Visualizando e quantificando compostos farmacêuticos dentro da pele usando imagens coerentes de dispersão de Raman
Summary
Uma metodologia coerente de imagem de dispersão raman para visualizar e quantificar compostos farmacêuticos dentro da pele é descrita. Este artigo descreve a preparação do tecido da pele (humano e camundongo) e a aplicação da formulação tópica, aquisição de imagens para quantificar perfis de concentração esposteis e análises farmacocinéticas preliminares para avaliar a entrega de medicamentos tópicos.
Abstract
Farmacocinética cutânea (cPK) após a aplicação da formulação tópica tem sido uma área de pesquisa de particular interesse para cientistas reguladores e de desenvolvimento de medicamentos para entender mecanicamente a biodisponibilidade tópica (BA). Técnicas semi-invasivas, como descascamento de fitas, microdiálise dérmica ou microperfusão de fluxo aberto dérmico, todas quantificam a macroescala cPK. Embora essas técnicas tenham proporcionado vasto conhecimento de CPK, a comunidade carece de uma compreensão mecanicista da penetração e permeação de ingredientes farmacêuticos ativos (API) no nível celular.
Uma abordagem não invasiva para abordar a microescala cPK é a imagem de dispersão raman coerente (CRI), que tem como alvo seletivamente vibrações moleculares intrínsecas sem a necessidade de rótulos extrínsecos ou modificações químicas. O CRI tem dois métodos principais de dispersão anti-Stokes Raman (CARS) e estimulado a dispersão de Raman (SRS) – que permitem quantificação sensível e seletiva de APIs ou ingredientes inativos. Os CARROS são normalmente utilizados para obter informações estruturais da pele ou visualizar contraste químico. Em contraste, o sinal srs, que é linear com concentração molecular, é usado para quantificar APIs ou ingredientes inativos dentro de estratificações de pele.
Embora o tecido do camundongo tenha sido comumente utilizado para cPK com CRI, BA tópico e bioequivalência (BE) devem, em última análise, ser avaliados em tecido humano antes da aprovação regulatória. Este artigo apresenta uma metodologia de preparação e imagem da pele ex vivo a ser utilizada em estudos cri farmacocinéticos quantitativos na avaliação da BA e DO tópicos. Essa metodologia permite quantificação de API confiável e reprodutível na pele humana e do rato ao longo do tempo. As concentrações dentro de compartimentos ricos em lipídios e lipídios, bem como a concentração total de API ao longo do tempo são quantificadas; estes são utilizados para estimativas de BA micro e macroescala e, potencialmente, BE.
Introduction
Metodologias para avaliar a PP após a aplicação de produtos medicamentos tópicos se expandiram a partir de estudos clássicos de permeação in vitro (IVPT) estudos 1,2,3,4,5 e tape-stripping 6,7,8 para metodologias adicionais como microperfusão de fluxo aberto ou microdiálise dérmica 9,10,11, 12,13,14. Existem potencialmente vários locais de ação terapêutica dependendo da doença de interesse. Assim, pode haver um número correspondente de metodologias para avaliar a taxa e até que ponto uma API chega ao local de ação pretendido. Embora cada uma das metodologias acima mencionadas tenha suas vantagens, a maior desvantagem é a falta de informações de microescala cPK (ou seja, a incapacidade de visualizar para onde a API vai e como ela permeia).
Uma metodologia não invasiva de interesse para estimar ba tópico e BE é o CRI, que pode ser dividido em duas modalidades de imagem: CARS e microscopia SRS. Estes métodos coerentes de Raman permitem imagens quimicamente específicas de moléculas através de efeitos raman não lineares. No CRI, dois trens de pulso laser são focados e escaneados dentro de uma amostra; a diferença de energia entre as frequências de laser é definida como alvo de modos vibracionais específicos das estruturas químicas de interesse. Como os processos CRI não são lineares, um sinal só é gerado no foco do microscópio, permitindo imagens tomográficas farmacocinéticas tridimensionais do tecido. No contexto do cPK, o CARS tem sido utilizado para obter informações estruturais teciduais, como a localização de estruturas de pele ricas emlipídios 15. Em contraste, o SRS tem sido utilizado para quantificar a concentração molecular, pois seu sinal é linear com concentração. Para amostras de pele ex vivo , é vantajoso realizar CARROS na epidireção16 e SRS no modo de transmissão17. Portanto, amostras de tecido finas permitirão a detecção e quantificação de sinais SRS.
Como um tecido modelo, a orelha do mouse nu apresenta várias vantagens com pequenas desvantagens. Uma vantagem é que o tecido já está ~200-300 μm de espessura e não requer mais preparação da amostra. Além disso, várias estratificação da pele são vistas por focalização por meio de um campo de visão (por exemplo, corneum estrato, glândulas sebáceas (Gs), adipócitos e gordura subcutânea)16,18. Isso permite uma estimativa pré-clínica preliminar de vias cutâneas de permeação e estimativas tópicas da BA antes de se mudar para amostras de pele humana. No entanto, o modelo de mouse nude apresenta limitações como a dificuldade na extrapolação para cenários in vivo devido a diferenças na estruturada pele 19. Enquanto a orelha de rato nu é um excelente modelo para obter resultados preliminares, o modelo de pele humana é o padrão-ouro. Embora tenha havido vários comentários sobre a adequação e aplicabilidade da pele humana congelada para recapitular com precisão cinética de permeação in vivo 20,21,22, o uso de pele humana congelada é um método aceito para a avaliação da cinética de permeação in vitro API 23,24,25 . Este protocolo visualiza várias camadas de pele em camundongos e pele humana, quantificando concentrações de API em estruturas ricas em lipídios e lipídios.
Embora o CRI tenha sido utilizado em vários campos para visualizar especificamente compostos dentro dos tecidos, houve esforços limitados investigando o cPK de produtos medicamentos aplicados topicamente. Para avaliar a BA/BE atual dos produtos tópicos utilizando o CRI, é necessário primeiro ter um protocolo padronizado para fazer comparações precisas. Esforços anteriores usando CRI para entrega de medicamentos na pele demonstraram variabilidade dentro dos dados. Por se trata de uma aplicação relativamente nova do CRI, estabelecer um protocolo é fundamental para obter resultados confiáveis 18,26,27. Esta abordagem visa apenas um número específico de ondas na região biológica silenciosa do espectro Raman. No entanto, a maioria das APIs e ingredientes inativos têm mudanças raman dentro da região de impressão digital. Isso já apresentou desafios devido ao sinal inerente decorrente do tecido na região das impressões digitais. Os recentes avanços a laser e computacional removeram essa barreira, que também pode ser utilizada em combinação com a abordagem apresentada aqui28. Esta abordagem aqui apresentada permite a quantificação de uma API, que tem uma mudança de Raman na região silenciosa (2.000-2.300 cm-1). Isso não se limita às propriedades fisioquímicas da droga, o que pode ser o caso de algumas metodologias de monitoramento de cPK mencionadas anteriormente29.
O protocolo deve reduzir a variabilidade amostral na espessura da pele para várias preparações, uma vez que amostras de pele humana grossa produzirão sinal mínimo após a aplicação do produto medicamentoso devido à dispersão de luz pela amostra espessa. O objetivo deste manuscrito é apresentar uma metodologia de preparação tecidual que garanta padrões de imagem reprodutíveis. Além disso, o sistema CRI é configurado como descrito para reduzir possíveis fontes de erro, bem como minimizar o sinal-ruído. No entanto, este artigo não discutirá os princípios norteadores e os méritos técnicos do microscópio CRI, uma vez que este já foi previamente coberto30. Finalmente, o extenso procedimento de análise de dados é explorado para permitir a interpretação dos resultados para determinar o sucesso ou fracasso de um experimento.
Protocol
Representative Results
Discussion
A avaliação da BA/BE atual é uma área de pesquisa que requer uma abordagem multifacetada, pois nenhum método único pode caracterizar totalmente in vivo cPK. Este protocolo apresenta uma metodologia para a avaliação da BA/BE de um produto de medicamentos tópicos com base em imagens raman coerentes. Um dos primeiros pontos que podem ser negligenciados é o quão finas as amostras de pele devem ser, especialmente para a transmissão quantitativa de imagens srs. Se a pele é muito grossa (ou seja, …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Fotis Iliopoulos e Daniel Greenfield do Grupo Evans por sua discussão e revisão deste manuscrito. Além disso, os autores gostariam de reconhecer o apoio da LEO Pharma. A Figura 2 foi criada com BioRender.com.
Materials
| Tissue Preparation | |||
| Autoclavable Biohazard Bags | FisherBrand | 22-044562 | As refered to in text: biohazard bags https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-polyethylene-biohazard-autoclave-bags-without-sterilization-indicator-8/22044562?searchHijack=true&searchTerm= 22044562&searchType=RAPID& matchedCatNo=22044562 |
| Cell Culture Buffers: Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x | Corning | MT21030CV | As refered to in text: PBS https://www.fishersci.com/shop/products/corning-cellgro-cell-culture-buffers-dulbecco-s-phosphate-buffered-salt-solution-1x-8/MT21030CV?searchHijack=true&searchTerm= 21-030-cv&searchType= RAPID&matchedCatNo=21-030-cv |
| Disposable Scalpels | Exel International | 14-840-00 | As refered to in text: scalpel https://www.fishersci.com/shop/products/exel-international-disposable-scalpels-3/1484000?keyword=true |
| High Precision 45° Angle Broad Point Tweezers/Forceps | Fisherbrand | 12-000-132 | As refered to in text: forceps https://www.fishersci.com/shop/products/high-precision-45-angle-broad-point-tweezers-forceps/12000132#?keyword= |
| Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | Kimberly-Clark Professional Kimtech Science | 06-666 | As refered to in text: task wiper https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/06666 |
| Parafilm M Laboratory Wrapping Film | Bemis | 13-374-12 | As refered to in text: parafilm https://www.fishersci.com/shop/products/curwood-parafilm-m-laboratory-wrapping-film-4/1337412 |
| Petri Dish (35 mm x 10 mm) | Fisherbrand | FB0875711YZ | As refered to in text: small petri dish https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-specialty-6/FB0875711YZ?keyword=true |
| Petri Dish (60 mm x 15 mm) | Fisherbrand | FB0875713A | As refered to in text: large petri dish https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/FB0875713A?keyword=true |
| Surgical Scissors | Roboz | NC9411473 | As refered to in text: scissors https://www.fishersci.com/shop/products/scissors-327/NC9411473?searchHijack=true&searchTerm= RS-5915SC&searchType=RAPID& matchedCatNo=RS-5915SC |
| Laser/microscope | |||
| 650/60 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | As refered to in text: CARS filter – CH2 vibrations (645nm/60nm filter) | |
| Control box IX2-UCB | Olympus | As refered to in text: Control Box | |
| D700/30m | Chroma | As refered to in text: CARS filter – deuterated band https://www.chroma.com/products/parts/d700-30m |
|
| DeepSee Insight | Spectra-Physics | As refered to in text: Laser https://www.spectra-physics.com/f/insight-x3-tunable-laser |
|
| Digital Handheld Optical Power and Energy Meter Console | ThorLabs | PM100D | As refered to in text: power meter https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341 |
| Fluoview Software | Olympus | As refered to in text: Microscope Control software | |
| Frosted Microscope Slides | FisherBrand | As refered to in text: microscope slides https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-frosted-microscope-slides-4/22265446 |
|
| FV1000 | Olympus | As refered to in text: Microscope | |
| Incubation Chamber | Tokai Hit | GM-800 | As refered to in text: incubation chamber |
| Integrating Sphere Photodiode Power Sensor | ThorLabs | S142C | As refered to in text: photodiode https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341 |
| Power supply FV31-PSU | Olympus | As refered to in text: Power Supply | |
| Precision 4063, 80MHz Dual Channel Function Generator | BK Precision | As refered to in text: function generator | |
| ProScan – Precision Microscope Automation | Prior Scientific Instruments | As refered to in text: stage controller https://www.prior.com/microscope-automation/inverted-microscope-systems/proscan-linear-stage-highest-precision-microscope-automation |
|
| SecureSeal Imaging Spacers | Grace Biolabs | 654004 | As refered to in text: spacer https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654004/ |
| SRS Detection Kit | APE | As refered to in text: SRS detector | |
| UPLSAPO 20X NA:0.75 | Olympus | As refered to in text: 20X Objective https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/uplsapo/ |
|
| Lipid/Drug Imaging | |||
| 35 mm Dish, No. 0 Uncoated Coverslip, 14 mm Glass Diameter | MatTek Corporation | NC9711297 | As refered to in text: Glass bottom dish https://www.fishersci.com/shop/products/glass-bottom-mircrowell-dish/nc9711297 |
| Cotton-tipped applicators | FisherBrand | As refered to in text: Cotton-tipped applicator | |
| Distriman Postive Displacement Pipette | Gilson | As refered to in text: Postive Displacement Pipette https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distriman-positive-displacement-repetitive-pipette/F164001G#?keyword= |
|
| Distriman Postive Displacement Pipette Tips | Gilson | As refered to in text: Tips for pipette https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distritip-syringes-6/f164100g?keyword=true |
|
| Data Analysis | |||
| FIJI | Open-source | As refered to in text: FIJI/ImageJ https://imagej.net/software/fiji/ |
|
| Jupyter-Lab | open-source | As refered to in text: JupyterLab https://jupyter.org/ |
|
| Rstudio | Open-source | As refered to in text: Rstudio https://www.rstudio.com/ |
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