संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके कंकाल मांसपेशी तंतुओं में उपकोशिकीय ग्लाइकोजन वितरण का परिमाणीकरण
Summary
एक संशोधित पोस्ट-फिक्सेशन प्रक्रिया ऊतक में ग्लाइकोजन कणों के विपरीत को बढ़ाती है। यह पेपर एक चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रदान करता है जिसमें बताया गया है कि ऊतक को कैसे संभालना है, इमेजिंग का संचालन करना है, और कंकाल की मांसपेशियों में फाइबर प्रकार-विशिष्ट उपकोशिकीय ग्लाइकोजन वितरण पर निष्पक्ष और मात्रात्मक डेटा प्राप्त करने के लिए स्टीरियोलॉजिकल विधियों का उपयोग करना है।
Abstract
संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के उपयोग के साथ, व्यक्तिगत मांसपेशी फाइबर युक्त निश्चित नमूनों की उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों को प्राप्त किया जा सकता है। यह अल्ट्रास्ट्रक्चरल पहलुओं जैसे कि वॉल्यूम अंशों, सतह क्षेत्र से वॉल्यूम अनुपात, मॉर्फोमेट्री और विभिन्न उपकोशिकीय संरचनाओं के भौतिक संपर्क स्थलों के परिमाणीकरण को सक्षम बनाता है। 1970 के दशक में, कोशिकाओं में ग्लाइकोजन के बढ़े हुए दाग के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया गया था और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके ग्लाइकोजन और ग्लाइकोजन कण आकार के उपकोशिकीय स्थानीयकरण पर अध्ययन की एक स्ट्रिंग के लिए मार्ग प्रशस्त किया गया था। जबकि अधिकांश विश्लेषण ग्लाइकोजन की व्याख्या करते हैं जैसे कि यह मांसपेशियों के तंतुओं के भीतर सजातीय रूप से वितरित किया जाता है, केवल एक ही मूल्य (उदाहरण के लिए, एक औसत एकाग्रता) प्रदान करता है, संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी से पता चला है कि ग्लाइकोजन को अलग-अलग उपकोशिकीय डिब्बों में स्थित असतत ग्लाइकोजन कणों के रूप में संग्रहीत किया जाता है। यहां, ऊतक संग्रह से चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल से व्यक्तिगत कंकाल मांसपेशी तंतुओं के अलग-अलग उपकोशिकीय डिब्बों में ग्लाइकोजन की मात्रा अंश और कण व्यास के मात्रात्मक निर्धारण का वर्णन किया गया है। 1) ऊतक नमूनों को इकट्ठा करने और दागने के तरीके पर विचार, 2) छवि विश्लेषण और डेटा हैंडलिंग करते हैं, 3) अनुमानों की सटीकता का मूल्यांकन करते हैं, 4) मांसपेशी फाइबर प्रकारों के बीच भेदभाव करते हैं, और 5) पद्धतिगत नुकसान और सीमाएं शामिल हैं।
Introduction
ग्लाइकोजन कण ग्लूकोज और विभिन्न संबद्ध प्रोटीन 1 के शाखित पॉलिमर से बने होते हैं और उच्च चयापचय मांगों के दौरान एक महत्वपूर्ण ईंधन का गठन करते हैं2। हालांकि व्यापक रूप से मान्यता प्राप्त नहीं है, ग्लाइकोजन कण भी एक स्थानीय ईंधन का गठन करते हैं, जहां कुछ उपकोशिकीय प्रक्रियाएं प्लाज्मा ग्लूकोज और फैटी एसिड के रूप में अन्य और अधिक लंबे समय तक चलने वाले ईंधन की उपलब्धता के बावजूद ग्लाइकोजन का उपयोग करती हैं3,4।
एक उपकोशिकीय विशिष्ट स्थानीयकृत ईंधन के रूप में ग्लाइकोजन के भंडारण के महत्व पर कई समीक्षाओं में चर्चा की गई है5,6 मुख्य रूप से संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) 7,8 द्वारा ग्लाइकोजन के उपकोशिकीय वितरण के कुछ शुरुआती दस्तावेजों पर आधारित है। पहले अध्ययनों ने ग्लाइकोजन के विपरीत को हिस्टोकेमिकल स्टेनिंग तकनीकों से नकारात्मक और सकारात्मक धुंधला 9,10 तक बढ़ाने के लिए विभिन्न प्रोटोकॉल का उपयोग किया। एक महत्वपूर्ण methodological विकास पोटेशियम फेरोसायनाइड-कम osmium11,12,13,14 के साथ परिष्कृत पोस्ट-फिक्सेशन प्रोटोकॉल था, जिसने ग्लाइकोजन कणों के विपरीत में काफी सुधार किया। इस परिष्कृत प्रोटोकॉल का उपयोग व्यायाम-प्रेरित ग्लाइकोजन कमी 15 पर कुछ अग्रणी कार्यों में नहीं किया गया था, लेकिन ग्राहम और सहकर्मियों द्वारा फिर से पेश किया गया था16,17।
2-आयामी छवियों के आधार पर, ग्लाइकोजन के उपकोशिकीय वितरण को अक्सर तीन पूलों में स्थित ग्लाइकोजन कणों के रूप में वर्णित किया जाता है: सबसारकोलेमल (सतह की झिल्ली के ठीक नीचे), इंटरमायोफाइब्रिलर (मायोफाइब्रिल के बीच), या इंट्रामायोफाइब्रिलर (मायोफिब्रिल के भीतर)। हालांकि, ग्लाइकोजन कणों को भी संबद्ध के रूप में वर्णित किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, सार्कोप्लाज्मिक रेटिकुलम 7 या न्यूक्ल्यूक्लियम 18। उपकोशिकीय वितरण के अलावा, टीईएम-अनुमानित ग्लाइकोजन सामग्री का लाभ यह भी है कि एकल फाइबर स्तर पर परिमाणीकरण आयोजित किया जा सकता है। यह फाइबर-टू-फाइबर परिवर्तनशीलता की जांच की अनुमति देता है और माइटोकॉन्ड्रिया और लिपिड बूंदों के रूप में फाइबर प्रकार और सेलुलर घटकों के साथ correlative विश्लेषण करता है।
यहां, कंकाल की मांसपेशी तंतुओं में ग्लाइकोजन के तीन सामान्य उपकोशिकीय पूलों (सबसारकोलेमल, इंटरमायोफिब्रिलर, और इंट्रामायोफाइब्रिलर) की टीईएम-अनुमानित फाइबर प्रकार-विशिष्ट वॉल्यूमेट्रिक सामग्री के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। इस विधि को मनुष्यों से कंकाल की मांसपेशियों पर लागू किया गया है19, चूहों 20, और mice21; साथ ही पक्षियों और मछलियों 22; और चूहों से कार्डियोमायोसाइट्स23.
Protocol
Representative Results
Discussion
विधि का महत्वपूर्ण कदम पोस्ट-फिक्सेशन के दौरान पोटेशियम फेरोसायनाइड द्वारा कम ऑस्मियम का उपयोग है। ग्लाइकोजन का पता लगाने के लिए इस संशोधित फिक्सेटिव की चयनात्मकता को रसायन विज्ञान द्वारा पूरी तरह ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को स्वीडिश ओलंपिक समिति द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 1,2-Propylene oxide | Merck | 75-56-9 | |
| Embedding 812 resin medium kit | Taab | T031 | |
| Glutaraldehyde solution 25% | Merck | 1.04239.0250 | |
| ITEM | Olympus | Imaging software | |
| Leica EM AC20 | Leica | Automatic contrasting system | |
| OSIS Veleta digital camera | Olympus | ||
| Osmium tetroxide 4% solution | Polysciences | 0972A | |
| Philips CM 100 Transmission EM | Philips | ||
| Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate | Sigma-Aldrich | 455989-245G | |
| Sodium cacodylatbuffer 0,2 M ph 7.4 | Ampliqon.com | AMPQ40989.0500 | |
| Ultra-microtome Leica UC7 | Leica | ||
| Ultrostain lead citrate 3%, stabilised solution | Leica | 16707235 | |
| Uranyl acetate dihydrate | Polysciences | 6159-44-0 |
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