ستساعد هذه البروتوكولات المستخدمين على التحقيق في استقلاب طاقة الميتوكوندريا في الكرويات المشتقة من خط الخلايا السرطانية 3D باستخدام تحليل التدفق خارج الخلية من فرس البحر.
أصبحت المجاميع الخلوية ثلاثية الأبعاد (3D) ، والتي يطلق عليها كرويات ، في طليعة زراعة الخلايا في المختبر في السنوات الأخيرة. على النقيض من زراعة الخلايا كطبقات أحادية ثنائية الأبعاد وأحادية الخلية (ثقافة 2D) ، فإن زراعة الخلايا الكروية تعزز وتنظم وتدعم البنية الخلوية الفسيولوجية والخصائص الموجودة في الجسم الحي ، بما في ذلك التعبير عن بروتينات المصفوفة خارج الخلية ، وإشارات الخلية ، والتعبير الجيني ، وإنتاج البروتين ، والتمايز ، والانتشار. تم الاعتراف بأهمية ثقافة 3D في العديد من المجالات البحثية ، بما في ذلك علم الأورام والسكري وبيولوجيا الخلايا الجذعية وهندسة الأنسجة. على مدى العقد الماضي ، تم تطوير طرق محسنة لإنتاج الكرويات وتقييم وظيفتها الأيضية ومصيرها.
تم استخدام محللات التدفق خارج الخلية (XF) لاستكشاف وظيفة الميتوكوندريا في الأنسجة الدقيقة ثلاثية الأبعاد مثل الكرويات باستخدام إما لوحة التقاط جزيرة XF24 أو صفيحة كروية XFe96. ومع ذلك ، لم يتم وصف البروتوكولات المتميزة وتحسين استقلاب طاقة الميتوكوندريا في الكرويات باستخدام تقنية XF بالتفصيل. يقدم هذا البحث بروتوكولات مفصلة للتحقيق في استقلاب طاقة الميتوكوندريا في كرويات 3D واحدة باستخدام لوحات كروية كروية مع محلل XFe96 XF. باستخدام خطوط الخلايا السرطانية المختلفة ، أثبتت تقنية XF أنها قادرة على التمييز بين التنفس الخلوي في كرويات 3D ليس فقط بأحجام مختلفة ولكن أيضا بأحجام مختلفة وأرقام خلايا ومحتوى الحمض النووي ونوعه.
يتم استخدام تركيزات مركب تأثير الميتوكوندريا الأمثل من oligomycin, BAM15, rotenone, and antimycin A للتحقيق في معلمات محددة من استقلاب طاقة الميتوكوندريا في كرويات ثلاثية الأبعاد. تناقش هذه الورقة أيضا طرق تطبيع البيانات التي تم الحصول عليها من الكرويات وتتناول العديد من الاعتبارات التي يجب مراعاتها عند استكشاف التمثيل الغذائي الكروي باستخدام تقنية XF. سيساعد هذا البروتوكول في دفع البحث في النماذج الكروية المتقدمة في المختبر .
التقدم في النماذج المخبرية في البحوث البيولوجية قد تقدم بسرعة على مدى السنوات ال 20 الماضية. وتشمل هذه النماذج الآن طرائق العضوية على رقاقة ، والأعضاء العضوية ، وكرويات الأنسجة الدقيقة 3D ، وكلها أصبحت تركيزا مشتركا لتحسين الترجمة بين الدراسات في المختبر وفي الجسم الحي. يمتد استخدام النماذج المتقدمة في المختبر ، وخاصة الكروية ، إلى العديد من المجالات البحثية ، بما في ذلك هندسة الأنسجة ، وأبحاث الخلايا الجذعية ، والسرطان ، وبيولوجيا الأمراض1،2،3،4،5،6،7 ، واختبار السلامة ، بما في ذلك علم السموم الوراثي8،9،10 ، علم السموم للمواد النانوية 11 ، 12,13,14، واختبار سلامة الأدوية وفعاليتها 8,15,16,17,18,19.
مورفولوجيا الخلية الطبيعية أمر بالغ الأهمية للنمط الظاهري البيولوجي والنشاط. تسمح زراعة الخلايا في كرويات الأنسجة الدقيقة 3D للخلايا باعتماد مورفولوجيا ، ووظيفة النمط الظاهري ، والهندسة المعمارية ، أقرب إلى تلك التي لوحظت في الجسم الحي ولكن من الصعب التقاطها باستخدام تقنيات زراعة الخلايا أحادية الطبقة الكلاسيكية. في كل من الجسم الحي والمختبر ، تتأثر الوظيفة الخلوية بشكل مباشر بالبيئة الدقيقة الخلوية ، والتي لا تقتصر على الاتصالات الخلوية والبرمجة (على سبيل المثال ، تكوينات تقاطع الخلايا الخلوية ، وفرص تشكيل منافذ الخلية) ؛ تعرض الخلايا للهرمونات وعوامل النمو في البيئات المباشرة (على سبيل المثال ، التعرض الخلوي للسيتوكين كجزء من الاستجابة الالتهابية) ؛ تكوين المصفوفات الفيزيائية والكيميائية (على سبيل المثال ، ما إذا كانت الخلايا تزرع في البلاستيك المزروع بالأنسجة الصلبة أو بيئة الأنسجة المرنة) ؛ والأهم من ذلك ، كيف يتأثر التمثيل الغذائي الخلوي بالتغذية والحصول على الأكسجين وكذلك معالجة منتجات النفايات الأيضية مثل حمض اللاكتيك.
تحليل التدفق الأيضي هو وسيلة قوية لفحص التمثيل الغذائي الخلوي داخل أنظمة المختبر المحددة. وعلى وجه التحديد، تسمح تقنية XF بتحليل التغيرات الحية في الوقت الفعلي في الطاقة الحيوية الخلوية للخلايا والأنسجة السليمة. بالنظر إلى أن العديد من الأحداث الأيضية داخل الخلايا تحدث في غضون ثوان إلى دقائق ، فإن النهج الوظيفية في الوقت الفعلي لها أهمية قصوى لفهم التغيرات في الوقت الفعلي في التدفق الأيضي الخلوي في الخلايا والأنسجة السليمة في المختبر.
تقدم هذه الورقة بروتوكولات لزراعة خطوط الخلايا المشتقة من السرطان A549 (السرطان الغدي الرئوي) ، HepG2 / C3A (سرطان الخلايا الكبدية) ، MCF-7 (سرطان الثدي الغدي) ، و SK-OV-3 (سرطان المبيض الغدي) كما هو الحال في نماذج كروية ثلاثية الأبعاد في المختبر باستخدام نهج التجميع القسري (الشكل 1). كما يصف (i) بالتفصيل كيفية التحقيق في استقلاب طاقة الميتوكوندريا للكرويات ثلاثية الأبعاد المفردة باستخدام محلل Agilent XFe96 XF ، (ii) يسلط الضوء على طرق تحسين اختبارات XF باستخدام كرويات 3D واحدة ، و (iii) يناقش الاعتبارات والقيود المهمة للتحقيق في التمثيل الغذائي الكروي ثلاثي الأبعاد باستخدام هذا النهج. الأهم من ذلك ، تصف هذه الورقة كيفية جمع مجموعات البيانات التي تسمح بحساب معدل استهلاك الأكسجين (OCR) لتحديد الفسفرة التأكسدية وبالتالي وظيفة الميتوكوندريا في الكرويات الخلوية. على الرغم من عدم تحليله لهذا البروتوكول ، إلا أن معدل التحمض خارج الخلية (ECAR) هو معلمة أخرى يتم قياسها جنبا إلى جنب مع بيانات OCR في تجارب XF. ومع ذلك، غالبا ما يتم تفسير ECAR بشكل سيئ أو غير صحيح من مجموعات بيانات XF. نحن نقدم تعليقا على قيود حساب ECAR باتباع الأساليب الأساسية من الشركة المصنعة للتكنولوجيا.
ثالثا – النتائج والنواتج الرئيسية
توفر هذه الورقة بروتوكولا مفصلا للتحقيق في استقلاب طاقة الميتوكوندريا للكرويات المفردة 3D باستخدام سلسلة من خطوط الخلايا المشتقة من السرطان مع محلل XFe96 XF. تم تطوير ووصف طريقة للزراعة السريعة للكرويات الخلوية A549 و HepG2 / C3A و MCF7 و SK-OV-3 باستخدام تقني?…
The authors have nothing to disclose.
تم دعم N.J.C بجائزة قضية BBSRC MIBTP مع Sygnature Discovery Ltd (BB / M01116X / 1 ، 1940003)
A549 | ECACC | #86012804 | Lung carcinoma cell line |
Agilent Seahorse XF RPMI Medium, pH 7.4 | Agilent Technologies Inc. | 103576-100 | XF assay medium with 1 mM HEPES, without phenol red, sodium bicarbonate, glucose, L-glutamine, and sodium pyruvate |
Agilent Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer | Agilent Technologies Inc. | – | Instrument for measuring rates of spheroid oxygen uptake in single spheroids |
Antimycin A | Merck Life Science | A8674 | Mitochondrial respiratory complex III inhibitor |
BAM15 | TOCRIS bio-techne | 5737 | Mitochondrial protnophore uncoupler |
Black-walled microplate | Greiner Bio-One | 655076 | For fluorescence-based assays |
CELLSTAR cell-repellent surface 96 U well microplates | Greiner Bio-One | 650970 | Microplates for generating spheroids |
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9681 | Assay for the determination of cell viability in 3D microtissue spheroids |
Cultrex Poly-D-Lysine | R&D Systems a biotechne brand | 3439-100-01 | Molecular cell adhesive for coating XFe96 spheroid microplates to facillitate attachment of spheroids |
D-(+)-Glucose | Merck Life Sciences | G8270 | Supplement for cell culture growth and XF assay medium |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11885084 | Culture medium for HepG2/C3A spheroids |
EVOS XL Core Imaging System | Thermo Fisher Scientific | AMEX1000 | Phase-contrast imaging microscope |
EZ-PCR Mycoplasma test kit | Biological Industries | 20-700-20 | Mycoplasma screening in cell cultures |
FIJI Is Just Image J | Analysis of collated images | ||
Foetal bovine serum | Merck Life Science | F7524 | Supplement for cell culture medium |
HepG2/C3A | ATCC | #CRL-10741 | Hepatic carcinoma cell line, a clonal derivative of the parent HepG2 cell line |
Lactate-Glo | Promega | J5021 | Assay for measurement of lactate within spheorid culture medium |
L-glutamine (200 mM solution) | Merk Life Sciences | G7513 | Supplement for cell culture growth and XF assay medium |
M50 Stereo microscope | Leica Microsytems | LEICAM50 | Stereo dissection micrscope; used for spheorid handling |
MCF-7 | ECACC | #86012803 | Breast adenocarcinoma cell line |
Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | Merck Life Science | O4876 | ATP Synthase Inhibitor |
Penicilin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Antibiotics added to cell culture medium |
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Initrogen | P7589 | Analysis of dsDNA in spehroids |
Rotenone | Merck Life Science | R8875 | Mitochondrial Respiratory Complex I Inhibitor |
RPMI 1640 | Gibco | 21875091 | Culture medium for A549, MCF7, and SK-OV-3 spheroids |
Seahorse Analytics | Agilent Technologies Inc. | Build 421 | https://seahorseanalytics.agilent.com |
Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak | Agilent Technologies Inc. | 102905-100 | Each Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak contains: 6 Seahorse XFe96 Spheroid Microplates (102978-100), 6 XFe96 sensor cartridges, and 1 bottle of Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL (100840-000) |
Serological pipette: 5, 10, and 25 mL | Greiner Bio-One | 606107; 607107; 760107 | Consumables for cell culture |
SK-OV-3 | ECACC | #HTB-77 | Ovarian adenocarcinoma cell line |
Sodium pyruvate (100 mM solution) | Merck Life Science | S8636 | Supplement for cell culture growth and XF assay medium |
T75 cm2 cell culture flask | Greiner Bio-One | 658175 | Tissue culture treated flasks for maintaining cell cultures |
TrypLExpress | Gibco | 12604-021 | Cell dissociation reagent |
Wave controller software | Agilent Technologies Inc. | – | |
Wide orifice tip | STARLAB International GmbH | E1011-8400 | Pipette tips with wide opening for spheroid handling |