottles | Lasec | Used to make conidial suspensions | |
| Aluminium foil | Used as a cover of the cotton wool plugs on 250-mL flask | ||
| Autoclave | Used to sterilize materials and ingredients used for the conidia production process | ||
| Autoclave bags | Lasec | Fermentation bags or solid substrate containers | |
| Autoclave tape | Lasec | To secure PVC pipes on the fermentation bags | |
| Brown Kraft paper bags | Used to dry conidia cultures on agricultural grains | ||
| Bunsen burnner | Labnet (Labnet International, Inc.) | Used to flame equipment (surgical blades,inoculating loops and rims of flasks) | |
| Clear edge test sieve | Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates | ||
| Corn steep liquor | SIGMA | 66071-94-1 | Ingredient of the blastospore liquid medium |
| Cotton Wool | Lasec | Used as plug of the neck for fermentation bags | |
| Duran laboratory bottles | Neolab | Used to autoclave SDA medium and distilled water | |
| Electrical tape | Used to tape and seal the sieve joints to prevent the escape of conidial dust | ||
| ENDECOTTS test sieve | Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates | ||
| Erlenmeyer Flasks, Narrow neck,250-mL flask | Lasec | Carrier of the blastospore liquid medium | |
| Ethanol (99%) | Lasec | Used to sterilize surgical blades and inoculating loops | |
| Flaked barley | Health Connection Wholefoods | Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii | |
| Flaked oats | Tiger brands | Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii | |
| Glucose | Merck | Ingredient of the blastospore liquid medium | |
| Growth Chamber/ incubators | For growing fungal conidia culture | ||
| Haemocytometer | Used to determine conidial concentrations | ||
| Inoculating loops | Lasec | For harvesting spores to innoculate liquid medium for blastospores growth | |
| Kitchen rolling pin | Used to manipulate the solid grain substrate bed | ||
| Laminar flow Cabinet | ESCO Laminar Flow Cabinet | Provide as sterile environment during substrate inoculation | |
| Metarhizium pinghaense conidia | Stellenbosch University | 5HEID | Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium pinghaense |
| Metarhizium robertsii conidia | Stellenbosch University | 6EIKEN | Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium robertsii |
| Microscope | ZEIZZ (Scope. A1) | Used to determine conidial concentrations and conidial viability | |
| Orbital shaker | IncoShake- LABOTEC | Used for the blastospore production process | |
| Parboiled rice | Spekko | Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii | |
| Penicillin-Streptomycin | SIGMA | Added to the SDA medium to prevent bacterial contamination | |
| Petri-dishes | Lasec | Containers for the SDA medium | |
| Pipettes and pipette tips | Labnet (BioPette PLUS) | Used to measure liquids ingredients | |
| Polyvinylchloride Marley waste pipe | Used to create a neck for the fermentation bag | ||
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | SIGMA-ALDRICH | Ingredient of the blastospore liquid medium | |
| Rubber band | Used to secure the secure the surgical paper over the fermentation bag PVC pipe necks | ||
| Sabaroud dextrose agar (SDA) | NEOGEN Culture Media | Medium used to culture spores of both Metarhizium pinghaense and Metarhizium robertsii | |
| Sterile distilled water | To hydrate agricultural grains, to make conidial suspensions | ||
| Sticky pad | Used to secure the seives on the vibratory shaker | ||
| Surgical blade | Lasec | Used to scrape off spores from fungal cultures | |
| Surgical paper | Lasec | Used to cover the PVC necks and cotton wool plugs of the fermentation bag | |
| Vibratory shaker | Used to shake conidia off the agricultural grain substrates | ||
| Vortex mixer | Labnet (Labnet International, Inc.) | Used to mix conidial suspensions in Mc Cartney bottles | |
| Yeast extract | Biolab | Added to the SDA medium to improve spore germination and growth | |
| Zipper-lock bags | GLAD | Used to to store harvested fungal conidia |
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