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Cancer Research

पीढ़ी और प्राथमिक, घातक फुफ्फुस मेसोथेलियोमा ट्यूमर लाइनों का विस्तार

Published: April 21, 2022 doi: 10.3791/63374
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Translational Molecular Pathology, University of Texas MD Anderson Cancer Center

Summary

इस विधि पत्र का लक्ष्य शल्य चिकित्सा द्वारा विच्छेदित फुफ्फुस मेसोथेलियोमा से प्राथमिक ट्यूमर सेल लाइनों के संवर्धन, पीढ़ी और विस्तार के लिए एक मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पद्धति का प्रदर्शन करना है।

Abstract

दुर्लभ ट्यूमर प्रकारों से प्राथमिक ट्यूमर सेल लाइनों के विस्तार के लिए वर्तमान पद्धतियों की कमी है। यह प्रोटोकॉल पाचन से संवर्धन, विस्तार, क्रायोप्रिजर्वेशन और फेनोटाइपिक लक्षण वर्णन तक प्रक्रिया का पूरा अवलोकन प्रदान करके शल्य चिकित्सा, घातक फुफ्फुस मेसोथेलियोमा (एमपीएम) से प्राथमिक ट्यूमर कोशिकाओं का विस्तार करने के तरीकों का वर्णन करता है। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल ट्यूमर पीढ़ी के लिए अवधारणाओं का परिचय देता है जो कई ट्यूमर प्रकारों जैसे कि अंतर ट्रिप्सिनाइजेशन और फेनोटाइपिक लक्षण वर्णन के लिए सेल सतह मार्करों का पता लगाने पर पृथक्करण विधियों के प्रभाव के लिए उपयोगी हो सकता है। इस अध्ययन की प्रमुख सीमा ट्यूमर कोशिकाओं का चयन है जो दो आयामी (2 डी) संस्कृति प्रणाली में विस्तार करेगी। तीन आयामी (3 डी) संस्कृति प्रणालियों, मीडिया की खुराक, आसंजन में सुधार करने के लिए प्लेट कोटिंग, और वैकल्पिक विघटन विधियों सहित इस प्रोटोकॉल के लिए विविधताएं, इस तकनीक और ट्यूमर लाइन स्थापित करने की समग्र सफलता दर में सुधार कर सकती हैं। कुल मिलाकर, यह प्रोटोकॉल इस दुर्लभ ट्यूमर से ट्यूमर कोशिकाओं की स्थापना और लक्षण वर्णन के लिए एक आधार विधि प्रदान करता है।

Introduction

घातक फुफ्फुस मेसोथेलियोमा (एमपीएम) एक दुर्लभ ट्यूमर है जो एस्बेस्टस एक्सपोजर से जुड़ा हुआ है। यद्यपि इम्यूनोथेरेपी-आधारित दृष्टिकोणों ने उत्साहजनक परिणाम दिखाए हैं, लेकिन इस बीमारी को विकसित करने वाले रोगियों के लिए उपलब्ध उपचार विकल्पों की कमी है, और समग्र 5 साल की जीवित रहने की दर कम 1,2 है। इस बीमारी को बेहतर ढंग से समझने और उपन्यास चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने के लिए कई संस्थानों में प्रयास चल रहे हैं जो रोगी के परिणामों में सुधार कर सकते हैं। जबकि कई मेसोथेलियोमा माउस मॉडल हैं, प्राथमिक मेसोथेलियोमा ट्यूमर कोशिकाओं तक पहुंच अधिक सीमित है3. प्राथमिक मेसोथेलियोमा ट्यूमर कोशिकाओं के इन विट्रो विस्तार में एक मूल्यवान मॉडल प्रणाली प्रदान की जाएगी जिसका उपयोग ट्यूमर कोशिकाओं का सीधे अध्ययन करने और ट्यूमर-घुसपैठ लिम्फोसाइटों जैसे ऑटोलॉगस प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ उनकी बातचीत के लिए किया जा सकता है। जबकि प्राथमिक मेसोथेलियोमा ट्यूमर कोशिकाओं लाइनों के विस्तार पर रिपोर्टें हैं, ये कुछ हैं और एक विस्तृत मानक संचालन प्रक्रिया (एसओपी) प्रदान नहीं करते हैं। इसके अलावा, कुछ सेल लाइनें वाणिज्यिक स्रोतों जैसे अमेरिकन टाइप कल्चर कलेक्शन (एटीसीसी) से उपलब्ध हैं। जबकि प्राथमिक ट्यूमर लाइनों की उपलब्धता सीमित है, यह प्रदर्शित किया गया है कि ट्यूमर कोशिकाओं को फुफ्फुस बहाव से और सीधे ट्यूमर ऊतक 4,5 से विस्तारित किया जा सकता है। इसके अलावा, विस्तारित ट्यूमर सेल लाइनों को मूल ट्यूमर 4,5,6 के आणविक प्रोफ़ाइल को संरक्षित करने के लिए दिखाया गया है।

हमारी प्रयोगशाला एमपीएम के ट्यूमर-प्रतिरक्षा माइक्रोएन्वायरमेंट का अध्ययन कर रही है और शल्य चिकित्सा के मामलों से प्राथमिक एमपीएम ट्यूमर कोशिकाओं लाइनों का विस्तार करने के लिए एक विधि विकसित की है। यह विधि प्राथमिक मेटास्टैटिक मेलेनोमा ट्यूमर सेल लाइनों की स्थापना में हमारे अनुभव से अनुकूलित है। इस काम का लक्ष्य 2 डी मॉडल सिस्टम और बाद में फेनोटाइपिक प्रोफाइलिंग का उपयोग करके प्राथमिक मेसोथेलियोमा ट्यूमर लाइन विस्तार के लिए एक विस्तृत, व्यावहारिक दृष्टिकोण प्रदान करना है। पहली पंक्ति सेटिंग2 में सीटीएलए 4 और पीडी -1 को लक्षित करने वाली चेकपॉइंट नाकाबंदी रणनीतियों की हालिया सफलता को देखते हुए, कई प्राथमिक ट्यूमर लाइनों को उत्पन्न करने की क्षमता प्रतिरोध के ट्यूमर आंतरिक तंत्र दोनों की समझ को आगे बढ़ा सकती है और साथ ही टी-सेल मान्यता का आकलन करने के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल प्रणाली प्रदान कर सकती है, इस प्रकार एमपीएम में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की हमारी समझ को गहरा कर सकती है।

इस प्रोटोकॉल की प्रमुख सीमा यह है कि प्रत्येक ट्यूमर में एक अलग माइक्रोएन्वायरमेंट होता है, और विस्तार की सफलता की परिवर्तनशीलता की एक उच्च डिग्री होती है। इसके अलावा, यह विधि ट्यूमर कोशिकाओं के लिए चयन करती है जो 2 डी संस्कृति प्रणाली में विस्तार कर सकती हैं। अन्य विधियां जिनमें 3 डी स्फेरॉइड या ऑर्गेनॉइड संस्कृति का उत्पादन शामिल है, एक वैकल्पिक दृष्टिकोण प्रदान कर सकता है जो विस्तार की उच्च सफलता दर की अनुमति दे सकता है या परिणामस्वरूप सेल लाइनों को प्राप्त करने की क्षमता हो सकती है जो पारंपरिक 2 डी सिस्टम में विस्तार करने में असमर्थ हैं। इस तरह की 3 डी संस्कृतियों को ट्यूमर प्रकारों की पीढ़ी के लिए उपयोगी होने का प्रदर्शन किया गया है जो विस्तार करना मुश्किल है, उदाहरण के लिए, अग्नाशयी कैंसर7.

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Protocol

यहां वर्णित सभी तरीकों को टेक्सास विश्वविद्यालय के एमडी एंडरसन कैंसर सेंटर के इंस्टीट्यूशन रिव्यू बोर्ड (आईआरबी) द्वारा अनुमोदित किया गया है। यह मानक देखभाल से संबंधित है, सूचित सहमति के बाद हटाए गए शल्य चिकित्सा से विच्छेदित एमपीएम ट्यूमर।

1. ट्यूमर पाचन मीडिया और अन्य संबंधित मीडिया की तैयारी

  1. ट्यूमर पाचन मीडिया तैयार करने के लिए, लामिना के प्रवाह हुड में बाँझ रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट (आरपीएमआई) 1640 माध्यम के 500 मिलीलीटर के लिए 100% पेन / स्ट्रेप (पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन) के 5 एमएल जोड़ें।
    1. वैक्यूम निस्पंदन के लिए 500 एमएल, 0.22 μm पॉलीथरसल्फोन (पीईएस) बाँझ फिल्टर में माध्यम को स्थानांतरित करें।
      नोट: निस्पंदन और आकांक्षा कदम 75-150 टॉर के मानक वैक्यूम दबाव के साथ किया जाना चाहिए।
    2. लेबल और ट्यूमर पाचन माध्यम की तारीख और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: माध्यम 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 महीने के लिए संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. ट्यूमर-डाइजेस्टिंग एंजाइमेटिक कॉकटेल तैयार करने के लिए, लामिना प्रवाह हुड में 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 3% कोलेजनेज टाइप 1 के 2.5 एमएल, 1.5 मिलीग्राम / एमएल हाइलूरोनिडेस के 1 एमएल, 250,000 यूनिट / एमएल डीएनएएसई 1 से 16.5 एमएल पाचन माध्यम के 20 μL जोड़ें।
    नोट: ट्यूमर-पचाने वाले एंजाइमी कॉकटेल की कुल मात्रा 20 एमएल है; हालांकि, ट्यूमर नमूने प्रति केवल 10 एमएल की आवश्यकता होती है। इस प्रकार, शेष कॉकटेल को आवश्यकता होने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। विभाज्य को फिर से फ्रीज न करें।
  3. पूर्ण ट्यूमर माध्यम तैयार करने के लिए, लामिना के प्रवाह हुड में बाँझ आरपीएमआई 1640 के 500 मिलीलीटर के लिए 100% पेन / स्ट्रेप के 5 एमएल और भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के 50 एमएल जोड़ें।
    1. वैक्यूम निस्पंदन के लिए 500 एमएल, 0.22 μm पीईएस बाँझ फिल्टर के लिए माध्यम स्थानांतरण।
    2. लेबल और पूर्ण ट्यूमर माध्यम की तारीख और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: माध्यम 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 महीने के लिए संग्रहीत किया जा सकता है।
  4. भुखमरी के लिए कम-सीरम माध्यम तैयार करने के लिए, लामिना के प्रवाह हुड में बाँझ आरपीएमआई 1640 के 500 मिलीलीटर के लिए 100% पेन / स्ट्रेप के 5 एमएल और एफबीएस के 5 एमएल जोड़ें।
    1. वैक्यूम निस्पंदन के लिए 500 एमएल, 0.22 μm पीईएस बाँझ फिल्टर के लिए माध्यम स्थानांतरण।
    2. लेबल और कम सीरम माध्यम की तारीख और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: माध्यम 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 महीने के लिए संग्रहीत किया जा सकता है।
  5. फ्रीज माध्यम तैयार करने के लिए, लामिना के प्रवाह हुड में एफबीएस के 45 मिलीलीटर में डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) के 5 एमएल जोड़ें।
    1. वैक्यूम निस्पंदन के लिए 50 एमएल, 0.22 μm पीईएस बाँझ फिल्टर के लिए माध्यम स्थानांतरण।
    2. लेबल और तारीख पांच 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब।
    3. प्रत्येक ट्यूब के लिए फ्रीज माध्यम के 10 मिलीलीटर स्थानांतरण और -20 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों की दुकान।
  6. माइकोप्लाज्मा परीक्षण के लिए एंटीबायोटिक मुक्त माध्यम तैयार करने के लिए, लामिना के प्रवाह हुड में बाँझ आरपीएमआई 1640 के 500 मिलीलीटर में 50 मिलीलीटर एफबीएस जोड़ें।
    1. वैक्यूम निस्पंदन के लिए 50 एमएल, 0.22 μm पीईएस बाँझ फिल्टर के लिए माध्यम स्थानांतरण।
    2. एंटीबायोटिक मुक्त माध्यम को लेबल और तारीख दें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: माध्यम 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 महीने के लिए संग्रहीत किया जा सकता है।
  7. फेनोटाइपिक विश्लेषण के लिए प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) बफर तैयार करने के लिए, लामिना के प्रवाह हुड में बाँझ 1 एक्स फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के 500 एमएल में बाँझ गोजातीय सीरम एल्बुमिन के 16.6 मिलीलीटर जोड़ें।
    1. लेबल और दिनांक एफएसीएस बफर और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: एफएसीएस बफर को फ़िल्टर नसबंदी की आवश्यकता नहीं होती है जब तक कि दोनों घटकों को बाँझ संग्रहीत किया जाता है। एफएसीएस बफर को 4 डिग्री सेल्सियस पर 6 महीने के लिए खोलने से पहले संग्रहीत किया जा सकता है।

2. ट्यूमर ऊतक का पाचन

  1. चरण 1.2 से एक पृथक्करण ट्यूब में ट्यूमर-पचाने वाले एंजाइमी कॉकटेल के 10 मिलीलीटर को स्थानांतरित करें।
  2. एक बाँझ स्केलपेल का उपयोग कर एक बाँझ 6 अच्छी तरह से प्लेट ढक्कन के लिए ट्यूमर ऊतक के टुकड़े को स्थानांतरित करें।
    नोट: ट्यूमर ऊतक के साथ स्थानांतरित किया जाता है कि माध्यम की राशि प्रसंस्करण के लिए पर्याप्त है।
    1. एक नए बाँझ स्केलपेल और संदंश का उपयोग करके सभी फैटी ऊतक, नेक्रोटिक ऊतक, और / या रक्त के थक्कों को हटा दें।
      नोट: फैटी ऊतक आमतौर पर उपस्थिति में पीला और अर्धठोस होता है। नेक्रोटिक ऊतक दिखने में आसपास के ऊतक की तुलना में गहरा होता है और बहुत नरम होता है; फैटी और नेक्रोटिक ऊतक दोनों आसानी से अलग हो जाएंगे। खूनी ऊतक उज्ज्वल लाल दिखाई देता है और हेरफेर होने पर माध्यम में रक्त छोड़ सकता है। एक बार हटाए जाने के बाद, परिणामस्वरूप ट्यूमर ऊतक को आकार पकड़ना चाहिए और ऊतक प्रकार के आधार पर पीला या गुलाबी होना चाहिए।
    2. पूरे ट्यूमर ऊतक को 1 मिमी3 छोटे टुकड़ों में काटें। यह सुनिश्चित करने के लिए कि ऊतक सूख न जाए, ट्यूमर ऊतक में बाँझ 1x हांक के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस) के 500 μL जोड़ें।
  3. ट्यूमर-पचाने वाले एंजाइमी कॉकटेल (चरण 2.1) के 10 मिलीलीटर युक्त पृथक्करण ट्यूब में ट्यूमर के टुकड़े स्थानांतरित करें। ट्यूब को कसकर बंद करें, इसे ऊतक पृथक्करण पर कैप-साइड रखें, और पृथक्करण ट्यूब पर आस्तीन की तरह लागू करके और इसे जगह में क्लिक करने के लिए दबाकर हीटर तंत्र जोड़ें।
    नोट: प्रत्येक ट्यूब के लिए अधिकतम क्षमता ट्यूमर के 4 ग्राम और 10 एमएल मात्रा है।
  4. 37C_h_TDK_1 पर पूर्वनिर्धारित सेटिंग का चयन करें। चमकती लाल बत्ती द्वारा इंगित के रूप में कोई क्लॉगिंग त्रुटि है यह सुनिश्चित करने के लिए 10 मिनट के बाद स्थिति की जाँच करें।
    नोट: यह कार्यक्रम 37 डिग्री सेल्सियस पर तापमान के साथ 1 घंटे के लिए 1,865 आरपीएम पर प्रक्रिया करता है।
    नोट: यदि क्लॉगिंग होती है, तो पृथक्करण ट्यूब को हटा दें और ढक्कन में पकड़े गए किसी भी ऊतक को हटाने के लिए मैन्युअल रूप से घुमाएं; फिर ट्यूब को अलग करने वाले पर बदलें और कार्यक्रम को फिर से शुरू करें।
  5. 1 घंटे पाचन के बाद, पृथक्करण ट्यूब को हटा दें और इसे लामिना प्रवाह हुड में रखें। एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के शीर्ष पर एक 70 μm सेल छलनी रखकर और फिल्टर पर एक 10 मिलीलीटर विंदुक का उपयोग कर पच ट्यूमर पाइपिंग द्वारा पच ट्यूमर फिल्टर। यदि फ़िल्टर क्लॉग करता है, तो एक नए फ़िल्टर पर स्विच करें।
    1. ताजा ट्यूमर पाचन मीडिया के 10 मिलीलीटर के साथ पृथक्करण ट्यूब कुल्ला और फिल्टर के माध्यम से धोने पारित करें।
    2. 70 μm फिल्टर निकालें और इसे त्याग दें।
    3. ट्यूमर पाचन माध्यम के साथ कुल मात्रा को 40 एमएल तक लाएं।
  6. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 500 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
  7. एक वैक्यूम स्रोत से जुड़े 2 एमएल एस्पिरेटिंग पिपेट का उपयोग करके, गोली को परेशान किए बिना सतह पर तैरनेवाला की आकांक्षा करें, और बाँझ पूर्ण ट्यूमर माध्यम के 10 मिलीलीटर का उपयोग करके कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  8. चरण 2.6 दोहराएँ।
  9. चरण 2.7 में वर्णित के रूप में सतह पर तैरनेवाला की आकांक्षा। बाँझ पूर्ण ट्यूमर माध्यम के 3 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और सेल निलंबन को बाँझ 6-अच्छी तरह से प्लेट के एक कुएं में स्थानांतरित करें।
  10. 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में प्लेट रखें।
  11. 24 घंटे के बाद, अच्छी तरह से 1 में पचने वाले ट्यूमर से एक ही 6-अच्छी तरह से प्लेट में एक नए कुएं (अच्छी तरह से 2) में उपयोग किए गए माध्यम को स्थानांतरित करें। अच्छी तरह से 1 करने के लिए बाँझ पूर्ण ट्यूमर माध्यम के 3 एमएल जोड़ें।
  12. कुओं 1 और 2 से इस्तेमाल किया माध्यम स्थानांतरण और चरण 2.11 के बाद एक ही 6 अच्छी तरह से प्लेट 24 घंटे में अच्छी तरह से 3 में गठबंधन। कुओं 1 और 2 में बाँझ पूर्ण ट्यूमर माध्यम के 3 एमएल जोड़ें।
  13. चरण 2.12 के बाद प्रत्येक अच्छी तरह से 48 घंटे में पूर्ण ट्यूमर माध्यम के सभी 3 कुओं और पिपेट 3 एमएल से माध्यम की आकांक्षा।

3. प्राथमिक ट्यूमर सेल लाइन की पीढ़ी

  1. एक उल्टे चरण माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, प्रारंभिक मार्ग संस्कृति में फाइब्रोब्लास्ट संदूषण का प्रतिशत निर्धारित करें।
    नोट: फाइब्रोब्लास्ट आमतौर पर लंबे और अनियमित होते हैं और एक बीमार परिभाषित सेलुलर झिल्ली होती है। वे जेड पैमाने पर पतले या सपाट दिखाई देते हैं।
    1. यदि फाइब्रोब्लास्ट संदूषण प्रारंभिक मार्ग संस्कृति में कोशिकाओं के 20% से अधिक है, तो कम-सीरम माध्यम के साथ पूर्ण माध्यम को बदलने के बाद संवर्धन जारी रखें।
    2. 3-4 सप्ताह के लिए प्रति सप्ताह दो बार चरण 3.1.1 में कम-सीरम माध्यम के साथ प्रतिस्थापन दोहराएं।
    3. जब संस्कृति 80% संगम तक पहुंच जाती है, तो 50:50 को 6-अच्छी तरह से प्लेट के 2 नए कुओं में विभाजित करके कोशिकाओं को पारित करें। कोशिकाओं के 80% संगम तक पहुंचने के बाद कम-सीरम मीडिया में 50:50 पासिंग जारी रखें।
    4. 4 सप्ताह तक के लिए चरण 3.1.3 दोहराएं, संस्कृति 80% संगम तक पहुंचने के बाद 50:50 को विभाजित करके आवश्यकतानुसार बड़ी संस्कृति फ्लास्क में गुजरना। यदि फाइब्रोब्लास्ट आबादी 10% या उससे कम नहीं होती है, तो फाइब्रोब्लास्ट संदूषण को हटाने के लिए अंतर ट्रिप्सिनाइजेशन विधि का प्रयास करने के लिए चरण 3.2 जारी रखें। अन्यथा, चरण 3.3 पर आगे बढ़ें।
  2. ट्यूमर कोशिकाओं के लिए समृद्ध करने के लिए, धीरे सीरम युक्त माध्यम को हटाने के लिए 1x पीबीएस के साथ अच्छी तरह से कुल्ला।
    1. ट्रिप्सिन को निम्नानुसार जोड़ें: 6-अच्छी तरह से प्लेट में 1 एमएल प्रति, टी 25 फ्लास्क के लिए 2 एमएल, टी 75 फ्लास्क के लिए 3 एमएल।
    2. 1 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में 6 अच्छी तरह से प्लेट या फ्लास्क रखें। इनक्यूबेटर से प्लेट या फ्लास्क निकालें और एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कोशिकाओं के आसंजन की जांच करें। यदि कोशिकाएं आंशिक रूप से उठा रही हैं या तैर रही हैं, तो धीरे-धीरे निलंबित कोशिकाओं और ट्रिप्सिन को हटा दें। पूर्ण ट्यूमर माध्यम के बराबर या अधिक मात्रा युक्त एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में कोशिकाओं रखें।
      नोट: आसंजन गुणों के आधार पर कोशिकाओं का यह आंशिक संग्रह कई अंशों में से पहला है।
    3. चरण 3.2.1 और 3.2.2 दोहराएँ जब तक कि सभी कोशिकाओं को उठा या 4 भिन्न हटा दिए जाते हैं।
    4. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 500 × ग्राम पर सभी स्वतंत्र अंशों अपकेंद्रित्र।
    5. चरण 2.7 में वर्णित सतह पर तैरनेवाला की आकांक्षा करें, और बाँझ, कम-सीरम माध्यम के 5 मिलीलीटर का उपयोग करके कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
    6. प्रत्येक अंश के लिए एक टी 25 फ्लास्क में कोशिकाओं को प्लेट करें और फ्लास्क को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में रखें।
    7. 48 घंटे के बाद संस्कृति का आकलन करें यह निर्धारित करने के लिए कि ट्यूमर कोशिकाओं बनाम फाइब्रोब्लास्ट के लिए कौन सा अंश समृद्ध है। फाइब्रोब्लास्ट युक्त फ्लास्क को त्यागें। यदि फाइब्रोब्लास्ट संदूषण <10% है, तो पूर्ण ट्यूमर माध्यम में विस्तार जारी रखें और चरण 4 पर आगे बढ़ें। यदि फाइब्रोब्लास्ट संदूषण 10-30% है, तो चरण 3.1.2-3.1.4 दोहराएं। यदि फाइब्रोब्लास्ट संदूषण 30% से अधिक है, तो चरण 3.2-3.2.7 दोहराएं।
  3. यदि प्रारंभिक मार्ग संस्कृति के भीतर कुछ या कोई फाइब्रोब्लास्ट का पता नहीं लगाया जाता है, तो कोशिकाओं को 6-अच्छी तरह से प्लेट या फ्लास्क में 80% संगम होने के बाद 50:50 को विभाजित करके पूर्ण ट्यूमर माध्यम में कोशिकाओं को पारित करना जारी रखें।

4. प्रारंभिक मार्ग प्राथमिक ट्यूमर सेल लाइन का विस्तार

  1. एक बार प्राथमिक ट्यूमर संस्कृति में फाइब्रोब्लास्ट संदूषण का 10% या उससे कम होता है, माध्यम की आकांक्षा करें और इसे प्रति सप्ताह दो बार बाँझ पूर्ण ट्यूमर माध्यम से बदलें।
    नोट: टी 25 के लिए इष्टतम मध्यम मात्रा 5 एमएल है; टी 75 12 एमएल है; टी 150 25 एमएल है।
    1. प्लेट या फ्लास्क में 80% संगम तक पहुंचने के बाद आवश्यकतानुसार संस्कृति 50:50 को बड़े फ्लास्क में पारित करें।
      नोट: संस्कृति को इसकी वृद्धि के आधार पर उच्च अनुपात में पारित करने की आवश्यकता हो सकती है। समायोजित करें ताकि संस्कृति हर 3-5 दिनों में 80% संगम तक पहुंच जाए।
  2. जब तक संस्कृति 4 या उससे ऊपर के मार्ग पर न हो। एक बार जब संस्कृति कम से कम दो टी 75 फ्लास्क में 80% संगम हो जाती है, तो चरण 5 जारी रखें।

5. स्थापित प्राथमिक ट्यूमर सेल लाइन की विशेषता और बैंकिंग

  1. क्रायोप्रेज़र्व एक टी 75 फ्लास्क को प्रारंभिक मार्ग फ्रीज के रूप में संरक्षित करें। शेष टी 75 फ्लास्क के माइकोप्लाज्मा परीक्षण के लिए, चरण 5.2 जारी रखें।
    1. प्रारंभिक-मार्ग कोशिकाओं के क्रायोप्रेज़र्वेशन के लिए, चरण 1.5 में तैयार विभाज्य फ्रीज माध्यम की 1 ट्यूब पिघलना।
    2. चरण 3.2 में वर्णित के रूप में 1x पीबीएस के साथ पहले प्लेट धोने और चरण 3.2.1 में वर्णित ट्रिप्सिन जोड़ने के द्वारा ट्रिप्सिनाइजेशन द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा करें।
    3. 3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में फ्लास्क रखें। इनक्यूबेटर से फ्लास्क निकालें और एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कोशिकाओं के आसंजन की जांच करें। यदि कोशिकाएं उठा रही हैं या तैर रही हैं, तो धीरे-धीरे निलंबित कोशिकाओं और ट्रिप्सिन को हटा दें। पूर्ण ट्यूमर माध्यम के बराबर या अधिक मात्रा युक्त एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में कोशिकाओं रखें।
      नोट: यदि कोशिकाएं 3 मिनट के बाद अनुयायी रहती हैं, तो फ्लास्क को अतिरिक्त 2 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में वापस रखें।
    4. ट्यूबवेल को धीरे-धीरे पाइप करके मिलाएं और गिनती के लिए 20 μL निकालें।
    5. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 500 × ग्राम पर ट्यूब अपकेंद्रित्र।
    6. जबकि कोशिकाएं कताई कर रही हैं, प्रयोगशाला-विशिष्ट गिनती प्रोटोकॉल जैसे ट्रिपैन ब्लू या एक्रिडीन नारंगी / प्रोपिडियम आयोडाइड (एओ / पीआई) का उपयोग करके गिनती करें।
    7. 1 एमएल फ्रीज माध्यम की एक न्यूनतम के साथ फ्रीज माध्यम में सेंट्रीफ्यूजेशन केबाद कोशिकाओं × पुन: निलंबित करें।
    8. चरण 5.1.7 से सेल निलंबन के 1 एमएल को प्रीलेबल्ड 1.5 एमएल क्रायोवियल्स में स्थानांतरित करें।
    9. क्रायोवियल्स को एक नियंत्रित दर फ्रीज चैंबर में रखें और उन्हें तुरंत -80 डिग्री सेल्सियस पर स्थानांतरित करें।
    10. दीर्घकालिक भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित करने से पहले 1 सप्ताह तक -80 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को स्टोर करें।
  2. माइकोप्लाज्मा परीक्षण के लिए एक टी 75 फ्लास्क 50:50 विभाजित करें। चरण 1.6 में तैयार किए गए माध्यम को एंटीबायोटिक मुक्त माध्यम में बदलें।
    1. 72 घंटे के बाद, परीक्षण से पहले 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर माइकोप्लाज्मा डिटेक्शन अभिकर्मक, सब्सट्रेट और नियंत्रण को पिघलाएं।
    2. परीक्षण करने के लिए प्रत्येक संस्कृति से सतह पर तैरनेवाला के 1 मिलीलीटर ले लीजिए और इसे 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में रखें।
    3. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 500 × ग्राम पर सतह पर तैरनेवाला सेंट्रीफ्यूजिंग द्वारा किसी भी निलंबित कोशिकाओं गोली।
    4. नमूना सतह पर तैरनेवाला के 100 μL लोड और एक सफेद 96 अच्छी तरह से प्लेट में नियंत्रण। प्रत्येक नमूना और नियंत्रण के लिए माइकोप्लाज्मा का पता लगाने अभिकर्मक के 100 μL जोड़ें।
    5. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते हैं।
    6. प्लेट को प्लेट रीडर में रखें और ल्यूमिनेसेंस (रीडिंग ए, यानी, पहले पढ़ना) पढ़ें।
      नोट: माइकोप्लाज्मा किट निर्माता का प्रोटोकॉल बहुआयामी प्लेट पाठकों पर डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स रखने का संकेत देता है। रीड ल्यूमिनेसेंस एंडपॉइंट पर 1 एस के एकीकरण समय और 135 के लाभ के साथ सेट किया गया है। प्लेट रीडर प्रत्येक प्रयोग के लिए लाभ संकेत को अनुकूलित करने के लिए एक ऑटो-स्केल रूटीन का उपयोग करता है। 1 एस एकीकरण समय मानक डिफ़ॉल्ट है। दोनों सेटिंग्स का उपयोग प्लेट रीडर द्वारा व्याख्या किए गए ल्यूमिनेसेंट सिग्नल की तीव्रता को समायोजित करने के लिए किया जाता है और व्यक्तिगत प्लेट रीडर के आधार पर समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है।
    7. प्लेट रीडर से प्लेट निकालें और प्रत्येक नमूना और नियंत्रण करने के लिए माइकोप्लाज्मा का पता लगाने सब्सट्रेट के 100 μL जोड़ें।
    8. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेते हैं।
    9. प्लेट रीडर में प्लेट रखें और ल्यूमिनेसेंस (रीडिंग बी, यानी, दूसरा रीडिंग) पढ़ें।
    10. माइकोप्लाज्मा सकारात्मकता निर्धारित करने के लिए, रीडिंग बी से रीडिंग ए का अनुपात निर्धारित करें।
      नोट: माइकोप्लाज्मा सकारात्मकता अनुपात माइकोप्लाज्मा किट निर्माता के प्रोटोकॉल में वर्णित हैं। रीडिंग ए और बी को एक ही सेटिंग्स के साथ अधिग्रहित किया जाता है और बस पढ़ने के क्रम को प्रतिबिंबित करता है।
      1. माइकोप्लाज्मा-नकारात्मक होने के लिए < अनुपात 1 पर विचार करें।
      2. अनिर्णायक होने के लिए 1-1.2 के अनुपात पर विचार करें और चरण 5.2 दोहराएं।
      3. माइकोप्लाज्मा-पॉजिटिव होने > लिए 1.2 के अनुपात पर विचार करें और इस संस्कृति की निगरानी करें; यदि आवश्यक हो तो संस्कृति को समाप्त करें।
  3. माइकोप्लाज्मा-नकारात्मक ट्यूमर कोशिकाओं के प्रवाह साइटोमेट्री लक्षण वर्णन
    1. सेल-पृथक्करण बफर का उपयोग करके ट्यूमर कोशिकाओं को हटा दें।
    2. कोशिकाओं की गिनती और चरण 1.7 से एफएसीएस बफर में 1 × 106/एमएल पर कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
    3. सतह धुंधला के लिए अलग-अलग ट्यूबों में सेल निलंबन के 100 μL निकालें।
    4. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 500 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
    5. सतह पर तैरनेवाला और ब्लॉक एफसी रिसेप्टर्स 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एफएसीएस बफर में 5% बकरी सीरम के 500 μL में कोशिकाओं सेते द्वारा।
    6. एफएसीएस बफर के 2 एमएल जोड़ें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 500 × ग्राम पर निलंबन अपकेंद्रित्र।
    7. सतह पर तैरनेवाला की आकांक्षा और एंटीबॉडी (तालिका 1) और एफएसीएस बफर की सतह दाग मिश्रण जोड़ें ताकि अंतिम मात्रा 100 μL हो। नमूनों को कवर करें और उन्हें 30 मिनट के लिए बर्फ पर दाग दें।
    8. चरण 5.3.6 दोहराएँ।
    9. सतह पर तैरनेवाला की आकांक्षा करें और 1% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) प्लस 0.25% ईटीओएच के 200 μL में पुन: निलंबित करके कोशिकाओं को ठीक करें। प्रकाश से संरक्षित नमूनों के साथ 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
    10. चरण 5.3.6 दोहराएँ। एक उपयुक्त प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग कर अधिग्रहण के लिए एफएसीएस बफर के 200 μL में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
      नोट: मेसोथेलियोमा ट्यूमर कोशिकाओं को मेसोथेलिन और एन-कैडरिन के लिए सकारात्मक होने की उम्मीद है। कुछ सीडी 90 भी व्यक्त कर सकते हैं।
  4. क्रमशः चरण 4.1 और 5.1 में वर्णित पूर्ण ट्यूमर माध्यम और बैंक में विस्तार करें।

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Representative Results

प्रारंभिक-मार्ग संस्कृतियों के फाइब्रोब्लास्ट संदूषण को निर्धारित करने के लिए, कोशिकाओं को मौजूद अन्य अनुयायी कोशिकाओं के सापेक्ष फाइब्रोब्लास्ट की आवृत्ति की पहचान करने के लिए एक उल्टे चरण माइक्रोस्कोप का उपयोग करके मूल्यांकन किया जाता है। चित्रा 1 कोई फाइब्रोब्लास्ट संदूषण (चित्रा 1 डी) के साथ एक संस्कृति की तुलना में 80% (चित्रा 1 ए), 50% (चित्रा 1 बी), और 30% (चित्रा 1 सी) के फाइब्रोब्लास्ट संदूषण में वृद्धि के उदाहरण दिखाता है। इस दृश्य मूल्यांकन के आधार पर, ऊपर वर्णित विस्तार स्थितियों में समायोजन किया जाता है। एक बार <10% फाइब्रोब्लास्ट संदूषण के साथ एक माइकोप्लाज्मा मुक्त संस्कृति स्थापित हो जाने के बाद, मेसोथेलियोमा ट्यूमर लाइन की शुद्धता निर्धारित करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग किया जाता है।

चित्रा 2 ए, बी नकारात्मक नियंत्रण के रूप में मेलेनोमा ट्यूमर लाइन (एमईएल 526) के साथ एटीसीसी-स्थापित मेसोथेलियोमा ट्यूमर लाइनों (एनसीआई-एच 2452 और एमएसटीओ -211 एच) की तुलना में दो प्राथमिक मेसोथेलियोमा ट्यूमर लाइनों (मेसो 171 और मेसो 176) के प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री सतह धुंधला दिखाते हैं। मेसोथेलियोमा ट्यूमर कोशिकाएं मेसोथेलिन (चित्रा 2 ए) और एन-कैडरिन (चित्रा 2 बी) व्यक्त कर सकती हैं। उपयोग किए गए प्रवाह साइटोमेट्री पैनल से संबंधित विस्तृत जानकारी तालिका 1 में दिखाई गई है। गेटिंग रणनीति पूरक चित्रा 1 में दिखाया गया है। ध्यान दें, सीडी 90 का उपयोग फाइब्रोब्लास्ट-विशिष्ट मार्कर के रूप में नहीं किया जा सकता है क्योंकि इसे मेसोथेलियोमा ट्यूमर कोशिकाओं द्वारा भी व्यक्त किया जा सकता है। सतह प्रोटीन मार्कर अभिव्यक्ति पर एंजाइमी टुकड़ी के प्रभाव का परीक्षण करने के महत्व को ट्रिप्सिन और प्रोटीज-कोलेजनेज मिश्रण दोनों के रूप में भी दिखाया गया है, जिसके परिणामस्वरूप एन-कैडरिन (चित्रा 2 सी) की सतह अभिव्यक्ति का नुकसान हुआ, जबकि सीडी 90 प्रभावित नहीं हुआ था (चित्रा 2 डी)।

Figure 1
चित्रा 1: प्रारंभिक मार्ग संस्कृतियों और एक स्थापित ट्यूमर लाइन में फाइब्रोब्लास्ट संदूषण की बढ़ती आवृत्ति की प्रतिनिधि छवियां ( ए) 80% फाइब्रोब्लास्ट संदूषण युक्त प्रारंभिक मार्ग संस्कृति की छवि। (बी) 50% फाइब्रोब्लास्ट संदूषण युक्त प्रारंभिक मार्ग संस्कृति की छवि। (सी) 30% फाइब्रोब्लास्ट संदूषण युक्त प्रारंभिक-मार्ग संस्कृति की छवि। (डी) एक स्थापित प्राथमिक मेसोथेलियोमा ट्यूमर लाइन की छवि। स्केल सलाखों = 200 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: स्थापित मेसोथेलियोमा ट्यूमर सेल लाइन के प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री फेनोटाइपिंग (ए और बी) हिस्टोग्राम एटीसीसी मेसोथेलियोमा सेल लाइनों पर मेसोथेलिन और एन-कैडरिन की सतह अभिव्यक्ति पैटर्न दिखारहे हैं, मेलेनोमा ट्यूमर लाइन को नियंत्रित करते हैं, और प्राथमिक मेसोथेलियोमा ट्यूमर लाइनें। (सी और डी) "एन-कैडरिन और सीडी 90 पर ट्रिप्सिन, प्रोटीज-कोलेजनेज मिश्रण और सेल पृथक्करण बफर का प्रभाव"। संक्षिप्त नाम: कॉम्प-एक्स-ए = फ्लोरोफोर एक्स का मुआवजा क्षेत्र; पीई = फाइकोएरिथ्रिन; एपीसी = एलोफाइकोसायनिन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

सतह एंटीबॉडी फोर्टेसा एक्स 20 चैनल लेजर क्लोन आइसोटाइप नमूना (μL)
लाइव / मृत पीला बीवी 510 बैंगनी एन/ए एन/ए 1
एंटी-मेसोथेलिन एपीसी एपीसी लाल आरईए 1057 आईजीजी 1 2
एंटी-सीडी 325 (एन-कैडरिन) पीई पीई वाईजी 8 सी 11 आईजीजी 1 5
एंटी-सीडी 90 पीई-साइ 7 पीई-साइ 7 वाईजी 5E10 आईजीजी 1 5

तालिका 1: फेनोटाइप ट्यूमर लाइनों के लिए उपयोग किए जाने वाले फ्लो साइटोमेट्री एंटीबॉडी। संक्षिप्त नाम: पीई = फाइकोएरिथ्रिन; एपीसी = एलोफाइकोसायनिन।

पूरक चित्रा एस 1: ट्यूमर लाइनों के फेनोटाइपिक विश्लेषण के लिए गेटिंग रणनीति। डॉट भूखंडों को गेटिंग रणनीति में प्रत्येक चरण के लिए दिखाया गया है जो ब्याज के मार्करों की अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए अग्रणी है। फॉरवर्ड स्कैटर और साइड स्कैटर गुणों का उपयोग करके कोई भी प्रारंभिक गेट ब्याज की कोशिकाओं की पहचान करने के लिए बनाया जाता है, इसके बाद समय सुविधा के आधार पर क्यूसी गेट होता है। कोशिकाओं को तब आगे और साइड स्कैटर गुणों का उपयोग करके किसी भी डबल को हटाने के लिए सबगेट किया जाता है। अंतिम क्यूसी गेट व्यवहार्यता पर आधारित है, मृत कोशिकाओं के साथ डाई के लिए सकारात्मक धुंधला हो जाता है। व्यवहार्यता गेट के बाद, पैनल के आधार पर सबगेटिंग की जा सकती है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

हालांकि यह प्रोटोकॉल सीधा है, कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं जिनका बारीकी से पालन किया जाना चाहिए। शुरुआती मार्ग फ्रीज ट्यूमर-सेल संवर्धन प्रक्रिया को दोहराने की क्षमता को संरक्षित करने के लिए महत्वपूर्ण है यदि शुरू में असफल रहा। सही विभाजन और मीडिया भुखमरी तकनीक तय करने के लिए आंखों द्वारा फाइब्रोब्लास्टिक संदूषण का आकलन करने की क्षमता संस्कृति में फाइब्रोब्लास्ट अतिवृद्धि को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, विभेदक ट्रिप्सिनाइजेशन विधि को इनक्यूबेशन के दौरान कोशिकाओं के सावधानीपूर्वक अवलोकन की आवश्यकता होती है। कोशिकाएं अलग-अलग दरों पर प्लास्टिक प्लेट को उठा सकती हैं, और यह सेल लाइन से सेल लाइन में भिन्न होगी। इस प्रक्रिया को सीखने और इस निर्णय लेने के कदम को परिष्कृत करते समय, मूल संस्कृति के एक हिस्से को कम-सीरम भुखमरी माध्यम (आरपीएमआई 1640 1% पेन / स्ट्रेप और 1% एफबीएस के साथ) का उपयोग करके 6-अच्छी तरह से प्लेट में संरक्षित किया जा सकता है जब तक कि ट्यूमर-सेल संवर्धन नहीं देखा जा सकता है।

मेसोथेलियोमा ट्यूमर लाइनों के मान्य फेनोटाइपिक लक्षण वर्णन में नोट किया गया एक महत्वपूर्ण कारक मेसोथेलियोमा ट्यूमर सेल सतह मार्कर, एन-कैडरिन8 की अभिव्यक्ति पर ट्रिप्सिनाइजेशन और प्रोटीज-कोलेजनेज मिश्रण का प्रभाव था। हमने सतह मार्कर के नुकसान को देखा यदि कोशिकाओं को इन एंजाइमों का उपयोग करके अलग किया गया था, जिसे पहले9 वर्णित किया गया है। हालांकि यह दिखाया गया है कि अधिकांश सतह प्रोटीन ट्रिप्सिन से नकारात्मक रूप से प्रभावित नहीं होते हैं, प्रवाह पैनल डिजाइन10 के दौरान प्रत्येक सतह मार्कर का परीक्षण करना महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, ट्यूमर कोशिकाओं को संस्कृति या विस्तार करने की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है जब तक कि कोशिकाएं विस्तार के लॉग चरण तक नहीं पहुंच जाती हैं और इन मार्करों को फिर से व्यक्त करने का समय होता है। सेल पृथक्करण माध्यम का उपयोग प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके पता लगाने के लिए एन-कैडरिन की अभिव्यक्ति के प्रतिधारण की अनुमति देता है। अन्य प्रकार के पृथक्करण मीडिया भी मार्कर प्रतिधारण के लिए अनुमति दे सकते हैं; हालांकि, व्यक्तिगत प्रयोगशालाओं को प्रवाह साइटोमेट्री पैनल स्थापित करने से पहले इन मीडिया का सावधानीपूर्वक परीक्षण करना चाहिए।

इस अध्ययन की एक बड़ी सीमा यह है कि सेल लाइन स्थापित करने की सफलता दर केवल 50% है। यह ट्यूमर माइक्रोएनवायरनमेंट की विषम प्रकृति के कारण हो सकता है। इस प्रक्रिया को बेहतर बनाने के तरीकों में 3 डी संस्कृति प्रणालियों का उपयोग, ट्यूमर सेल विस्तार को बढ़ावा देने के लिए मीडिया की खुराक के अलावा, बेहतर विघटन विधियां, रोगी-व्युत्पन्न ज़ेनोग्राफ्ट का उपयोग, या ट्यूमर सेल आसंजन में सुधार के लिए प्लेट कोटिंगशामिल हो सकती है 11. दरअसल, 3 डी संस्कृतियों को अग्नाशय के कैंसर 7 जैसे चुनौतीपूर्ण ट्यूमर सेल लाइनों की पीढ़ी में सफल दिखाया गयाहै।

चयन का एक एवेन्यू जो इस प्रोटोकॉल में शामिल नहीं है, मेसोथेलिन जैसे मेसोथेलियोमा ट्यूमर मार्कर के आधार पर सेल सॉर्टिंग द्वारा ट्यूमर-सेल संवर्धन है। जैसा कि मेसोथेलियोमा ट्यूमर कोशिकाएं मानक फाइब्रोब्लास्ट मार्कर, सीडी 90 को व्यक्त कर सकती हैं, सकारात्मक चयन एक बेहतर विकल्प हो सकता है। इस पद्धति के लिए चेतावनी प्रारंभिक संस्कृतियों में सेलुलरता की कम डिग्री है, जिसके लिए एक छोटी मात्रा में सॉर्ट करने की आवश्यकता होगी, मल्टीवेल प्लेट जैसे कि 384- या 96-अच्छी तरह से प्लेट। इसके अलावा, जैसा कि इस प्रोटोकॉल में ऊतक पाचन के लिए कोलेजनेज का उपयोग शामिल है, यह ज्ञात नहीं है कि यह एन-कैडरिन या मेसोथेलिन की सतह अभिव्यक्ति को भी प्रभावित कर सकता है या नहीं। जबकि मेसोथेलिन अभिव्यक्ति का तंत्र अपेक्षाकृत अज्ञात है, एन-कैडरिन सेलुलर आसंजन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, और इस प्रोटीन को हटाने से ट्यूमर लाइन12 की स्थापना पर नकारात्मक प्रभाव पड़ सकता है। फिलहाल इसका आकलन किया जा रहा है।

यह विधि महत्वपूर्ण है क्योंकि यह इन विट्रो मॉडल सिस्टम की पीढ़ी को इस दुर्लभ ट्यूमर प्रकार का अध्ययन करने की अनुमति देती है। इसमें मेसोथेलियोमा के उपन्यास सतह लक्ष्यों की पहचान करने वाले अध्ययन शामिल हो सकते हैं जैसे कि सीएआर-टी कोशिकाओं के साथ मेसोथेलिन और लक्षित या इम्यूनोथेरेपी के प्रतिरोध के ट्यूमर-आंतरिक गुणों को उजागर करना। इसके अलावा, यदि इन कोशिकाओं को माउस मॉडल में विवो में विस्तारित किया जा सकता है, तो यह सेलुलर-आधारित और एंटीबॉडी-आधारित चिकित्सीय के साथ-साथ छोटे अणुओं के परीक्षण के लिए एक स्रोत भी बनाएगा। इस प्रोटोकॉल के लिए भविष्य की दिशा एमपीएम के अन्य उपप्रकारों जैसे कि सारकोमैटोइड और बिफेसिक सबसेट का विस्तार करने की क्षमता का परीक्षण करेगी।

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Disclosures

सीएच ब्रायसेल थेराप्यूटिक्स और मेसोथेलियोमा एप्लाइड रिसर्च फाउंडेशन के लिए एसएबी का सदस्य है। अन्य सभी लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम इस प्रोटोकॉल को शुरू करने में उनके योगदान के लिए राकेल लाजा-ब्रिविस्का और ऊतक संग्रह पर सहयोग के लिए डॉ बोरिस सेपेसी, रेजा मेहरान और डेविड राइस को स्वीकार करना चाहते हैं। इस काम से कोई अतिरिक्त फंडिंग नहीं जुड़ी है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL serological pipettes BD Falcon 357551
15 mL conical tubes BD Falcon 352097
2 mL aspirating pipettes BD Falcon 357558
5 mL serological pipettes BD Falcon 357543
50 mL conical tubes BD Falcon 352098
6-well microplates, tissue culture treated Corning 3516
Accutase Innovative Cell Technologies AT104 A protease-collagenase mixture considered to be more effective in preserving epitopes for flow cytometry.
anti-CD325 (N-Cadherin) PE Invitrogen 12-3259-42
anti-CD90 PE-Cy7 BD Biosciences 561558
anti-Mesothelin APC Miltenyi 130-118-096
Bovine Serum Albumin 30% Sigma A8577-1L
Cell Dissociation buffer, enzyme-free Thermo Fisher Scientific 13151014
Cell strainer (70 µm) Greiner Bio-One 542-070
Centrifuge with 15 mL and 50 mL adaptors
Collagenase Type 1 Sigma-Aldrich C-0130 Dissolve 1.5 g of Collagenase type I into 100 mL of sterile DMEM and aliquot in 5 mL volumes. Label well and store at -20 °C.
Controlled-rate freezing chamber Thermo Fisher Scientific 15-350-50
Cryovials Thermo Fisher Scientific 5000-0020
CulturPlate-96 Packard Instrument Company 6005680 White, opaque 96-well microplate.
Dimethyl sulfoxide Thermo Fisher Scientific BP231-100
DNAse I (from bovine pancreas) Sigma-Aldrich D4527 Aliquot at 50 μL, label well and store at -20 °C. After thawing, keep at 4 °C for up to 1 month.
Dulbecco's Phosphate buffered saline solution 1x Corning 21-031-CV
Ethanol 200 proof Thermo Fisher Scientific A4094
FACS tubes-filter top BD Falcon 352235
Fetal bovine serum Gemini-Bio 100-106
GentleMACS C-tubes Miltenyi 130-093-237
GentleMACS Octo-dissociator with heater apparatus Miltenyi 130-096-427 Includes specialized heater apparatus sleeves used to apply heat to the C-tubes during dissocation.
Goat serum Sigma-Aldrich G9023 Aliquot and store at -20 °C.
Hank's Balanced Salt solution, 500 mL Corning MT21022CV
Hyaluronidase Sigma-Aldrich H3506 Dissolve 0.15 g of Hyaluronidase into 100 mlLof sterile DMEM and distribute into 1.0 mL aliquots. Label well and store at -20 °C.
Inverted-phase microscope
Laminar flow hood
Live/dead yellow dye Life Technologies L-34968
Micropipettor tips, 20 µL ART 2149P
Micropipettor, 0.5-20 µL
Mycoalert assay control set Lonza LT07-518 Aliquot positive controls and store at -20 °C.
Mycoalert Plus mycoplasma detection kit Lonza LT07-710 Aliquot reagent and substrate and store at -20 °C. Save remaining buffer and aliquot for negative control and store at -20°C.
Paraformaldehyde 16% Electron Microscopy Sciences 15710 Prepare stock by filtering through a PVDF syringe filter (Millex cat. no. SLVV033RS) and aliquot under a fume hood. Store at -20 °C.
Penicillin-streptomycin 10,000 U/mL Gibco 15140-122
Pipet aid
Plate reader with luminescent capabilities BioTek Synergy HT any plate reader with these specifications can be used
RPMI 1640 media Corning 10-040-CV
Scalpel Andwin 2975#21
Stericup Quick Release-GP sterile vacuum filtration system, 0.22 µm PES Express PLUS, 500 mL EMD Millipore S2GPU05RE
Steriflip-GP filter, 0.22 µm PES Express PLUS, 50 mL EMD Millipore SCGP00525
Sterile forceps Thermo Fisher Scientific 12-000-157
T25 flasks, tissue culture treated Corning 430639
T75 flasks, tissue culture treated Corning 430641U
Trypan blue solution 0.4% Gibco 15250-061
Trypsin EDTA 0.05% Corning 25-052-CI
ViaStain acridine orange/propidium iodide (AO/PI) solution Nexcelom CS2-0106-5ML

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References

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Griffiths, T. M., Ramos, C.,… More

Griffiths, T. M., Ramos, C., Haymaker, C. L. Generation and Expansion of Primary, Malignant Pleural Mesothelioma Tumor Lines. J. Vis. Exp. (182), e63374, doi:10.3791/63374 (2022).

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