Exploration du métabolisme énergétique mitochondrial des sphéroïdes de microtissu 3D uniques à l’aide de l’analyse du flux extracellulaire
Summary
Ces protocoles aideront les utilisateurs à sonder le métabolisme énergétique mitochondrial dans les sphéroïdes dérivés de lignées cellulaires cancéreuses 3D à l’aide de l’analyse du flux extracellulaire Seahorse.
Abstract
Les agrégats cellulaires tridimensionnels (3D), appelés sphéroïdes, sont devenus l’avant-garde de la culture cellulaire in vitro ces dernières années. Contrairement à la culture de cellules en tant que monocouches unicellulaires bidimensionnelles (culture 2D), la culture de cellules sphéroïdes favorise, régule et soutient l’architecture cellulaire physiologique et les caractéristiques qui existent in vivo, y compris l’expression des protéines de matrice extracellulaire, la signalisation cellulaire, l’expression génique, la production de protéines, la différenciation et la prolifération. L’importance de la culture 3D a été reconnue dans de nombreux domaines de recherche, notamment l’oncologie, le diabète, la biologie des cellules souches et le génie tissulaire. Au cours de la dernière décennie, des méthodes améliorées ont été développées pour produire des sphéroïdes et évaluer leur fonction métabolique et leur devenir.
Les analyseurs de flux extracellulaire (XF) ont été utilisés pour explorer la fonction mitochondriale dans des microtissus 3D tels que les sphéroïdes à l’aide d’une plaque de capture d’îlot XF24 ou d’une microplaque sphéroïde XFe96. Cependant, des protocoles distincts et l’optimisation du métabolisme énergétique mitochondrial sondant chez les sphéroïdes à l’aide de la technologie XF n’ont pas été décrits en détail. Cet article fournit des protocoles détaillés pour sonder le métabolisme énergétique mitochondrial dans des sphéroïdes 3D uniques à l’aide de microplaques sphéroïdes avec l’analyseur XFe96 XF. En utilisant différentes lignées cellulaires cancéreuses, il est démontré que la technologie XF est capable de distinguer la respiration cellulaire dans les sphéroïdes 3D de différentes tailles, mais aussi de différents volumes, numéros de cellules, contenu et type d’ADN.
Les concentrations optimales de composé effecteur mitochondrial d’oligomycine, de BAM15, de roténone et d’antimycine A sont utilisées pour sonder des paramètres spécifiques du métabolisme énergétique mitochondrial dans les sphéroïdes 3D. Cet article traite également des méthodes permettant de normaliser les données obtenues à partir de sphéroïdes et aborde de nombreuses considérations qui devraient être prises en compte lors de l’exploration du métabolisme des sphéroïdes à l’aide de la technologie XF. Ce protocole aidera à stimuler la recherche sur des modèles avancés de sphéroïdes in vitro .
Introduction
Les progrès des modèles in vitro dans la recherche biologique ont progressé rapidement au cours des 20 dernières années. Ces modèles incluent désormais des modalités d’organe sur puce, des organoïdes et des sphéroïdes de microtissus 3D, qui sont tous devenus un objectif commun pour améliorer la traduction entre les études in vitro et in vivo. L’utilisation de modèles in vitro avancés, en particulier les sphéroïdes, couvre plusieurs domaines de recherche, notamment l’ingénierie tissulaire, la recherche sur les cellules souches, le cancer et la biologie des maladies 1,2,3,4,5,6,7, et les tests de sécurité, y compris la toxicologie génétique 8,9,10, la toxicologie des nanomatériaux 11, 12,13,14, et tests d’innocuité et d’efficacité des médicaments 8,15,16,17,18,19.
La morphologie cellulaire normale est essentielle au phénotype et à l’activité biologiques. Cultiver des cellules en sphéroïdes de microtissus 3D permet aux cellules d’adopter une morphologie, une fonction phénotypique et une architecture, plus proches de celles observées in vivo mais difficiles à capturer avec les techniques classiques de culture cellulaire monocouche. Tant in vivo qu’in vitro, la fonction cellulaire est directement affectée par le microenvironnement cellulaire, qui ne se limite pas à la communication et à la programmation cellulaires (p. ex., formations de jonctions cellule-cellule, possibilités de former des niches cellulaires); l’exposition cellulaire aux hormones et aux facteurs de croissance dans les environnements immédiats (p. ex., exposition aux cytokines cellulaires dans le cadre d’une réponse inflammatoire); la composition des matrices physiques et chimiques (p. ex., si les cellules sont cultivées dans un plastique de culture tissulaire rigide ou dans un environnement tissulaire élastique); et surtout, comment le métabolisme cellulaire est affecté par la nutrition et l’accès à l’oxygène ainsi que par le traitement des déchets métaboliques tels que l’acide lactique.
L’analyse du flux métabolique est un moyen puissant d’examiner le métabolisme cellulaire dans des systèmes in vitro définis. Plus précisément, la technologie XF permet d’analyser les changements en direct et en temps réel dans la bioénergétique cellulaire des cellules et des tissus intacts. Étant donné que de nombreux événements métaboliques intracellulaires se produisent dans l’ordre de quelques secondes à quelques minutes, les approches fonctionnelles en temps réel sont primordiales pour comprendre les changements en temps réel du flux métabolique cellulaire dans les cellules et les tissus intacts in vitro.
Cet article fournit des protocoles pour la culture des lignées cellulaires dérivées du cancer A549 (adénocarcinome pulmonaire), HepG2/C3A (carcinome hépatocellulaire), MCF-7 (adénocarcinome du sein) et SK-OV-3 (adénocarcinome ovarien) en tant que modèles sphéroïdes 3D in vitro utilisant des approches d’agrégation forcée (Figure 1). Il décrit également en détail comment sonder le métabolisme énergétique mitochondrial de sphéroïdes 3D uniques à l’aide de l’analyseur Agilent XFe96 XF, (ii) met en évidence les moyens d’optimiser les tests XF à l’aide de sphéroïdes 3D uniques, et (iii) discute des considérations et des limites importantes de la sonde du métabolisme des sphéroïdes 3D à l’aide de cette approche. Plus important encore, cet article décrit comment sont collectés des ensembles de données qui permettent le calcul du taux de consommation d’oxygène (OCR) pour déterminer la phosphorylation oxydative et donc la fonction mitochondriale dans les sphéroïdes cellulaires. Bien qu’il ne soit pas analysé pour ce protocole, le taux d’acidification extracellulaire (ECAR) est un autre paramètre mesuré aux côtés des données OCR dans les expériences XF. Cependant, ECAR est souvent mal ou mal interprété à partir des jeux de données XF. Nous fournissons un commentaire sur les limites du calcul de l’ECAR en suivant les approches de base du fabricant de la technologie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Principales constatations et extrants
Cet article fournit un protocole détaillé pour sonder le métabolisme énergétique mitochondrial de sphéroïdes 3D uniques à l’aide d’une série de lignées cellulaires dérivées du cancer avec l’analyseur XFe96 XF. Une méthode est développée et décrite pour la culture rapide des sphéroïdes cellulaires A549, HepG2/C3A, MCF7 et SK-OV-3 en utilisant des technologies d’hydrofuge cellulaire pour l’agrégation forcée. Ce protocole aborde de nombr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
N.J.C a reçu un BBSRC MIBTP CASE Award avec Sygnature Discovery Ltd (BB/M01116X/1, 1940003)
Materials
| A549 | ECACC | #86012804 | Lung carcinoma cell line |
| Agilent Seahorse XF RPMI Medium, pH 7.4 | Agilent Technologies Inc. | 103576-100 | XF assay medium with 1 mM HEPES, without phenol red, sodium bicarbonate, glucose, L-glutamine, and sodium pyruvate |
| Agilent Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer | Agilent Technologies Inc. | – | Instrument for measuring rates of spheroid oxygen uptake in single spheroids |
| Antimycin A | Merck Life Science | A8674 | Mitochondrial respiratory complex III inhibitor |
| BAM15 | TOCRIS bio-techne | 5737 | Mitochondrial protnophore uncoupler |
| Black-walled microplate | Greiner Bio-One | 655076 | For fluorescence-based assays |
| CELLSTAR cell-repellent surface 96 U well microplates | Greiner Bio-One | 650970 | Microplates for generating spheroids |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9681 | Assay for the determination of cell viability in 3D microtissue spheroids |
| Cultrex Poly-D-Lysine | R&D Systems a biotechne brand | 3439-100-01 | Molecular cell adhesive for coating XFe96 spheroid microplates to facillitate attachment of spheroids |
| D-(+)-Glucose | Merck Life Sciences | G8270 | Supplement for cell culture growth and XF assay medium |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11885084 | Culture medium for HepG2/C3A spheroids |
| EVOS XL Core Imaging System | Thermo Fisher Scientific | AMEX1000 | Phase-contrast imaging microscope |
| EZ-PCR Mycoplasma test kit | Biological Industries | 20-700-20 | Mycoplasma screening in cell cultures |
| FIJI Is Just Image J | Analysis of collated images | ||
| Foetal bovine serum | Merck Life Science | F7524 | Supplement for cell culture medium |
| HepG2/C3A | ATCC | #CRL-10741 | Hepatic carcinoma cell line, a clonal derivative of the parent HepG2 cell line |
| Lactate-Glo | Promega | J5021 | Assay for measurement of lactate within spheorid culture medium |
| L-glutamine (200 mM solution) | Merk Life Sciences | G7513 | Supplement for cell culture growth and XF assay medium |
| M50 Stereo microscope | Leica Microsytems | LEICAM50 | Stereo dissection micrscope; used for spheorid handling |
| MCF-7 | ECACC | #86012803 | Breast adenocarcinoma cell line |
| Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | Merck Life Science | O4876 | ATP Synthase Inhibitor |
| Penicilin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Antibiotics added to cell culture medium |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Initrogen | P7589 | Analysis of dsDNA in spehroids |
| Rotenone | Merck Life Science | R8875 | Mitochondrial Respiratory Complex I Inhibitor |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875091 | Culture medium for A549, MCF7, and SK-OV-3 spheroids |
| Seahorse Analytics | Agilent Technologies Inc. | Build 421 | https://seahorseanalytics.agilent.com |
| Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak | Agilent Technologies Inc. | 102905-100 | Each Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak contains: 6 Seahorse XFe96 Spheroid Microplates (102978-100), 6 XFe96 sensor cartridges, and 1 bottle of Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL (100840-000) |
| Serological pipette: 5, 10, and 25 mL | Greiner Bio-One | 606107; 607107; 760107 | Consumables for cell culture |
| SK-OV-3 | ECACC | #HTB-77 | Ovarian adenocarcinoma cell line |
| Sodium pyruvate (100 mM solution) | Merck Life Science | S8636 | Supplement for cell culture growth and XF assay medium |
| T75 cm2 cell culture flask | Greiner Bio-One | 658175 | Tissue culture treated flasks for maintaining cell cultures |
| TrypLExpress | Gibco | 12604-021 | Cell dissociation reagent |
| Wave controller software | Agilent Technologies Inc. | – | |
| Wide orifice tip | STARLAB International GmbH | E1011-8400 | Pipette tips with wide opening for spheroid handling |
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