Количественная оценка распределения субклеточного гликогена в волокнах скелетных мышц с помощью просвечивающей электронной микроскопии

Summary

Модифицированная процедура постфиксации увеличивает контраст частиц гликогена в ткани. В этой статье представлен пошаговый протокол, описывающий, как обращаться с тканью, проводить визуализацию и использовать стереологические методы для получения объективных и количественных данных о распределении субклеточного гликогена в скелетных мышцах.

Abstract

С помощью просвечивающей электронной микроскопии можно получить изображения с высоким разрешением неподвижных образцов, содержащих отдельные мышечные волокна. Это позволяет количественно оценивать ультраструктурные аспекты, такие как объемные фракции, отношение площади поверхности к объему, морфометрия и физические контакты различных субклеточных структур. В 1970-х годах был разработан протокол усиленного окрашивания гликогена в клетках, который проложил путь для серии исследований субклеточной локализации гликогена и размера частиц гликогена с использованием просвечивающей электронной микроскопии. В то время как большинство анализов интерпретируют гликоген так, как если бы он равномерно распределялся внутри мышечных волокон, обеспечивая только одно значение (например, среднюю концентрацию), просвечивающая электронная микроскопия показала, что гликоген хранится в виде дискретных частиц гликогена, расположенных в отдельных субклеточных компартментах. Здесь описан пошаговый протокол от сбора тканей до количественного определения объемной фракции и диаметра частиц гликогена в отдельных субклеточных компартментах отдельных волокон скелетных мышц. Включены соображения о том, как 1) собирать и окрашивать образцы тканей, 2) выполнять анализ изображений и обработку данных, 3) оценивать точность оценок, 4) различать типы мышечных волокон и 5) методологические подводные камни и ограничения.

Introduction

Частицы гликогена состоят из разветвленных полимеров глюкозы и различных связанных с ней ^{белков1} и являются важным топливом во время высоких метаболических ^{потребностей2}. Хотя частицы гликогена не получили широкого признания, они также представляют собой местное топливо, где некоторые субклеточные процессы преимущественно используют гликоген, несмотря на наличие других и более долговечных видов топлива, таких как глюкоза плазмы и жирные ^{кислоты3,4}.

Важность хранения гликогена в качестве субклеточного специфического локализованного топлива обсуждалась в нескольких ^{обзорах5,6}, в основном на основе некоторых из самых ранних документов о субклеточном распределении гликогена с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ТЭМ)^7,8. В первых исследованиях использовались различные протоколы для увеличения контраста гликогена от методов гистохимического окрашивания к отрицательным и положительным окрашиваниям9,10. Важной методологической разработкой стал уточненный протокол постфиксации с ферроцианидом калия-восстановленным осмием11,12,13,14, что значительно улучшило контраст частиц гликогена. Этот усовершенствованный протокол не использовался в некоторых новаторских работах по истощению гликогена, вызванному физическими ^{упражнениями15,} но был вновь введен Грэмом и его ^{коллегами16,17}.

Основываясь на 2-мерных изображениях, субклеточное распределение гликогена чаще всего описывается как частицы гликогена, расположенные в трех бассейнах: субсарколеммальном (прямо под поверхностной мембраной), интермиофибриллярном (между миофибриллами) или интрамиофибриллярном (в пределах миофибрилл). Однако частицы гликогена также могут быть описаны как связанные, например, с саркоплазматическим ретикулумом7 или ^{ядрами18}. В дополнение к субклеточному распределению, преимущество предполагаемого содержания гликогена, оцениваемого ТЕА, также заключается в том, что количественная оценка может проводиться на уровне одного волокна. Это позволяет исследовать изменчивость волокна к волокну и коррелятивный анализ с типами волокон и клеточными компонентами, такими как митохондрии и капли липидов.

Здесь описан протокол оценки ТЭМ типоспецифического объемного содержания трех общих субклеточных пулов гликогена (субсарколеммального, интермиофибриллярного и интрамиофибриллярного) в скелетных мышечных волокнах. Метод был применен к скелетным мышцам ^{человека19}, ^крыс20 и ^мышей21; а также птицы и ^рыбы22; и кардиомиоциты ^крыс23.

Protocol

Настоящий протокол с использованием образцов скелетных мышц человека с биопсией был одобрен Региональными комитетами по этике исследований в области здравоохранения для Южной Дании (S-20170198). Биопсию мышц получали через разрез в коже из мышцы vastus lateralis с использованием иглы Bergström с…

Representative Results

Используя этот протокол, частицы гликогена выглядят черными и отчетливыми (рисунки 1 и 2). Нормальные значения гликогена изображены на рисунке 3. Эти данные основаны в общей сложности на 362 волокнах от 41 здорового молодого человека, собранн…

Discussion

Критическим этапом метода является использование восстановленного осмия ферроцианидом калия во время постфиксации. Селективность этого модифицированного фиксатора для обнаружения гликогена не может быть полностью объяснена химией, но также включает экспериментальные результаты, ?…

Materials

1,2-Propylene oxide	Merck	75-56-9
Embedding 812 resin medium kit	Taab	T031
Glutaraldehyde solution 25%	Merck	1.04239.0250
ITEM	Olympus		Imaging software
Leica EM AC20	Leica		Automatic contrasting system
OSIS Veleta digital camera	Olympus
Osmium tetroxide 4% solution	Polysciences	0972A
Philips CM 100 Transmission EM	Philips
Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate	Sigma-Aldrich	455989-245G
Sodium cacodylatbuffer 0,2 M ph 7.4	Ampliqon.com	AMPQ40989.0500
Ultra-microtome Leica UC7	Leica
Ultrostain lead citrate 3%, stabilised solution	Leica	16707235
Uranyl acetate dihydrate	Polysciences	6159-44-0