Explorando el metabolismo energético mitocondrial de esferoides de microtissue 3D individuales utilizando el análisis de flujo extracelular
Summary
Estos protocolos ayudarán a los usuarios a sondear el metabolismo energético mitocondrial en esferoides derivados de líneas celulares de cáncer 3D utilizando el análisis de flujo extracelular Seahorse.
Abstract
Los agregados celulares tridimensionales (3D), denominados esferoides, se han convertido en la vanguardia del cultivo celular in vitro en los últimos años. En contraste con el cultivo de células como monocapas bidimensionales de una sola célula (cultivo 2D), el cultivo celular esferoide promueve, regula y apoya la arquitectura celular fisiológica y las características que existen in vivo, incluida la expresión de proteínas de matriz extracelular, señalización celular, expresión génica, producción de proteínas, diferenciación y proliferación. La importancia del cultivo 3D ha sido reconocida en muchos campos de investigación, incluyendo oncología, diabetes, biología de células madre e ingeniería de tejidos. Durante la última década, se han desarrollado métodos mejorados para producir esferoides y evaluar su función metabólica y destino.
Los analizadores de flujo extracelular (XF) se han utilizado para explorar la función mitocondrial en microtejidos 3D, como los esferoides, utilizando una placa de captura de islotes XF24 o una microplaca esferoide XFe96. Sin embargo, no se han descrito en detalle distintos protocolos y la optimización del sondeo del metabolismo energético mitocondrial en esferoides utilizando la tecnología XF. Este artículo proporciona protocolos detallados para sondear el metabolismo energético mitocondrial en esferoides 3D individuales utilizando microplacas esferoides con el analizador XFe96 XF. Utilizando diferentes líneas celulares de cáncer, se ha demostrado que la tecnología XF es capaz de distinguir entre la respiración celular en esferoides 3D no solo de diferentes tamaños, sino también de diferentes volúmenes, números de células, contenido y tipo de ADN.
Las concentraciones óptimas del compuesto efector mitocondrial de oligomicina, BAM15, rotenona y antimicina A se utilizan para sondear parámetros específicos del metabolismo energético mitocondrial en esferoides 3D. Este documento también discute los métodos para normalizar los datos obtenidos de los esferoides y aborda muchas consideraciones que deben considerarse al explorar el metabolismo de los esferoides utilizando la tecnología XF. Este protocolo ayudará a impulsar la investigación en modelos avanzados de esferoides in vitro .
Introduction
Los avances en los modelos in vitro en la investigación biológica han progresado rápidamente en los últimos 20 años. Tales modelos ahora incluyen modalidades de órgano en un chip, organoides y esferoides de microtejido 3D, todos los cuales se han convertido en un enfoque común para mejorar la traducción entre estudios in vitro e in vivo. El uso de modelos in vitro avanzados, particularmente esferoides, abarca varios campos de investigación, incluida la ingeniería de tejidos, la investigación con células madre, el cáncer y la biología de enfermedades 1,2,3,4,5,6,7 y las pruebas de seguridad, incluida la toxicología genética 8,9,10, la toxicología de nanomateriales 11, 12,13,14, y pruebas de seguridad y eficacia de medicamentos 8,15,16,17,18,19.
La morfología celular normal es crítica para el fenotipo y la actividad biológica. El cultivo de células en esferoides microtisulares 3D permite a las células adoptar una morfología, función fenotípica y arquitectura, más parecida a la observada in vivo pero difícil de capturar con las técnicas clásicas de cultivo celular monocapa. Tanto in vivo como in vitro, la función celular se ve directamente afectada por el microambiente celular, que no se limita a la comunicación y programación celular (por ejemplo, formaciones de unión célula-célula, oportunidades para formar nichos celulares); exposición celular a hormonas y factores de crecimiento en los entornos inmediatos (por ejemplo, exposición a citoquinas celulares como parte de una respuesta inflamatoria); composición de matrices físicas y químicas (por ejemplo, si las células se cultivan en plástico de cultivo de tejidos rígidos o en un entorno de tejido elástico); y lo más importante, cómo el metabolismo celular se ve afectado por la nutrición y el acceso al oxígeno, así como por el procesamiento de productos de desecho metabólicos como el ácido láctico.
El análisis de flujo metabólico es una forma poderosa de examinar el metabolismo celular dentro de sistemas in vitro definidos. Específicamente, la tecnología XF permite el análisis de cambios en vivo y en tiempo real en la bioenergética celular de células y tejidos intactos. Dado que muchos eventos metabólicos intracelulares ocurren del orden de segundos a minutos, los enfoques funcionales en tiempo real son primordiales para comprender los cambios en tiempo real en el flujo metabólico celular en células y tejidos intactos in vitro.
Este artículo proporciona protocolos para cultivar líneas celulares derivadas del cáncer A549 (adenocarcinoma de pulmón), HepG2/C3A (carcinoma hepatocelular), MCF-7 (adenocarcinoma de mama) y SK-OV-3 (adenocarcinoma de ovario) como modelos de esferoides 3D in vitro utilizando enfoques de agregación forzada (Figura 1). También (i) describe en detalle cómo sondear el metabolismo energético mitocondrial de esferoides 3D individuales utilizando el analizador XF Agilent XFe96, (ii) destaca formas de optimizar los ensayos XF utilizando esferoides 3D individuales, y (iii) discute consideraciones y limitaciones importantes de sondear el metabolismo de los esferoides 3D utilizando este enfoque. Lo más importante es que este artículo describe cómo se recopilan los conjuntos de datos que permiten el cálculo de la tasa de consumo de oxígeno (OCR) para determinar la fosforilación oxidativa y, por lo tanto, la función mitocondrial en los esferoides celulares. Aunque no se analiza para este protocolo, la tasa de acidificación extracelular (ECAR) es otro parámetro que se mide junto con los datos de OCR en experimentos XF. Sin embargo, ECAR a menudo se interpreta de manera deficiente o incorrecta a partir de conjuntos de datos XF. Proporcionamos un comentario sobre las limitaciones del cálculo de ECAR siguiendo los enfoques básicos del fabricante de la tecnología.
Protocol
Representative Results
Discussion
Principales conclusiones y productos
Este artículo proporciona un protocolo detallado para sondear el metabolismo energético mitocondrial de esferoides 3D individuales utilizando una serie de líneas celulares derivadas del cáncer con el analizador XFe96 XF. Se desarrolla y describe un método para el cultivo rápido de esferoides celulares A549, HepG2 /C3A, MCF7 y SK-OV-3 utilizando tecnologías repelentes celulares para la agregación forzada. Este protocolo aborda muchas consideraciones sobre el…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
N.J.C fue apoyado por un premio BBSRC MIBTP CASE con Sygnature Discovery Ltd (BB/M01116X/1, 1940003)
Materials
| A549 | ECACC | #86012804 | Lung carcinoma cell line |
| Agilent Seahorse XF RPMI Medium, pH 7.4 | Agilent Technologies Inc. | 103576-100 | XF assay medium with 1 mM HEPES, without phenol red, sodium bicarbonate, glucose, L-glutamine, and sodium pyruvate |
| Agilent Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer | Agilent Technologies Inc. | – | Instrument for measuring rates of spheroid oxygen uptake in single spheroids |
| Antimycin A | Merck Life Science | A8674 | Mitochondrial respiratory complex III inhibitor |
| BAM15 | TOCRIS bio-techne | 5737 | Mitochondrial protnophore uncoupler |
| Black-walled microplate | Greiner Bio-One | 655076 | For fluorescence-based assays |
| CELLSTAR cell-repellent surface 96 U well microplates | Greiner Bio-One | 650970 | Microplates for generating spheroids |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9681 | Assay for the determination of cell viability in 3D microtissue spheroids |
| Cultrex Poly-D-Lysine | R&D Systems a biotechne brand | 3439-100-01 | Molecular cell adhesive for coating XFe96 spheroid microplates to facillitate attachment of spheroids |
| D-(+)-Glucose | Merck Life Sciences | G8270 | Supplement for cell culture growth and XF assay medium |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11885084 | Culture medium for HepG2/C3A spheroids |
| EVOS XL Core Imaging System | Thermo Fisher Scientific | AMEX1000 | Phase-contrast imaging microscope |
| EZ-PCR Mycoplasma test kit | Biological Industries | 20-700-20 | Mycoplasma screening in cell cultures |
| FIJI Is Just Image J | Analysis of collated images | ||
| Foetal bovine serum | Merck Life Science | F7524 | Supplement for cell culture medium |
| HepG2/C3A | ATCC | #CRL-10741 | Hepatic carcinoma cell line, a clonal derivative of the parent HepG2 cell line |
| Lactate-Glo | Promega | J5021 | Assay for measurement of lactate within spheorid culture medium |
| L-glutamine (200 mM solution) | Merk Life Sciences | G7513 | Supplement for cell culture growth and XF assay medium |
| M50 Stereo microscope | Leica Microsytems | LEICAM50 | Stereo dissection micrscope; used for spheorid handling |
| MCF-7 | ECACC | #86012803 | Breast adenocarcinoma cell line |
| Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | Merck Life Science | O4876 | ATP Synthase Inhibitor |
| Penicilin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Antibiotics added to cell culture medium |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Initrogen | P7589 | Analysis of dsDNA in spehroids |
| Rotenone | Merck Life Science | R8875 | Mitochondrial Respiratory Complex I Inhibitor |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875091 | Culture medium for A549, MCF7, and SK-OV-3 spheroids |
| Seahorse Analytics | Agilent Technologies Inc. | Build 421 | https://seahorseanalytics.agilent.com |
| Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak | Agilent Technologies Inc. | 102905-100 | Each Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak contains: 6 Seahorse XFe96 Spheroid Microplates (102978-100), 6 XFe96 sensor cartridges, and 1 bottle of Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL (100840-000) |
| Serological pipette: 5, 10, and 25 mL | Greiner Bio-One | 606107; 607107; 760107 | Consumables for cell culture |
| SK-OV-3 | ECACC | #HTB-77 | Ovarian adenocarcinoma cell line |
| Sodium pyruvate (100 mM solution) | Merck Life Science | S8636 | Supplement for cell culture growth and XF assay medium |
| T75 cm2 cell culture flask | Greiner Bio-One | 658175 | Tissue culture treated flasks for maintaining cell cultures |
| TrypLExpress | Gibco | 12604-021 | Cell dissociation reagent |
| Wave controller software | Agilent Technologies Inc. | – | |
| Wide orifice tip | STARLAB International GmbH | E1011-8400 | Pipette tips with wide opening for spheroid handling |
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