JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Cancer Research

استكشاف استقلاب طاقة الميتوكوندريا من كرويات الأنسجة الدقيقة 3D واحدة باستخدام تحليل التدفق خارج الخلية

Published: February 03, 2022
doi:
10.3791/63346
, , , ,
1School of Biosciences,University of Birmingham, 2Nanomedicine, Drug Delivery & Nanotoxicology Lab, School of Pharmacy,University of Birmingham, 3Mitochondrial Profiling Centre,University of Birmingham

Summary

ستساعد هذه البروتوكولات المستخدمين على التحقيق في استقلاب طاقة الميتوكوندريا في الكرويات المشتقة من خط الخلايا السرطانية 3D باستخدام تحليل التدفق خارج الخلية من فرس البحر.

Abstract

أصبحت المجاميع الخلوية ثلاثية الأبعاد (3D) ، والتي يطلق عليها كرويات ، في طليعة زراعة الخلايا في المختبر في السنوات الأخيرة. على النقيض من زراعة الخلايا كطبقات أحادية ثنائية الأبعاد وأحادية الخلية (ثقافة 2D) ، فإن زراعة الخلايا الكروية تعزز وتنظم وتدعم البنية الخلوية الفسيولوجية والخصائص الموجودة في الجسم الحي ، بما في ذلك التعبير عن بروتينات المصفوفة خارج الخلية ، وإشارات الخلية ، والتعبير الجيني ، وإنتاج البروتين ، والتمايز ، والانتشار. تم الاعتراف بأهمية ثقافة 3D في العديد من المجالات البحثية ، بما في ذلك علم الأورام والسكري وبيولوجيا الخلايا الجذعية وهندسة الأنسجة. على مدى العقد الماضي ، تم تطوير طرق محسنة لإنتاج الكرويات وتقييم وظيفتها الأيضية ومصيرها.

تم استخدام محللات التدفق خارج الخلية (XF) لاستكشاف وظيفة الميتوكوندريا في الأنسجة الدقيقة ثلاثية الأبعاد مثل الكرويات باستخدام إما لوحة التقاط جزيرة XF24 أو صفيحة كروية XFe96. ومع ذلك ، لم يتم وصف البروتوكولات المتميزة وتحسين استقلاب طاقة الميتوكوندريا في الكرويات باستخدام تقنية XF بالتفصيل. يقدم هذا البحث بروتوكولات مفصلة للتحقيق في استقلاب طاقة الميتوكوندريا في كرويات 3D واحدة باستخدام لوحات كروية كروية مع محلل XFe96 XF. باستخدام خطوط الخلايا السرطانية المختلفة ، أثبتت تقنية XF أنها قادرة على التمييز بين التنفس الخلوي في كرويات 3D ليس فقط بأحجام مختلفة ولكن أيضا بأحجام مختلفة وأرقام خلايا ومحتوى الحمض النووي ونوعه.

يتم استخدام تركيزات مركب تأثير الميتوكوندريا الأمثل من oligomycin, BAM15, rotenone, and antimycin A للتحقيق في معلمات محددة من استقلاب طاقة الميتوكوندريا في كرويات ثلاثية الأبعاد. تناقش هذه الورقة أيضا طرق تطبيع البيانات التي تم الحصول عليها من الكرويات وتتناول العديد من الاعتبارات التي يجب مراعاتها عند استكشاف التمثيل الغذائي الكروي باستخدام تقنية XF. سيساعد هذا البروتوكول في دفع البحث في النماذج الكروية المتقدمة في المختبر .

Introduction

التقدم في النماذج المخبرية في البحوث البيولوجية قد تقدم بسرعة على مدى السنوات ال 20 الماضية. وتشمل هذه النماذج الآن طرائق العضوية على رقاقة ، والأعضاء العضوية ، وكرويات الأنسجة الدقيقة 3D ، وكلها أصبحت تركيزا مشتركا لتحسين الترجمة بين الدراسات في المختبر وفي الجسم الحي. يمتد استخدام النماذج المتقدمة في المختبر ، وخاصة الكروية ، إلى العديد من المجالات البحثية ، بما في ذلك هندسة الأنسجة ، وأبحاث الخلايا الجذعية ، والسرطان ، وبيولوجيا الأمراض1،2،3،4،5،6،7 ، واختبار السلامة ، بما في ذلك علم السموم الوراثي8،9،10 ، علم السموم للمواد النانوية 11 ، 12,13,14، واختبار سلامة الأدوية وفعاليتها 8,15,16,17,18,19.

مورفولوجيا الخلية الطبيعية أمر بالغ الأهمية للنمط الظاهري البيولوجي والنشاط. تسمح زراعة الخلايا في كرويات الأنسجة الدقيقة 3D للخلايا باعتماد مورفولوجيا ، ووظيفة النمط الظاهري ، والهندسة المعمارية ، أقرب إلى تلك التي لوحظت في الجسم الحي ولكن من الصعب التقاطها باستخدام تقنيات زراعة الخلايا أحادية الطبقة الكلاسيكية. في كل من الجسم الحي والمختبر ، تتأثر الوظيفة الخلوية بشكل مباشر بالبيئة الدقيقة الخلوية ، والتي لا تقتصر على الاتصالات الخلوية والبرمجة (على سبيل المثال ، تكوينات تقاطع الخلايا الخلوية ، وفرص تشكيل منافذ الخلية) ؛ تعرض الخلايا للهرمونات وعوامل النمو في البيئات المباشرة (على سبيل المثال ، التعرض الخلوي للسيتوكين كجزء من الاستجابة الالتهابية) ؛ تكوين المصفوفات الفيزيائية والكيميائية (على سبيل المثال ، ما إذا كانت الخلايا تزرع في البلاستيك المزروع بالأنسجة الصلبة أو بيئة الأنسجة المرنة) ؛ والأهم من ذلك ، كيف يتأثر التمثيل الغذائي الخلوي بالتغذية والحصول على الأكسجين وكذلك معالجة منتجات النفايات الأيضية مثل حمض اللاكتيك.

تحليل التدفق الأيضي هو وسيلة قوية لفحص التمثيل الغذائي الخلوي داخل أنظمة المختبر المحددة. وعلى وجه التحديد، تسمح تقنية XF بتحليل التغيرات الحية في الوقت الفعلي في الطاقة الحيوية الخلوية للخلايا والأنسجة السليمة. بالنظر إلى أن العديد من الأحداث الأيضية داخل الخلايا تحدث في غضون ثوان إلى دقائق ، فإن النهج الوظيفية في الوقت الفعلي لها أهمية قصوى لفهم التغيرات في الوقت الفعلي في التدفق الأيضي الخلوي في الخلايا والأنسجة السليمة في المختبر.

تقدم هذه الورقة بروتوكولات لزراعة خطوط الخلايا المشتقة من السرطان A549 (السرطان الغدي الرئوي) ، HepG2 / C3A (سرطان الخلايا الكبدية) ، MCF-7 (سرطان الثدي الغدي) ، و SK-OV-3 (سرطان المبيض الغدي) كما هو الحال في نماذج كروية ثلاثية الأبعاد في المختبر باستخدام نهج التجميع القسري (الشكل 1). كما يصف (i) بالتفصيل كيفية التحقيق في استقلاب طاقة الميتوكوندريا للكرويات ثلاثية الأبعاد المفردة باستخدام محلل Agilent XFe96 XF ، (ii) يسلط الضوء على طرق تحسين اختبارات XF باستخدام كرويات 3D واحدة ، و (iii) يناقش الاعتبارات والقيود المهمة للتحقيق في التمثيل الغذائي الكروي ثلاثي الأبعاد باستخدام هذا النهج. الأهم من ذلك ، تصف هذه الورقة كيفية جمع مجموعات البيانات التي تسمح بحساب معدل استهلاك الأكسجين (OCR) لتحديد الفسفرة التأكسدية وبالتالي وظيفة الميتوكوندريا في الكرويات الخلوية. على الرغم من عدم تحليله لهذا البروتوكول ، إلا أن معدل التحمض خارج الخلية (ECAR) هو معلمة أخرى يتم قياسها جنبا إلى جنب مع بيانات OCR في تجارب XF. ومع ذلك، غالبا ما يتم تفسير ECAR بشكل سيئ أو غير صحيح من مجموعات بيانات XF. نحن نقدم تعليقا على قيود حساب ECAR باتباع الأساليب الأساسية من الشركة المصنعة للتكنولوجيا.

Protocol

الشكل 1: سير العمل الرسومي لتوليد الكرويات الخلوية وتحليل التدفق خارج الخلية والمقايسات النهائية. تم استزراع أربعة خطوط خلايا سرطانية بشكل انتقائي كطبقات أحادية (A) ، منفصلة عن قوارير ?…

Representative Results

للحصول على كرويات مدمجة جيدة التكوين ، تم تحسين كل خط خلية بشكل فردي لكثافة البذر ومدة الزراعة (الشكل 3). شكلت خطوط الخلايا A549 و HepG2 / C3A و SK-OV-3 في البداية مجاميع فضفاضة لم تتطور إلى كرويات مستديرة ذات محيط محدد بوضوح إلا بعد 7 أيام في الثقافة. على العكس من ذلك ، يمكن أن تشكل خلاي?…

Discussion

ثالثا – النتائج والنواتج الرئيسية
توفر هذه الورقة بروتوكولا مفصلا للتحقيق في استقلاب طاقة الميتوكوندريا للكرويات المفردة 3D باستخدام سلسلة من خطوط الخلايا المشتقة من السرطان مع محلل XFe96 XF. تم تطوير ووصف طريقة للزراعة السريعة للكرويات الخلوية A549 و HepG2 / C3A و MCF7 و SK-OV-3 باستخدام تقني?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم دعم N.J.C بجائزة قضية BBSRC MIBTP مع Sygnature Discovery Ltd (BB / M01116X / 1 ، 1940003)

Materials

A549 ECACC  #86012804 Lung carcinoma cell line
Agilent Seahorse XF RPMI Medium, pH 7.4 Agilent Technologies Inc. 103576-100 XF assay medium with 1 mM HEPES, without phenol red, sodium bicarbonate, glucose, L-glutamine, and sodium pyruvate
Agilent Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer Agilent Technologies Inc. – Instrument for measuring rates of spheroid oxygen uptake in single spheroids
Antimycin A Merck Life Science A8674 Mitochondrial respiratory complex III inhibitor
BAM15 TOCRIS bio-techne 5737 Mitochondrial protnophore uncoupler
Black-walled microplate Greiner Bio-One 655076 For fluorescence-based assays
CELLSTAR cell-repellent surface 96 U well microplates Greiner Bio-One 650970 Microplates for generating spheroids
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay Promega G9681 Assay for the determination of cell viability in 3D microtissue spheroids
Cultrex Poly-D-Lysine R&D Systems a biotechne brand 3439-100-01 Molecular cell adhesive for coating XFe96 spheroid microplates to facillitate attachment of spheroids
D-(+)-Glucose Merck Life Sciences G8270 Supplement for cell culture growth and XF assay medium
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11885084 Culture medium for HepG2/C3A spheroids
EVOS XL Core Imaging System Thermo Fisher Scientific AMEX1000 Phase-contrast imaging microscope
EZ-PCR Mycoplasma test kit Biological Industries 20-700-20 Mycoplasma screening in cell cultures
FIJI Is Just Image J Analysis of collated images
Foetal bovine serum Merck Life Science F7524 Supplement for cell culture medium
HepG2/C3A ATCC  #CRL-10741 Hepatic carcinoma cell line, a clonal derivative of the parent HepG2 cell line
Lactate-Glo Promega J5021 Assay for measurement of lactate within spheorid culture medium
L-glutamine (200 mM solution) Merk Life Sciences G7513 Supplement for cell culture growth and XF assay medium
M50 Stereo microscope Leica Microsytems LEICAM50 Stereo dissection micrscope; used for spheorid handling
MCF-7 ECACC #86012803 Breast adenocarcinoma cell line
Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes Merck Life Science O4876 ATP Synthase Inhibitor
Penicilin-Streptomycin Gibco 15140122 Antibiotics added to cell culture medium
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit Initrogen P7589 Analysis of dsDNA in spehroids
Rotenone Merck Life Science R8875 Mitochondrial Respiratory Complex I Inhibitor
RPMI 1640 Gibco 21875091 Culture medium for A549, MCF7, and SK-OV-3 spheroids
Seahorse Analytics Agilent Technologies Inc. Build 421 https://seahorseanalytics.agilent.com
Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak Agilent Technologies Inc. 102905-100 Each Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak contains: 6 Seahorse XFe96 Spheroid Microplates (102978-100), 6 XFe96 sensor cartridges, and 1 bottle of Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL (100840-000)
Serological pipette: 5, 10, and 25 mL Greiner Bio-One 606107; 607107; 760107 Consumables for cell culture
SK-OV-3 ECACC  #HTB-77 Ovarian adenocarcinoma cell line
Sodium pyruvate (100 mM solution) Merck Life Science S8636 Supplement for cell culture growth and XF assay medium
T75 cm2 cell culture flask Greiner Bio-One 658175 Tissue culture treated flasks for maintaining cell cultures
TrypLExpress Gibco 12604-021 Cell dissociation reagent
Wave controller software Agilent Technologies Inc. –
Wide orifice tip STARLAB International GmbH E1011-8400 Pipette tips with wide opening for spheroid handling
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Correa de Sampaio, P., et al. A heterogeneous in vitro three dimensional model of tumour-stroma interactions regulating sprouting angiogenesis. PLoS One. 7 (2), 30753 (2012).
  2. Amann, A., et al. Development of an innovative 3D cell culture system to study tumour-stroma interactions in non-small cell lung cancer cells. PLoS One. 9 (3), 92511 (2014).
  3. Russell, S., Wojtkowiak, J., Neilson, A., Gillies, R. J. Metabolic profiling of healthy and cancerous tissues in 2D and 3D. Scientific Reports. 7 (1), 15285 (2017).
  4. Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 6, 19103 (2016).
  5. Song, Y., et al. Patient-derived multicellular tumor spheroids towards optimized treatment for patients with hepatocellular carcinoma. Journal of Experimental and Clinica Cancer Research. 37 (1), 109 (2018).
  6. Courau, T., et al. Cocultures of human colorectal tumor spheroids with immune cells reveal the therapeutic potential of MICA/B and NKG2A targeting for cancer treatment. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 7 (1), 74 (2019).
  7. Ivanova, E., et al. Use of ex vivo patient-derived tumor organotypic spheroids to identify combination therapies for HER2 mutant non-small cell lung cancer. Clinical Cancer Research. 26 (10), 2393-2403 (2020).
  8. Mandon, M., Huet, S., Dubreil, E., Fessard, V., Le Hegarat, L. Three-dimensional HepaRG spheroids as a liver model to study human genotoxicity in vitro with the single cell gel electrophoresis assay. Scientific Reports. 9 (1), 10548 (2019).
  9. Stampar, M., et al. Hepatocellular carcinoma (HepG2/C3A) cell-based 3D model for genotoxicity testing of chemicals. Science of the Total Environment. 755, 143255 (2020).
  10. Coltman, N. J., et al. Application of HepG2/C3A liver spheroids as a model system for genotoxicity studies. Toxicology Letters. 345, 34-45 (2021).
  11. Tchoryk, A., et al. Penetration and uptake of nanoparticles in 3D tumor spheroids. Bioconjugate Chemistry. 30 (5), 1371-1384 (2019).
  12. Leite, P. E. C., et al. Suitability of 3D human brain spheroid models to distinguish toxic effects of gold and poly-lactic acid nanoparticles to assess biocompatibility for brain drug delivery. Partical Fibre Toxicology. 16 (1), 22 (2019).
  13. Elje, E., et al. Hepato(Geno)toxicity assessment of nanoparticles in a HepG2 liver spheroid model. Nanomaterials. 10 (3), 545 (2020).
  14. Conway, G. E., et al. Adaptation of the in vitro micronucleus assay for genotoxicity testing using 3D liver models supporting longer-term exposure durations. Mutagenesis. 35 (4), 319-330 (2020).
  15. Wang, Z., et al. HepaRG culture in tethered spheroids as an in vitro three-dimensional model for drug safety screening. Journal of Applied Toxicology. 35 (8), 909-917 (2015).
  16. Proctor, W. R., et al. Utility of spherical human liver microtissues for prediction of clinical drug-induced liver injury. Archives of Toxicology. 91 (8), 2849-2863 (2017).
  17. Basharat, A., Rollison, H. E., Williams, D. P., Ivanov, D. P. HepG2 (C3A) spheroids show higher sensitivity compared to HepaRG spheroids for drug-induced liver injury (DILI). Toxicology and Applied Pharmacology. 408, 115279 (2020).
  18. Benning, L., Peintner, A., Finkenzeller, G., Peintner, L. Automated spheroid generation, drug application and efficacy screening using a deep learning classification: a feasibility study. Scientific Reports. 10 (1), 11071 (2020).
  19. Mittler, F., et al. High-content monitoring of drug effects in a 3D spheroid model. Frontiers in Oncology. 7, 293 (2017).
  20. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. The Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  21. Benz, R., McLaughlin, S. The molecular mechanism of action of the proton ionophore FCCP (carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone). Biophysical Journal. 41 (3), 381-398 (1983).
  22. Kasianowicz, J., Benz, R., McLaughlin, S. The kinetic mechanism by which CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone) transports protons across membranes. The Journal of Membrane Biology. 82 (2), 179-190 (1984).
  23. Kenwood, B. M., et al. Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane. Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2013).
  24. Mitchell, P. Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transfer by a chemi-osmotic type of mechanism. Nature. 191, 144-148 (1961).
  25. Alexopoulos, S. J., et al. Mitochondrial uncoupler BAM15 reverses diet-induced obesity and insulin resistance in mice. Nature Communications. 11 (1), 2397 (2020).
  26. Chen, S. -. Y., et al. Mitochondrial uncoupler SHC517 reverses obesity in mice without affecting food intake. Metabolism – Clinical and Experimental. 117, 154724 (2021).
  27. Goedeke, L., Shulman, G. I. Therapeutic potential of mitochondrial uncouplers for the treatment of metabolic associated fatty liver disease and NASH. Molecular Metabolism. 46, 101178 (2021).
  28. Hill, B. G., et al. Integration of cellular bioenergetics with mitochondrial quality control and autophagy. Biological chemistry. 393 (12), 1485-1512 (2012).
  29. Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: a key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795 (2019).
  30. Wang, J., et al. Uncoupling effect of F16 is responsible for its mitochondrial toxicity and anticancer activity. Toxicological Sciences. 161 (2), 431-442 (2018).
  31. Tretter, L., Chinopoulos, C., Adam-Vizi, V. Plasma membrane depolarization and disturbed Na+ homeostasis induced by the protonophore carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxyphenyl-hydrazon in isolated nerve terminals. Molecular Pharmacology. 53 (4), 734-741 (1998).
  32. Connop, B. P., Thies, R. L., Beyreuther, K., Ida, N., Reiner, P. B. Novel effects of FCCP [carbonyl cyanide p-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone] on amyloid precursor protein processing. Journal of neurochemistry. 72 (4), 1457-1465 (1999).
  33. Stöckl, P., et al. Partial uncoupling of oxidative phosphorylation induces premature senescence in human fibroblasts and yeast mother cells. Free Radical Biology and Medicine. 43 (6), 947-958 (2007).
  34. Firsov, A. M., et al. Protonophoric action of BAM15 on planar bilayers, liposomes, mitochondria, bacteria and neurons. Bioelectrochemistry. 137, 107673 (2021).
  35. Dranka, B. P., Hill, B. G., Darley-Usmar, V. M. Mitochondrial reserve capacity in endothelial cells: The impact of nitric oxide and reactive oxygen species. Free Radical Biology and Medicine. 48 (7), 905-914 (2010).
  36. Eilenberger, C., Rothbauer, M., Ehmoser, E. K., Ertl, P., Kupcu, S. Effect of spheroidal age on sorafenib diffusivity and toxicity in a 3D HepG2 spheroid model. Scientific Reports. 9 (1), 4863 (2019).
  37. vanden Brand, D., Veelken, C., Massuger, L., Brock, R. Penetration in 3D tumor spheroids and explants: Adding a further dimension to the structure-activity relationship of cell-penetrating peptides. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1860 (6), 1342-1349 (2018).
  38. Niora, M., et al. Head-to-head comparison of the penetration efficiency of lipid-based nanoparticles into tumor spheroids. ACS Omega. 5 (33), 21162-21171 (2020).
  39. Millard, M., et al. Drug delivery to solid tumors: the predictive value of the multicellular tumor spheroid model for nanomedicine screening. International Journal of Nanomedicine. 12, 7993-8007 (2017).
  40. Ruas, J. S., et al. Underestimation of the maximal capacity of the mitochondrial electron transport system in oligomycin-treated cells. PLoS One. 11 (3), 0150967 (2016).
  41. Benton, G., DeGray, G., Kleinman, H. K., George, J., Arnaoutova, I. In vitro microtumors provide a physiologically predictive tool for breast cancer therapeutic screening. PLoS One. 10 (4), 0123312 (2015).
  42. Hirpara, J., et al. Metabolic reprogramming of oncogene-addicted cancer cells to OXPHOS as a mechanism of drug resistance. Redox Biology. 25, 101076 (2019).
  43. Ware, M. J., et al. Generation of homogenous three-dimensional pancreatic cancer cell spheroids using an improved hanging drop technique. Tissue Engineering. Part C, Methods. 22 (4), 312-321 (2016).
  44. Song, Y., et al. TGF-β-independent CTGF induction regulates cell adhesion mediated drug resistance by increasing collagen I in HCC. Oncotarget. 8 (13), 21650-21662 (2017).
  45. Wrzesinski, K., et al. HepG2/C3A 3D spheroids exhibit stable physiological functionality for at least 24 days after recovering from trypsinisation. Toxicology Research. 2 (3), 163-172 (2013).
  46. Gaskell, H., et al. Characterization of a functional C3A liver spheroid model. Toxicology Research. 5 (4), 1053-1065 (2016).
  47. Takahashi, Y., et al. 3D spheroid cultures improve the metabolic gene expression profiles of HepaRG cells. Bioscience Reports. 35 (3), 00208 (2015).
  48. Hendriks, D. F. G., Puigvert, L. F., Messner, S., Mortiz, W., Ingelman-Sundberg, M. Hepatic 3D spheroid models for the detection and study of compounds with cholestatic liability. Scientific Reports. 6, 35434 (2016).
  49. Leung, B. M., Lesher-Perez, S. C., Matsuoka, T., Moraes, C., Takayama, S. Media additives to promote spheroid circularity and compactness in hanging drop platform. Biomaterials Science. 3 (2), 336-344 (2015).
  50. Cavo, M., et al. A synergic approach to enhance long-term culture and manipulation of MiaPaCa-2 pancreatic cancer spheroids. Scientific Reports. 10 (1), 10192 (2020).
  51. Carlsson, J., Yuhas, J. M. Liquid-overlay culture of cellular spheroids. Recent Results in Cancer Research. 95, 1-23 (1984).
  52. Costa, E. C., Gaspar, V. M., Coutinho, P., Correia, I. J. Optimization of liquid overlay technique to formulate heterogenic 3D co-cultures models. Biotechnology and Bioengineering. 111 (8), 1672-1685 (2014).
  53. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
  54. Zhang, X. D., et al. The use of strictly standardized mean difference for hit selection in primary RNA interference high-throughput screening experiments. Journal of Biomolecular Screening. 12 (4), 497-509 (2007).
  55. Yepez, V. A., et al. OCR-Stats: Robust estimation and statistical testing of mitochondrial respiration activities using Seahorse XF Analyzer. PLoS One. 13 (7), 0199938 (2018).
  56. Silva, L. P., et al. Measurement of DNA concentration as a normalization strategy for metabolomic data from adherent cell lines. Analytical Chemistry. 85 (20), 9536-9542 (2013).

Tags

Mitochondrial Energy MetabolismExtracellular Flux AnalysisCell LinesCell NumbersPhenotypesDrug TreatmentsDrug DiscoveryCancer ResearchIn Vitro SpheroidsSpheroid ViabilitySensor CartridgeCalibrantAssay KitPoly-D-LysineXF RPMI Medium
check_url/63346?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Coltman, N. J., Rochford, G., Hodges, N. J., Ali-Boucetta, H., Barlow, J. P. Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis. J. Vis. Exp. (180), e63346, doi:10.3791/63346 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image