Quantifizierung der subzellulären Glykogenverteilung in Skelettmuskelfasern mittels Transmissionselektronenmikroskopie

Summary

Ein modifiziertes Postfixationsverfahren erhöht den Kontrast von Glykogenpartikeln im Gewebe. Dieses Papier bietet ein Schritt-für-Schritt-Protokoll, das beschreibt, wie man mit dem Gewebe umgeht, die Bildgebung durchführt und sterelorische Methoden verwendet, um unvoreingenommene und quantitative Daten über die fasertypspezifische subzelluläre Glykogenverteilung in der Skelettmuskulatur zu erhalten.

Abstract

Mit Hilfe der Transmissionselektronenmikroskopie können hochauflösende Bilder von fixierten Proben mit einzelnen Muskelfasern gewonnen werden. Dies ermöglicht die Quantifizierung ultrastruktureller Aspekte wie Volumenanteile, Oberflächen-zu-Volumen-Verhältnisse, Morphometrie und physikalische Kontaktstellen verschiedener subzellulärer Strukturen. In den 1970er Jahren wurde ein Protokoll zur verstärkten Färbung von Glykogen in Zellen entwickelt, das den Weg für eine Reihe von Studien zur subzellulären Lokalisation von Glykogen und Glykogenpartikelgröße mittels Transmissionselektronenmikroskopie ebnete. Während die meisten Analysen Glykogen so interpretieren, als ob es homogen in den Muskelfasern verteilt wäre und nur einen einzigen Wert (z. B. eine durchschnittliche Konzentration) liefert, hat die Transmissionselektronenmikroskopie gezeigt, dass Glykogen als diskrete Glykogenpartikel gespeichert ist, die sich in verschiedenen subzellulären Kompartimenten befinden. Hier wird das Schritt-für-Schritt-Protokoll von der Gewebeentnahme bis zur quantitativen Bestimmung des Volumenanteils und des Partikeldurchmessers von Glykogen in den verschiedenen subzellulären Kompartimenten einzelner Skelettmuskelfasern beschrieben. Überlegungen zum 1) Sammeln und Färben von Gewebeproben, 2) Durchführen von Bildanalysen und Datenverarbeitung, 3) Bewerten der Genauigkeit von Schätzungen, 4) Unterscheiden zwischen Muskelfasertypen und 5) methodische Fallstricke und Einschränkungen sind enthalten.

Introduction

Glykogenpartikel bestehen aus verzweigten Polymeren der Glukose und verschiedenen assoziierten ^Proteinen1 und stellen einen wichtigen Brennstoff bei hohen Stoffwechselanforderungen ^dar2. Obwohl nicht allgemein anerkannt, stellen Glykogenpartikel auch einen lokalen Brennstoff dar, bei dem einige subzelluläre Prozesse trotz der Verfügbarkeit anderer und langlebigerer Brennstoffe wie Plasmaglukose und Fettsäuren bevorzugt Glykogen ^{verwenden3,4.}

Die Bedeutung der Speicherung von Glykogen als subzellulärer spezifischer lokalisierter Brennstoff wurde in mehreren ^{Übersichtsarbeiten5,6} diskutiert, die hauptsächlich auf einigen der frühesten Dokumentationen der subzellulären Verteilung von Glykogen durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)^7,8 basieren. Die ersten Studien verwendeten verschiedene Protokolle, um den Kontrast von Glykogen von histochemischen Färbetechniken zu negativen und positiven Färbungen zu ^erhöhen9,10. Eine wichtige methodische Weiterentwicklung war das verfeinerte Nachfixationsprotokoll mit dem kaliumferrocyanidreduzierten Osmium11,12,13,14^, das den Kontrast von Glykogenpartikeln signifikant verbesserte. Dieses verfeinerte Protokoll wurde bei einigen der Pionierarbeiten zur belastungsinduzierten Glykogenabbau15 nicht verwendet, sondern von Graham und Kollegen wieder ^{eingeführt16,17.}

Basierend auf den 2-dimensionalen Bildern wird die subzelluläre Verteilung von Glykogen am häufigsten als Glykogenpartikel beschrieben, die sich in drei Pools befinden: subsarkolemmal (direkt unter der Oberflächenmembran), intermyofibrillar (zwischen den Myofibrillen) oder intramyofibrillar (innerhalb der Myofibrillen). Glykogenpartikel könnten jedoch auch als assoziiert mit beispielsweise sarkoplasmatischem Retikulum7 oder ^Kernen18 beschrieben werden. Neben der subzellulären Verteilung besteht der Vorteil des TEM-geschätzten Glykogengehalts auch darin, dass die Quantifizierung auf Einzelfaserebene durchgeführt werden kann. Dies ermöglicht die Untersuchung der Faser-zu-Faser-Variabilität und korrelative Analysen mit Fasertypen und zellulären Komponenten wie Mitochondrien und Lipidtröpfchen.

Hier wird das Protokoll für den TEM-geschätzten fasertypspezifischen volumetrischen Gehalt der drei gemeinsamen subzellulären Glykogenpools (subsarkolemmal, intermyofibrillär und intramyofibrillär) in Skelettmuskelfasern beschrieben. Die Methode wurde auf die Skelettmuskulatur von ^Menschen19, Ratten20 und ^Mäusen21 angewendet; sowie Vögel und ^Fische22; und Kardiomyozyten von ^Ratten23.

Protocol

Das vorliegende Protokoll mit humanen biopsierten Skelettmuskelproben wurde von den Regionalkomitees für Gesundheitsforschungsethik für Süddänemark genehmigt (S-20170198). Muskelbiopsien wurden durch einen Schnitt in der Haut aus dem Musculus vastus lateralis unter Verwendung einer Bergström-Nadel mit Absaugung erhalten, nachdem die Lokalanästhesie subkutan verabreicht wurde (1-3 ml Lidocain 2% pro Einschnitt). Wenn isolierte ganze Rattenmuskeln verwendet wurden, wurden die Tiere durch Zervixdislokation ge…

Representative Results

Unter Verwendung dieses Protokolls erscheinen Glykogenpartikel schwarz und deutlich (Abbildungen 1 und Abbildung 2). Die Normalwerte von Glykogen sind in Abbildung 3 dargestellt. Diese Daten basieren auf insgesamt 362 Ballaststoffen von 41 gesunden jungen Männern, die in verschiedenen früheren Studien gesammelt wurden19,24,29,30,31.<…

Discussion

Der kritische Schritt der Methode ist die Verwendung von reduziertem Osmium durch Kaliumferrocyanid während der Postfixation. Die Selektivität dieses modifizierten Fixiermittels für den Glykogennachweis kann nicht vollständig durch die Chemie erklärt werden, sondern umfasst auch experimentelle Ergebnisse, die zeigen, dass solche Partikel in Geweben, von denen bekannt ist, dass sie frei von Glykogen sind, oder im extrazellulären Raum nicht nachgewiesen ^wurden11.

Kr…

Materials

1,2-Propylene oxide	Merck	75-56-9
Embedding 812 resin medium kit	Taab	T031
Glutaraldehyde solution 25%	Merck	1.04239.0250
ITEM	Olympus		Imaging software
Leica EM AC20	Leica		Automatic contrasting system
OSIS Veleta digital camera	Olympus
Osmium tetroxide 4% solution	Polysciences	0972A
Philips CM 100 Transmission EM	Philips
Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate	Sigma-Aldrich	455989-245G
Sodium cacodylatbuffer 0,2 M ph 7.4	Ampliqon.com	AMPQ40989.0500
Ultra-microtome Leica UC7	Leica
Ultrostain lead citrate 3%, stabilised solution	Leica	16707235
Uranyl acetate dihydrate	Polysciences	6159-44-0