כימות של התפלגות גליקוגן תת-תאית בסיבי שריר השלד באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור
Summary
הליך שלאחר קיבוע שונה מגביר את הניגודיות של חלקיקי גליקוגן ברקמה. מאמר זה מספק פרוטוקול שלב אחר שלב המתאר כיצד לטפל ברקמה, לבצע את ההדמיה ולהשתמש בשיטות סטרולוגיות כדי להשיג נתונים משוחדים וכמותיים על התפלגות גליקוגן תת-תאי ספציפית לסוג סיבים בשריר השלד.
Abstract
עם השימוש במיקרוסקופיה אלקטרונים שידור, תמונות ברזולוציה גבוהה של דגימות קבועות המכילות סיבי שריר בודדים ניתן להשיג. הדבר מאפשר כימות של היבטים אולטרה-מבניים כגון שברי נפח, יחסי שטח פנים לנפח, מורפומטריה ואתרי מגע פיזיים של מבנים תת-תאיים שונים. בשנות השבעים פותח פרוטוקול להכתמה משופרת של גליקוגן בתאים וסלל את הדרך לשרשרת מחקרים על לוקליזציה תת-תאית של גודל חלקיקי גליקוגן וגליקוגן באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור. בעוד שרוב הניתוחים מפרשים את הגליקוגן כאילו הוא מופץ בצורה הומוגנית בתוך סיבי השריר, ומספק רק ערך אחד (למשל, ריכוז ממוצע), מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור גילתה כי גליקוגן מאוחסן כחלקיקי גליקוגן נפרדים הממוקמים בתאים תת-תאיים נפרדים. כאן מתואר הפרוטוקול שלב אחר שלב מאיסוף רקמות לקביעה הכמותית של שבר הנפח וקוטר החלקיקים של הגליקוגן בתאים התת-תאיים הייחודיים של סיבי שריר השלד הבודדים. שיקולים כיצד 1) לאסוף ולהכתים דגימות רקמה, 2) לבצע ניתוחי תמונה וטיפול בנתונים, 3) להעריך את הדיוק של הערכות, 4) להפלות בין סוגי סיבי שריר, ו 5) מלכודות מתודולוגיות ומגבלות כלולות.
Introduction
חלקיקי גליקוגן מורכבים מפולימרים מסועפים של גלוקוז וחלבונים נלווים שונים1 ומהווים דלק חשוב במהלך דרישות מטבוליות גבוהות2. למרות שאינם מוכרים באופן נרחב, חלקיקי גליקוגן מהווים גם דלק מקומי, שבו כמה תהליכים תת-תאיים מעדיפים לנצל גליקוגן למרות הזמינות של דלקים אחרים ועמידים יותר כמו גלוקוז פלזמה וחומצות שומן3,4.
החשיבות של אחסון גליקוגן כדלק תת-תאי ספציפי מקומי נידונה במספר ביקורות5,6 בעיקר בהתבסס על כמה מהתיעודים המוקדמים ביותר של ההפצה התת-תאית של גליקוגן על ידי מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור (TEM)7,8. המחקרים הראשונים השתמשו בפרוטוקולים שונים כדי להגביר את הניגודיות של גליקוגן מטכניקות הכתמה היסטוכימיות לכתמים שליליים וחיוביים9,10. התפתחות מתודולוגית חשובה הייתה פרוטוקול לאחר הקיבעון המעודן עם אוסמיום מופחת אשלגן פרוציאניד11,12,13,14, אשר שיפר באופן משמעותי את הניגודיות של חלקיקי גליקוגן. פרוטוקול מעודן זה לא שימש בחלק מהעבודה החלוצית על דלדול גליקוגן הנגרמת על ידי פעילות גופנית15, אך הוצג מחדש על ידי גרהם ועמיתיו 16,17.
בהתבסס על התמונות הדו-ממדיות, ההתפלגות התת-תאית של הגליקוגן מתוארת לרוב כחלקיקי גליקוגן הממוקמים בשלוש בריכות: תת-קרקעי (ממש מתחת לקרום פני השטח), intermyofibrillar (בין המיופיברילים), או intramyofibrillar (בתוך המיופיברילים). עם זאת, חלקיקי גליקוגן יכולים גם להיות מתוארים כקשורים, למשל, רשת רטיקולמוס סרקופלסמית7 או גרעינים18. בנוסף להפצה התת-תאית, היתרון של תוכן הגליקוגן המוערך על ידי TEM הוא גם כימות יכול להתבצע ברמת הסיבים הבודדים. זה מאפשר חקירה של שונות סיבים לסיבים וניתוחים קורלטיביים עם סוגי סיבים ורכיבים תאיים כמו מיטוכונדריה וטיפות שומנים בדם.
כאן, הפרוטוקול עבור TEM-מוערך סיבים ספציפיים סוג תוכן נפחי של שלוש בריכות תת תאיות נפוצות של גליקוגן (תת-קרקעי, intermyofibrillar, ו intramyofibrillar) בסיבי שריר השלד מתואר. השיטה יושמה על שרירי שלד מבני אדם19, חולדות20, ועכברים21; כמו גם ציפורים ודגים22; וקרדיומיוציטים מחולדות23.
Protocol
Representative Results
Discussion
השלב הקריטי של השיטה הוא השימוש של אוסמיום מופחת על ידי אשלגן ferrocyanide במהלך לאחר קיבוע. הסלקטיביות של תיקון שונה זה לגילוי גליקוגן לא ניתן להסביר באופן מלא על ידי כימיה, אבל כולל גם ממצאים ניסיוניים המוכיחים שום זיהוי של חלקיקים כאלה ברקמות ידוע להיות ללא גליקוגן או בחלל חוץ תאי11</…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הוועד האולימפי השבדי.
Materials
| 1,2-Propylene oxide | Merck | 75-56-9 | |
| Embedding 812 resin medium kit | Taab | T031 | |
| Glutaraldehyde solution 25% | Merck | 1.04239.0250 | |
| ITEM | Olympus | Imaging software | |
| Leica EM AC20 | Leica | Automatic contrasting system | |
| OSIS Veleta digital camera | Olympus | ||
| Osmium tetroxide 4% solution | Polysciences | 0972A | |
| Philips CM 100 Transmission EM | Philips | ||
| Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate | Sigma-Aldrich | 455989-245G | |
| Sodium cacodylatbuffer 0,2 M ph 7.4 | Ampliqon.com | AMPQ40989.0500 | |
| Ultra-microtome Leica UC7 | Leica | ||
| Ultrostain lead citrate 3%, stabilised solution | Leica | 16707235 | |
| Uranyl acetate dihydrate | Polysciences | 6159-44-0 |
Referências
- Prats, C., Graham, T. E., Shearer, J. The dynamic life of the glycogen granule. Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7089-7098 (2018).
- Gollnick, P. D., Piehl, K., Saltin, B. Selective glycogen depletion pattern in human muscle fibres after exercise of varying intensity and at varying pedalling rates. Journal of Physiology. 241 (1), 45-57 (1974).
- James, J. H., et al. Stimulation of both aerobic glycolysis and Na+-K+-ATPase activity in skeletal muscle by epinephrine or amylin. American Journal of Physiology Endocrinology Metabolism. 277 (1), 176-186 (1999).
- Jensen, R., Nielsen, J., Ørtenblad, N. Inhibition of glycogenolysis prolongs action potential repriming period and impairs muscle function in rat skeletal muscle. Journal of Physiology. 598 (4), 789-803 (2020).
- Green, H. J. How important is endogenous muscle glycogen to fatigue in prolonged exercise. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 69 (2), 290-297 (1991).
- Fitts, R. H. Cellular mechanisms of muscle fatigue. Physiological Reviews. 74 (1), 49-94 (1994).
- Wanson, J. C., Drochmans, P. Role of the sarcoplasmic reticulum in glycogen metabolism. Journal of Cellular Biology. 54 (2), 206-224 (1972).
- Schmalbruch, H., Kamieniecka, Z. Fiber types in the human brachial biceps muscle. Experimental Neurology. 44 (2), 313-328 (1974).
- Drochmans, P. Morphology of glycogen. Electron microscopic study of the negative stains of particulate glycogen. Journal of Ultrastructure Research. 6, 141-163 (1962).
- Thiery, J. -. P. Demonstration of polysaccharides on thin sections by electron microscopy. Journal of Microscopy. 6, 987-1018 (1967).
- De Bruijn, W. C. Glycogen, its chemistry and morphologic appearance in the electron microscope. I. A modified OsO4 fixative which selectively contrasts glycogen. Journal of Ultrastructural Research. 42 (1), 29-50 (1973).
- Robinson, J. M., Karnovsky, M. L., Karnovsky, M. J. Glycogen accumulation in polymorphonuclear leukocytes, and other intracellular alterations that occur during inflammation. The Journal of Cell Biology. 95 (3), 933-942 (1982).
- Rybicka, K. K. Glycosomes – the organelles of glycogen metabolism. Tissue and Cell. 28 (3), 253-265 (1996).
- Gadisseux, J. F., Evrard, P. Glial-neuronal relationship in the developing central nervous system. A histochemical-electron microscope study of radial glial cell particulate glycogen in normal and reeler mice and the human fetus. Developmental Neuroscience. 7 (1), 12-32 (1985).
- Fridén, J., Seger, J., Ekblom, B. Implementation of periodic acid-thiosemicarbazide-silver proteinate staining for ultrastructural assessment of muscle glycogen utilization during exercise. Cell Tissue Research. 242 (1), 229-232 (1985).
- Marchand, I., et al. Quantification of subcellular glycogen in resting human muscle: granule size, number, and location. Journal of Applied Physiology. 93 (5), 1598-1607 (2002).
- Marchand, I., et al. Quantitative assessment of human muscle glycogen granules size and number in subcellular locations during recovery from prolonged exercise. Journal of Physiology. 580, 617-628 (2007).
- Sun, R. C., et al. Nuclear Glycogenolysis Modulates Histone Acetylation in Human Non-Small Cell Lung Cancers. Cell Metabolism. 30 (5), 903-916 (2019).
- Jensen, R., et al. Heterogeneity in subcellular muscle glycogen utilisation during exercise impacts endurance capacity in men. Journal of Physiology. 598 (19), 4271-4292 (2020).
- Nielsen, J., Schrøder, H. D., Rix, C. G., Ørtenblad, N. Distinct effects of subcellular glycogen localization on tetanic relaxation time and endurance in mechanically skinned rat skeletal muscle fibres. Journal of Physiology. 587 (14), 3679-3690 (2009).
- Nielsen, J., Cheng, A. J., Ørtenblad, N., Westerblad, H. Subcellular distribution of glycogen and decreased tetanic Ca2+ in fatigued single intact mouse muscle fibres. Journal of Physiology. 592 (9), 2003-2012 (2014).
- Mead, A. F., et al. Fundamental constraints in synchronous muscle limit superfast motor control in vertebrates. eLife. 6, 29425 (2017).
- Nielsen, J., Johnsen, J., Pryds, K., Ørtenblad, N., Bøtker, H. E. Myocardial subcellular glycogen distribution and sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling: effects of ischaemia, reperfusion and ischaemic preconditioning. Journal of Muscle Research and Cellular Motility. 42 (1), 17-31 (2021).
- Nielsen, J., Holmberg, H. C., Schrøder, H. D., Saltin, B., Ørtenblad, N. Human skeletal muscle glycogen utilization in exhaustive exercise: role of subcellular localization and fibre type. Journal of Physiology. 589 (11), 2871-2885 (2011).
- Weibel, E. R. . Stereological Methods. Vol. 2: Theoretical Foundations. , (1980).
- Gundersen, H. J., et al. Some new, simple and efficient stereological methods and their use in pathological research and diagnosis. APMIS. 96 (5), 379-394 (1988).
- Saltin, B., Gollnick, P. D. Skeletal muscle adaptability: significance for metabolism and performance. Handbook of Physiology. Skeletal Muscle. 10, 555-632 (1983).
- Howard, C. V., Reed, M. G. . Unbiased Stereology. Three-dimensional Measurement in Microscopy. , (2005).
- Nielsen, J., et al. Subcellular localization-dependent decrements in skeletal muscle glycogen and mitochondria content following short-term disuse in young and old men. American Journal of Physiology Endocrinology Metabolism. 299 (6), 1053-1060 (2010).
- Hokken, R., et al. Subcellular localization- and fibre type-dependent utilization of muscle glycogen during heavy resistance exercise in elite power and Olympic weightlifters. Acta Physiologica (Oxford). 231 (2), 13561 (2021).
- Nielsen, J., Farup, J., Rahbek, S. K., de Paoli, F. V., Vissing, K. Enhanced glycogen storage of a subcellular hot spot in human skeletal muscle during early recovery from eccentric contractions. PLoS One. 10 (5), 0127808 (2015).
- Sjöström, M., et al. Morphometric analyses of human muscle fiber types. Muscle Nerve. 5 (7), 538-553 (1982).
- Gejl, K. D., et al. Local depletion of glycogen with supramaximal exercise in human skeletal muscle fibres. Journal of Physiology. 595 (9), 2809-2821 (2017).
- Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart. Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).
