Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Isolering af dyrkbare gær og skimmelsvampe fra jord for at undersøge svampepopulationsstruktur

Published: May 27, 2022 doi: 10.3791/63396
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, McMaster University

Summary

Denne protokol er en effektiv, hurtig metode til dyrkning af gær og formen Aspergillus fumigatus fra store sæt jordprøver på så lidt som 7 dage. Metoderne kan let ændres for at imødekomme en række inkubationsmedier og temperaturer efter behov for eksperimenter.

Abstract

Jord er vært for en utrolig mængde mikrobielt liv, hvor hvert gram indeholder op til milliarder af bakterie-, arkæale og svampeceller. Flercellede svampe såsom skimmelsvampe og encellede svampe, bredt defineret som gær, opfylder væsentlige roller i jordøkosystemer som nedbrydere af organisk materiale og som fødekilder for andre jordboere. Svampeartsdiversitet i jorden er afhængig af en lang række klimatiske faktorer såsom nedbør og temperatur samt jordegenskaber, herunder organisk materiale, pH og fugt. Mangel på tilstrækkelig miljøprøvetagning, især i regioner i Asien, Afrika, Sydamerika og Mellemamerika, hindrer karakteriseringen af jordsvampesamfund og opdagelsen af nye arter.

Vi karakteriserede jordsvampesamfund i ni lande på tværs af seks kontinenter ved hjælp af ~ 4.000 jordprøver og en protokol udviklet i laboratoriet til isolering af gær og skimmelsvampe. Denne protokol begynder med separat selektiv berigelse for gær og den medicinsk relevante skimmel Aspergillus fumigatus, i flydende medier, samtidig med at bakterievækst hæmmes. Resulterende kolonier overføres derefter til faste medier og behandles yderligere for at opnå rene kulturer efterfulgt af nedstrøms genetisk karakterisering. Gærartsidentitet etableres via sekventering af deres interne transskriberede spacer (ITS) region af den nukleare ribosomale RNA-genklynge, mens den globale populationsstruktur af A. fumigatus udforskes via mikrosatellitmarkøranalyse.

Protokollen blev med succes anvendt til at isolere og karakterisere jordgær og A. fumigatus populationer i Cameroun, Canada, Kina, Costa Rica, Island, Peru, New Zealand og Saudi-Arabien. Disse resultater afslørede tiltrængt indsigt i globale mønstre i jordgærdiversitet samt global befolkningsstruktur og svampedræbende resistensprofiler af A. fumigatus. Dette papir præsenterer metoden til isolering af både gær og A. fumigatus fra internationale jordprøver.

Introduction

Svampe i jordens økosystemer spiller væsentlige roller i nedbrydning af organisk materiale, næringsstofkredsløb og jordgødning1. Både kulturuafhængige (dvs. high-throughput sekventering) og kulturafhængige tilgange anvendes i vid udstrækning i studiet af jordsvampe 2,3. Mens den store mængde data, der genereres af metabarkodesekventering med høj kapacitet, er nyttig til at belyse brede mønstre i samfundsstruktur og mangfoldighed, kan den kulturafhængige tilgang give meget komplementær information om svampesamfundenes taksonomiske og funktionelle strukturer samt mere specifikke profiler af individuelle organismer gennem nedstrøms mangfoldighed og funktionelle analyser på grund af tilgængeligheden af rene svampekulturer.

På trods af at gær, der sjældent overstiger tusindvis af celler pr. Gram jord, er gær, bredt defineret som encellede svampe, essentielle nedbrydere og fødekilder for andre jordboere 4,5. Faktisk kan gær være de dominerende jordsvampe i kolde biosfærer som kontinental Antarktis 6,7. Jord er også et primært reservoir af medicinsk relevante gær, der forårsager alvorlige opportunistiske infektioner hos mennesker og andre pattedyr8. På trods af morfologiske ligheder er gærarter fylogenetisk forskellige og forekommer blandt filamentøse svampe i to store phyla, Ascomycota og Basidiomycota, inden for svamperiget9. Gær mangler en definerende DNA-signatur ved svampebarkodningsgenet, den interne transskriberede afstandsstykke (ITS) region i den nukleare ribosomale RNA-genklynge10, hvilket gør dem umulige at skelne fra andre svampe i metagenomics-undersøgelser og dermed nødvendiggør brug af kulturafhængige metoder til at isolere gærarter.

Protokollen nedenfor blev implementeret for at karakterisere jordgærsamfund i ni lande og identificere globale tendenser og mønstre i jordgærdiversitet 9,11,12. Metagenomics-tilgange er af begrænset anvendelse ved undersøgelse af målgrupper af organismer såsom gær 2,3. På grund af deres fylogenetiske mangfoldighed kan gær ikke skelnes fra andre svampe baseret på DNA-sekvens alene. Undersøgelse af gærpopulationer kræver således fortsat brug af kulturafhængig isolation. Dyrkning er dog ofte betydeligt mere tidskrævende og kræver mere personale til at udføre forsøgene. Derfor er protokollen optimeret og strømlinet til hurtigere behandling med begrænset personale. Den største fordel ved dyrkning er, at de identificerede gærarter er levende gær og ikke døde, og dermed er mere tilbøjelige til at være ægte jordboere snarere end forbigående celler, der er til stede i jorden. Det er blevet anslået, at ca. 40% af svampe-DNA i jord enten er forurenende stoffer fra andre miljøer, ekstracellulære eller kommer fra celler, der ikke længere er intakte, hvilket forårsager sekventeringsmetoder med høj kapacitet til at overvurdere svamperigdom med så meget som 55% 13. Kulturafhængig isolering kan let bekræfte gærarters identitet med den ekstra fordel at sikre ren kultur, der skal bruges i downstream-analyser. Faktisk blev rene kulturer af 44 formodede nye gærarter identificeret ved hjælp af denne jordisoleringsprotokol, der tillod brugen af en række metoder til at studere deres taksonomiske og funktionelle egenskaber i detaljer14.

Protokollen nedenfor kan også bruges til at isolere skimmelsvampe, der findes i jord, såsom A. fumigatus. Aspergillus fumigatus er en termofil og saprofytisk skimmelsvamp med en bred, global fordeling i jord15. Det er blevet isoleret fra adskillige kliniske og ikke-kliniske miljøer. Ikke-klinisk prøveudtagning omfatter almindeligvis luft, organisk affald (kompost, savstøv, tulipanløgaffald) og jord (landbrugs-, have- og naturlig jord)16,17,18,19. Aspergillus fumigatus er et humant opportunistisk patogen, der forårsager en række infektioner, der samlet betegnes aspergillose, der påvirker over 8 millioner mennesker over hele verden16,20. Cirka 300.000 mennesker over hele kloden lider af invasiv aspergillose, som er den mest alvorlige form for aspergillose16. Afhængigt af faktorer som patientpopulationen, infektionsstedet og effekten af svampedræbende terapi kan dødeligheden være så høj som 90%. I løbet af de sidste årtier er resistens over for svampedræbende terapier steget, hvilket kræver global overvågningsindsats i både kliniske og miljømæssige populationer for at spore disse resistensgenotyper 21,22,23. På grund af sin evne til at vokse ved temperaturer op til 50 ° C kan denne temperatur udnyttes til at vælge A. fumigatus-isolater fra jord ved hjælp af kulturafhængige metoder. Aspergillus fumigatus-isolater genotypes almindeligvis ved ni stærkt polymorfe korte tandem-gentagelseslokaliteter (STR), der har vist sig at have høj diskriminerende effekt mellem stammer24. Disse STR-genotyper kan sammenlignes med andre tidligere undersøgte populationer for at spore spredningen af A. fumigatus-genotyper, herunder lægemiddelresistensgener, rundt om i verden.

Nedenfor beskriver vi en protokol for hurtig isolering af gær og A. fumigatus fra jordprøver på en kulturafhængig måde. Afhængigt af mængden af jord, der opnås pr. prøve, kan jordprøverne deles mellem de to protokoller. I sammenligning med lignende metoder, der isolerer gær og A. fumigatus fra jord, bruger denne protokol 10 gange mindre jord pr. Opnået isolat. Undersøgelser, der forsøger at isolere A. fumigatus fra jord, kræver mellem 1 og 2 g jord pr. isolat, mens denne protokol kun kræver 0,1-0,2 g jord 18,19,25. Denne protokol bruger mindre plast og beholdere, der letter dens design med høj kapacitet. Derfor kan et større antal prøver behandles ved hjælp af mindre plads til udstyr såsom inkubatorer og rulletromler. Jordprøver kan behandles fuldt ud for at opnå isolater på så lidt som 7 dage. Denne protokol er optimeret til at tillade behandling af op til 150-200 prøver pr. Dag pr. Person.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: Alle trin, der anvender internationale jordprøver og / eller A. fumigatussporer og mycelia, kræver arbejde inden for et biosikkerhedsskab til niveau 2-organismer (BSCII).

1. Isolering af gær fra jord

  1. Fremstilling af antibakterielle og antifungale opløsninger
    1. Chloramphenicolpulver suspenderes i 70 % ethanol for at fremstille en 50 g/l stamopløsning. Sterilisation ved sprøjtefiltrering og opbevares ved 4 °C.
      BEMÆRK: Dette antibiotikum forhindrer væksten af de fleste bakterier under jordgærisolering. Da chloramphenicolresistente bakterier stadig kan vokse, skal kolonimorfologi tages nøje i betragtning, når man skelner gær fra bakterier. Yderligere antibiotika kan tilsættes til medier, når man arbejder med jord, der mistænkes for at indeholde antibiotikaresistente bakteriestammer. Bakteriel forurening i chloramphenicol-supplerede medier var ikke et problem, der opstod ved isolering af gær fra miljøjord.
    2. Benomylpulveret suspenderes i DMSO for at fremstille en 5 g/l stamopløsning. Sterilisation ved sprøjtefiltrering og opbevares ved 4 °C.
      BEMÆRK: Dette selektive svampedræbende lægemiddel forhindrer væksten af de fleste filamentøse svampe uden at påvirke gærvæksten under jordgærisolering26,27.
  2. Fremstilling af kulturmedier og sterilt udstyr
    1. For at forberede YEPD (gærekstrakt-Peptone-Dextrose) bouillon tilsættes 10 g gærekstrakt, 20 g pepton og 20 g dextrose til 1 liter dobbeltdestilleret vand. Rør til godt blandet og autoklave i 40 min ved 121 °C. Opbevares ved stuetemperatur indtil brug.
    2. YEPD fast agar medium
      1. Bland 10 g gærekstrakt, 20 g pepton, 20 g dextrose og 20 g agar i 1 liter vand. Rør godt for at blande og autoklave i 40 minutter ved 121 °C.
      2. Når de er tilstrækkeligt afkølet, tilsættes 1 ml chloramphenicol og benomyl fra stamopløsninger for at bringe de endelige koncentrationer af de to antimikrobielle stoffer op på henholdsvis 50 mg/l og 5 mg/l.
      3. Bland godt ved omrøring og hæld i petriskåle med en diameter på 10 cm. Lad det stå ved stuetemperatur natten over for at indstille og opbevare ved 4 °C indtil brug.
        BEMÆRK: Fra 1 liter YEPD kan ca. 40 plader hældes.
    3. Steriliser applikatorpinde af træ med almindelig spids og genanvendelige cellespredere ved autoklavering og opbevar ved stuetemperatur.
  3. Inkubation af jord i flydende bouillon
    1. Forbered et sæt sterile 13 ml kulturrør ved at mærke dem med jordprøve-ID.
    2. Ved hjælp af en serologisk pipette tilsættes 5 ml YEPD bouillon suppleret med chloramphenicol og benomyl i hvert rør.
    3. Arbejde i en BSCII, overfør ~ 0,1 g jord til det passende kulturrør ved hjælp af en steril, træ almindelig applikator.
      BEMÆRK: Brug en frisk applikator til hver jordprøve, og kassér straks efter brug for at undgå krydskontaminering mellem prøverne.
    4. Dæk røret sikkert til det første stop for at forhindre spild, men tillad stadig luftudveksling under inkubation. Kulminer kulturrørene i en rulletromle i 24 timer ved en temperatur, der anses for optimal til maksimering af gærvækst.
      BEMÆRK: Inkubationstemperaturen bør fastsættes på grundlag af den gennemsnitlige årlige temperatur i jordprøvernes oprindelsesland. Ved isolering af jordgær fra Island blev dyrkningsrørene f.eks. inkuberet ved 14 °C, mens jord fra Saudi-Arabien blev udruget ved 30 °C. På grund af langsommere gærvækst ved lavere temperaturer skal inkubationstiden muligvis forlænges i op til 72 timer.
  4. Overfør supernatanten til det faste medium.
    1. Brug sættet YEPD + chloramphenicol + benomylagarplader fremstillet i trin 1.2 til at mærke dem med jordprøve-ID'et.
    2. De i trin 1.3 beskrevne kulturrør fjernes fra rulletromlen. Arbejder i en BSCII, kort vortex røret for at trække jordpartikler og celler, der kan have slået sig ned i bunden tilbage i suspension.
    3. Brug en mikropipette til at overføre 100 μL af supernatanten til en plade. Brug en steril, genanvendelig cellespreder til at sprede væsken grundigt og jævnt over agaroverfladen.
      BEMÆRK: Arbejde i sæt med 10 prøver kan fremskynde denne proces betydeligt. Pipetter supernatanten først på 10 plader, og udfør derefter spredning. Brug en frisk spreder til hver prøve for at undgå krydskontaminering mellem prøverne.
    4. Stak pladerne i plastikposer, forsegl og inkuber på hovedet i 2-3 dage ved den samme temperatur, der tidligere blev brugt til inkubation af flydende bouillon, indtil mikrobiel vækst er synlig.
  5. Påvisning af gær og striber for enkeltkolonier
    1. Efter tilstrækkelig inkubationstid (typisk 2-3 dage, men kan tage længere tid ved lavere temperaturer), skal du inspicere pladerne i en BSCII for enhver gærvækst. Kig efter cremede, runde, matlignende gær, der let kan skelnes fra bakterie- og skimmelkolonier.
      BEMÆRK: Nogle gær producerer farvede pigmenter og kan forekomme sort / brun, gul eller rød, men deres overordnede kolonitekstur og form ligner ikke-pigmenterede gær.
    2. Vælg en gærlignende koloni fra hver plade til videre behandling.
      BEMÆRK: Hvis der observeres mere end én type morfologi på en enkelt plade, skal du vælge en repræsentativ koloni for hver morfologisk type.
    3. Brug sterile, almindeligt spidsede applikatorpinde af træ til at overføre hver valgt koloni til en frisk YEPD + chloramphenicol + benomylplade og stribe til enkeltkolonier. Udfør tre separate striber.
      1. Stryg frem og tilbage over en tredjedel af pladen ved hjælp af en applikatorpind. Begynd den anden og tredje streak ved at stryge applikatoren over den foregående streak en gang. Brug en ny applikatorpind til hver stribe.
        BEMÆRK: Brug en plade pr. Isolat. Applikatorer kasseres umiddelbart efter brug for at undgå krydskontaminering mellem prøverne.
    4. Stak pladerne i plastikposer, forsegl og inkuber på hovedet i 2-3 dage ved samme temperatur, der tidligere blev brugt, indtil enkelte kolonier bliver synlige.
  6. Identifikation af gærarter via ITS-sekventering
    1. Vælg en godt adskilt, enkelt koloni pr. jordisolat og subkultur på en frisk YEPD + chloramphenicol + benomylplade for at opnå flere celler. Inkuberes i 2-3 dage ved samme temperatur, der tidligere blev brugt.
    2. De friskvoksne celler høstes, og de anbringes i -80 °C fryserør indeholdende 1 ml steriliseret 30 % glycerol i dobbeltdestilleret vand for at skabe cellesuspensioner. Disse suspensioner fastholdes ved -80 °C som lageropløsninger.
    3. Brug friske celler til at udføre koloni-PCR (polymerasekædereaktion) med primere ITS1 (5' TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3') og ITS4 (5' TCCTCCGCTTATTGATATGC 3') for at forstærke svampebarkodningsgenet, ITS9. Brug følgende termocyclingbetingelser: et indledende denatureringstrin ved 95 °C i 10 minutter efterfulgt af 35 cyklusser på i) 95 °C i 30 s, ii) 55 °C i 30 s og iii) 72 °C i 1 min.
      BEMÆRK: Colony PCR har en høj succesrate og en hurtigere behandlingstid end DNA-ekstraktion efterfulgt af PCR.
    4. Hvis koloni-PCR gentagne gange fejler for en stamme, skal du ekstrahere DNA ved hjælp af den valgte protokol og udføre ITS PCR ved hjælp af ekstraheret genomisk DNA som skabelon (brug de samme termocyclingbetingelser som ovenfor).
      BEMÆRK: En relativt billig chloroformbaseret DNA-ekstraktion anbefales28.
    5. Udfør Sanger-sekventering for at bestemme DNA-sekvensen for den amplificerede ITS-region for hver stamme.
    6. Sammenlign den opnåede ITS-sekvens af gærstammerne med sekvenser deponeret i offentlige databaser som NCBI GenBank og UNITE for at fastslå artsidentitet.

2. Isolering af Aspergillus fumigatus fra jord

  1. Forbered 1 ml steril Sabouraud dextrose bouillon (SDB) suppleret med antibiotikumet chloramphenicol pr. Jordprøve.
    1. Der tilsættes 10 g pepton og 20 g dextrose til 1 liter destilleret vand. Autoklave ved 121 °C i 40 min.
    2. SDB'en afkøles til ~50 °C, der tilsættes 1 ml 50 g/l chloramphenicol for at bringe koncentrationen op på 50 mg/l.
      BEMÆRK: Chloramphenicol fremstilles det samme som beskrevet ovenfor til gærisolering. Bortset fra at hæmme bakterievækst forhindrer chloramphenicol også produktionen af gas fra bakterier, der får rørene til at åbne under inkubationstrinnet beskrevet i trin 2.2.
    3. Aseptisk aliquot 1 ml SDB i et 1,5 ml mikrocentrifugerør pr. jordprøve ved hjælp af en mekanisk pipette.
  2. Tilsæt jord til 1,5 ml mikrocentrifuge rør.
    1. Læg bænkbeklædning eller absorberende polstring inde i en BSCII for at hjælpe med bortskaffelse af spildt jord.
    2. Brug autoklaverede applikatorpinde til at overføre ca. 0,1 g jord til et 1,5 ml mikrocentrifugerør indeholdende 1 ml SBD. Luk røret og hvirvelen. Den suspenderede jord inkuberes ved 50 °C i 3 dage.
      BEMÆRK: Omrystning under inkubation er ikke påkrævet.
  3. Mycelhøst af jordpodet bouillon
    1. Forbered maltekstrakt agar (MEA) plader.
      1. Pr. liter MEA: Tilsæt 20 g maltekstrakt, 20 g dextrose, 6 g pepton og 15 g agar til 1 liter destilleret vand. Autoklave ved 121 °C i 40 min.
      2. MEA afkøles til ~50 °C, og der tilsættes derefter 1 ml 50 g/l chloramphenicol for at opnå en slutkoncentration på 50 mg/l.
    2. Overfør mycelia fra den jordpodede bouillon til MEA-plader.
      1. Identificer jordinokulumer, der har synlig mycelvækst ved SDB til luftgrænse.
      2. Brug steriliserede applikatorpinde af træ til at overføre mycelia til midten af en MEA-plade. MEA-pladerne inkuberes ved 37 °C i 3 dage.
  4. Udvælgelse af mycelia med A. fumigatus morfologiske egenskaber.
    1. Identificer skimmelkolonier, der har karakteristiske A. fumigatus morfologiske egenskaber (grøn ruskind som vækst).
    2. Arbejd i en BSCII, brug steriliserede træ-applikatorpinde med almindelig spids eller en podningssløjfe til at høste konidier / mycelia ved at skrabe overfladen en gang. Overfør sporerne / mycelia til midten af en MEA-plade ved at stryge på agaren til enkeltkolonier. Inkuberes ved 37 °C i 2 dage.
      BEMÆRK: Da flere A. fumigatus stammer og / eller andre svampe kan være til stede på pladen, er det vigtigt at stribe for enkeltkolonier. Enkeltkolonistribeprotokollen i trin 1.5.3 i gærisoleringsprotokollen kan anvendes.
    3. Ved hjælp af en steril applikatorpind eller podningssløjfe subkulturerer en enkelt koloni genereret i trin 2.4.1.2 på MEA ved at stribe kolonien en gang. Spred de høstede sporer i midten af pladen. Inkuberes ved 37 °C i 2 dage.
  5. Høst af A. fumigatussporer /mycelia til opbevaring i kulturen
    1. Forbered en steril 30% glycerolopløsning (til en 100 ml opløsning tilsættes 30 ml 100% glycerol blandet med 70 ml dobbeltdestilleret vand, steriliseret ved 121 ° C i 40 minutter).
    2. Arbejd i en BSCII, brug en p1000 pipette til at aspirere 1 ml af 30% glycerolopløsningen. Hæld 1 ml glycerolopløsning på A. fumigatuskolonien for at høste sporer / mycelia.
      1. På grund af hydrofobiciteten af A. fumigatus sporer / mycelia skal du bruge pipettespidsen til at ridse et tæt sporuleret område af pladen.
        BEMÆRK: Når glycerol dispenseres i ridsen, vil glycerol klæbe til ridseområdet i stedet for at rulle over agaren.
      2. Dispenser langsomt glycerol på ridseområdet for at løsne sporerne og suspendere dem i glycerolopløsningen.
      3. Når den er helt dispenseret, skal du vippe pladen let og aspirere glycerolsporen / mycelia-suspensionen.
        BEMÆRK: Ca. 750 til 800 μL vil blive aspireret.
      4. Suget overføres til et sterilt fryserør og opbevares ved -80 °C. Om nødvendigt oprettes arbejdslager ved at gentage trin 2.5.2.1 til 2.5.2.4.
  6. Fænotypisk identifikation af A. fumigatus stammer
    1. Ved hjælp af sporematerialet fra trin 2.5.2 skabes en 100x fortynding i vand.
      1. Aspirere 10 μL af mycel- og sporelagrene og dispensere i 990 μL vand. Vortex suspensionen.
    2. 10 μL af den fortyndede sporesuspension hældes på et standardmikroskopglas.
    3. VALGFRIT: Pletter mycel- og sporesuspensionen med methylenblåt.
      1. For at plette med methylenblåt skal konidierne og conidiophorerne fastgøres til diaset ved at føre diaset over en Bunsen-brænder, indtil det er tørt.
      2. Påfør methylenblåt i 1-2 min og vask af med vand.
      3. Tør diaset med blottingpapir.
    4. Brug et sammensat mikroskop ved 400x forstørrelse, se suspensionen og find conidiophores. Sammenlign den observerede conidiophore morfologi med A. fumigatus conidiophore morfologi.
  7. Molekylær identifikation af A. fumigatus stammer
    1. Uddrag DNA fra hvert isolat efter almindelige svampe-DNA-ekstraktionsprotokoller.
    2. Brug primere, der er specifikke for Aspergillus β-tubulin-gener (β-tub1 og β-tub4), kør PCR og opnå sekvensen for de forstærkede produkter efter protokoller beskrevet af Alcazar-Fuoli et al.17.
      1. Sammenlign de opnåede sekvenser med sekvenser deponeret i offentlige databaser såsom NCBI GenBank ved hjælp af BLAST.
      2. Bekræft, at stammesekvenserne er et topmatch til A. fumigatus-sekvenser i databasen.
    3. Som alternativ til trin 2.7.2 skal der køres en multiplex PCR-reaktion rettet mod A. fumigatus-parringstyperne MAT1-1 og MAT1-229.
      1. Brug følgende tre primersekvenser i multiplex PCR-reaktionen: AFM1: 5'-CCTTGACGCGATGGGGTGG-3'; AFM2: 5′-CGCTCCTCATCAGAACAACTCG-3′; AFM3: 5′-CGGAAATCTGATGTCGCCACG-3′.
      2. Brug følgende termocyklistparametre: 5 min ved 95 °C, 35 cyklusser på 30 s ved 95 °C, 30 s ved 60 °C og 1 min ved 72 °C før de sidste 5 minutter ved 72 °C.
      3. Kør gelelektroforese for at identificere produkterne; se efter 834 bp MAT-1 eller 438 bp MAT1-2. Brug A. fumigatus stammer, der har bekræftet parringstypeforstærkning som positive og negative kontroller.
  8. Mikrosatellitgenotypning af A. fumigatus-stammer gennem fragmentanalyse
    BEMÆRK: Selvom nedenstående trin stort set dækker genotypning af A. fumigatus ved ni mikrosatellit (STR) loci, er kun få vigtige overvejelser blevet fremhævet. For detaljer om A. fumigatus STR genotypning henvises til De Valk et al.24,30.
    1. Forbered tre PCR multiplex masterblandinger ved hjælp af STRAf primere tidligere beskrevet af De Valk et al.24.
      1. Fluorescerende mærke fremad primere for at bestemme fragmentstørrelse gennem kapillær elektroforese. Det skal sikres, at koncentrationen af de forreste primere er halvdelen (0,5 μM) koncentrationen af de omvendte primere (1 μM) i masterblandingen.
        BEMÆRK: For de bedste resultater skal du bruge fluorescerende etiketter, der har absorbansbølgelængder, der matcher dem i den valgte farvestofstandard, der anvendes under kapillær elektroforese
      2. Brug varmstartspolymerase for de bedste resultater.
      3. Brug en DNA-koncentration på 0,1 ng pr. Reaktion.
    2. Der køres multiplex-PCR for hver stamme ved hjælp af følgende PCR-program: 95 °C i 10 minutter, 40 cyklusser på 95 °C i 30 s, 60 °C i 30 s og 72 °C i 60 s efterfulgt af 72 °C i 10 minutter og et hold ved 4 °C.
    3. Kontroller for forstærkede produkter gennem gelelektroforese.
    4. Fortynd produkterne til det ønskede niveau (typisk ~ 50x) som anbefalet af fragmentanalysespecialister og kør kapillær elektroforese. Udfør tre kørsler for hver stamme, hvor hver kørsel dækker tre multipleksede reaktioner med tre forskellige fluorescerende sonder.
    5. For at bestemme den korrekte fragmentstørrelse for hvert af de ni STR-loci skal du bruge software, der er i stand til fragmentanalyse.
      1. Hent de rå data opnået fra kapillær elektroforese. Scor fragmentstørrelserne baseret på den største top ved hjælp af fragmentanalysesoftwaren (f.eks. Osiris).
      2. Konverter fragmentstørrelserne til gentagne tal for hvert af de ni loci. Brug fragmentstørrelserne af gentagelsestallene for referencestammen Af293 som tidligere beskrevet af De Valk et al.24.
        BEMÆRK: Små variationer i fragmentstørrelser kan forekomme mellem forskellige kapillære elektroforeseplatforme. Det er derfor vigtigt at inkludere en fælles referencestamme (og en intern stige) med kendt fragmentstørrelse for hver af de ni loci for genotypningsstammer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Gærisolering fra jord
Ovennævnte gærisoleringsprotokol blev implementeret til dyrkning af gær fra jordprøver, der stammer fra 53 steder i ni lande 9,12. I alt blev 1.473 gærstammer isoleret fra 3.826 jordprøver. I betragtning af de forskellige klimatiske forhold i de ni oprindelseslande blev den bedste inkubationstemperatur for hvert land bestemt på grundlag af dets årlige gennemsnitstemperatur (tabel 1). På grund af den langsommere gærvækst ved 14 °C blev jordprøver fra Island inkuberet på en rulletromle i yderligere 48 timer (96-120 timer i alt). Efter 2-3 dages inkubation på fast medium var mikrobiel vækst synlig på plader for alle prøver (figur 1A). En tilfældigt udvalgt koloni for hver gærmorfologi, der var til stede på en plade, blev stribet for enkeltkolonier på friske plader (figur 1B).

Hastigheden af vellykket gærisolering varierede mellem lande (tabel 1). For eksempel blev 97 gærstammer dyrket fra 562 saudiarabiske jordprøver (17,3%), mens 261 gær blev dyrket fra 300 canadiske jordprøver (87%). Der bør udføres en sjældenhedsanalyse for at afgøre, om der er udført tilstrækkelig jordprøvetagning til at opnå nøjagtige skøn over den sande gærdiversitet på prøveemner. Et eksempel på sjældnefactionanalyser for hvert land blev præformet, hvor Shannon-mangfoldighedsindekset blev brugt som et mål for jordgærdiversitet (figur 2). De resulterende rarefaction-kurver nærmede sig mætningsasymptoten, hvilket indikerer, at yderligere prøveudtagning sandsynligvis ikke har givet mere gærdiversitet.

Sekventering af ITS-regionen afslørede, at de 1.473 gærisolater kan kategoriseres i 134 forskellige arter. Dette omfattede 90 kendte arter og 44 potentielt nye arter. Vi anvendte en mixed-effects model til at identificere prædiktorer for global dyrkbar jordgærdiversitet, som kvantificeret af Shannon diversitetsindeks31. I denne model blev gennemsnitlig årlig nedbør, gennemsnitlig årlig temperatur, højde og afstand til ækvator af prøveudtagningsstederne monteret som faste effekter, mens prøveudtagningsland blev indstillet som en tilfældig effekt9. Denne model identificerede, at gennemsnitlig årlig nedbør skulle være signifikant korreleret med Shannon-mangfoldighedsindekset (p = 0,012), mens der ikke blev fundet signifikante korrelationer mellem andre forudsigelsesvariabler og Shannon-mangfoldighedsindekset9.

For at sammenligne denne kulturbaserede protokol med kulturuafhængige metoder sammenlignede vi disse resultater med en tidligere undersøgelse af Tedersoo og kolleger, der undersøgte den globale mangfoldighed af jordsvampe ved hjælp af metagenomics2. Tedersoo og kolleger udførte high-throughput sekventering af ITS-regionen på DNA direkte ekstraheret fra jordprøver fra 39 lande, hvoraf fire, nemlig Cameroun, Canada, Kina og New Zealand, også blev udtaget i denne undersøgelse. Vi udførte BLAST-søgninger for at identificere ITS-sekvenser, der var til stede i begge datasæt32, og fandt ud af, at 26% af ITS-sekvenserne havde et signifikant match (>98.41% nukleotididentitet) i metagenomics-datasættet. Imidlertid matchede <3% en svampesekvens fra samme land, mens de resterende 23% matchede en svampesekvens fundet i et andet land9. Vi havde større succes end metagenomics-studiet med at kommentere ITS-sekvenserne med gærartsidentitet. Tedersoo og kolleger rapporterede i alt 50.589 svampe operationelle taksonomiske enheder (OTU'er), hvor antallet af gær-OTU'er ikke var kendt. Af disse svampe-OTU'er blev 33% blot kommenteret som environmental_sequence (724, 1,4%), uncultured_soil_fungus (2.405, 4,8%), uncultured_ectomycorrhizal_fungus (1.407, 2,8%) eller uncultured_fungus (11.898, 23,5%).

Aspergillus fumigatus isolering fra jord
Efter 3 dages jordinkubation ved 50 ° C i 1 ml SDB i et mikrocentrifugerør kan mycelia findes voksende inden for SDB, på SDB til luftgrænsen og / eller på indvendige vægge. Aspergillus fumigatus mycelia findes typisk voksende på SDB til luftgrænse, men kan også høstes lige under SDB-overfladen. Efter dette trin overføres mycelia til MEA og dyrkes i 3 dage ved 37 ° C. Mycelvækst på plader kan kun danne den grønne ruskindsmorfologi, der er typisk for A. fumigatus (figur 3A). Mere almindeligt kan andre termotolerante forme være til stede i samme jord og vokse med A. fumigatus på samme plade eller alene (figur3B-D). Aspergillus fumigatus isolationshastigheder kan variere mellem geografiske steder, svarende til hvad der er fundet for jordgær. For eksempel blev der i Vancouver, Canada opnået 251 isolater gennem denne metode fra 540 jordprøver (46,5%) (upublicerede resultater). I Modsætning hertil blev der i Cameroun høstet 51 A. fumigatus-isolater fra 495 jordprøver (10,3%)33.

A. fumigatus conidiophore struktur kan ses og identificeres ved hjælp af lysmikroskopi. Conidiophores har en kugle på pindmorfologi (figur 4). Derudover er A. fumigatus conidiophores uniseriate, hvor phialiderne, der er fastgjort til conidierne, er fastgjort direkte til den sfæriske vesikel. I andre Aspergillus-arter er conidiophores biseriat, hvor phialiderne er forbundet med metulae fastgjort til vesiklen.

Flere softwareprogrammer er tilgængelige til at udføre fragmentanalyse af de rå data fra kapillær elektroforese, der konverterer kapillærelektroforesespektret til fragmentstørrelser. Figur 5 er et kromatogram genereret af programmet Osiris. De tre kanaler, der visualiserer fragmentlængderne af A. fumigatus dinukleotid (2A, 2B og 2C), trinukleotid (3A, 3B og 3C) og tetranukleotid (4A, 4B og 4C) STR loci er vist. Derudover vises også PCR-artefakter, der opstår, hvis prøvens DNA-koncentration under PCR er for høj. De højeste toppe i hver farve repræsenterer fragmentstørrelserne af de tre STR loci i dette plot.

Den genetiske variation, der er til stede mellem A. fumigatus STR-genotyper, kan visualiseres ved hjælp af R-pakken poppr. R-scriptet bruvo.msn skaber en parvis Bruvos genetiske afstandsmatrix mellem hvert par genotyper. Denne matrix bruges derefter til at generere et minimum spanning network (MSN). Et MSN af høj kvalitet kan derefter genereres ved hjælp af R-scriptet plot_poppr_msn eller imsn (Figur 6). En diskriminerende analyse af hovedkomponenter (DAPC) er en anden metode til at visualisere de genetiske forhold mellem stammer (figur 7). R-scriptet dapc i R-pakken adegenet bruges til at udføre DAPC og kan bruges med kendte eller ukendte gruppe priors. Med ukendte gruppe priors bruger den K-betyder klyngedannelse til at identificere det sandsynlige antal grupper af individer.

Figure 1
Figur 1: Gærisolering fra jordprøver. (A) Mikrobiel vækst er synlig på fast agar efter 2-3 dages inkubation. Gærkolonier kan ses spredt blandt andre svampe-/bakteriekolonier. En repræsentativ gærkoloni for hver morfologisk type på en plade vælges til stribe for enkeltkolonier. (B) Der udføres tre striber for at opnå enkelte kolonier af gærisolater. En plade blev brugt til at opnå hvert jordisolat. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Sjældenhedsanalyse af jordprøvetagning. I hvert af de ni undersøgte lande nærmer jordgærdiversiteten, som kvantificeret ved Shannon-mangfoldighedsindekset, mætning, når antallet af jordprøver stiger. Dette tal blev tilpasset fra 9. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Aspergillus fumigatus morfologi på Sabouraud dextroseagar. (A) Grøn ruskindslignende A. fumigatus vækstmorfologi. (B-D) A. fumigatus vækst med andre termofile forme til stede i jordprøven. A. fumigatus conidiation er synligt reduceret i B og D. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Foto af en Aspergillus fumigatus conidiophore under et lysmikroskop. Skalabjælke = 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Osiris output af ni mikrosatellit loci fra en Aspergillus fumigatus stamme. Udgangene svarer til (A) dinukleotid (2A, 2B og 2C), (B) trinukleotid (3A, 3B og 3C) og (C) tetranukleotid (4A, 4B og 4C) STR loci. Fremadgående primer 5 'fluorescerende etiketter er: A = 6-FAM; B = HEX; C = ATTO550. Multiplexreaktionsprodukter blev fortyndet 30x før kapillær elektroforese. LIZ600 farvestofstandarden blev brugt under kapillær elektroforese. Rådata blev analyseret ved hjælp af peak-analysesoftwaren Osiris, der identificerede potentielle toppe mellem 60 og 400 bp. Flere PCR-artefakter er off-scale toppe, der forårsager fluorescensblødning, stammende toppe og N-1 toppe (C). Forkortelser: 6-FAM = 6-carboxyfluorescein; HEX = hexachlorfluorescein; STR = korte tandem gentagelser; RFU = relative fluorescensenheder; BPS = basepar. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Minimum-spanning netværk, der viser det genetiske forhold mellem MLG'er af A. fumigatus fra Island og Northwest Territories i Canada. Hver node repræsenterer en MLG, hvor nodestørrelsen svarer til antallet af stammer for hver MLG. Knuder, der er mere genetisk ens, har mørkere og tykkere kanter, mens knuder genetisk fjerne har lysere og tyndere kanter. Denne figur blev tilpasset fra 34. Forkortelser: ISL = Island; NWT = Nordvestlige territorier i Canada; MLG = multilocus genotype. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Genetisk klyngedannelse ved hjælp af diskriminantanalyse af hovedkomponenter (DAPC) af Islandske, NWT, eurasiske, nordamerikanske og oceaniske A. fumigatuspopulationer . Isolater blev genotypet på ni mikrosatellitlokaliteter og klonkorrigeret, i alt 1.703 unikke multilocusgenotyper. Genotyper blev farvet efter geografisk oprindelse. Denne figur blev tilpasset fra 34. Forkortelser: DAPC = diskriminantanalyse af hovedkomponenter; NWT = Nordvestlige territorier; ISL = Island; CMR = Cameroun; CAN = Hamilton, Ontario, Canada; BEL = Belgien; FRA = Frankrig; DEU = Tyskland; IND = Indien; NLD = Nederlandene; NOR = Norge; NZL = New Zealand; ESP = Spanien; CHE = Schweiz; USA = Usa. Klik her for at se en større version af denne figur.

Land Inkubationstemperatur (°C) Jordprøver Gærisolater Kendte arter/ Nye arter
Cameroun 30 493 110 10/9
Canada 23 300 261 34/12
Kina 23 340 230 23/5
Costa Rica 30 388 95 20/2
Frankrig 23 327 175 12/2
Island 14 316 211 11/0
New Zealand 23 610 155 14/4
Peru 23 490 139 30/9
Saudi-Arabien 30 562 97 8/1
Total 3826 1473 90/44

Tabel 1: Jordgærisolering fra ni lande på seks kontinenter. Inkubationstemperaturen for jordprøver fra hvert land blev bestemt ud fra dens gennemsnitlige årlige temperatur. Resultaterne præsenteret her er tilpasset fra 9,12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen udviklet til isolering af gær og A. fumigatus fra jord er en hurtig og effektiv metode til jordbehandling med høj kapacitet og svampeisolering. Protokollen kræver kun en lille mængde jord (0,1-0,2 g) pr. prøve, hvilket gør det muligt at udtage prøver af flere steder med lignende indsats. Den hurtige behandlingstid sikrer, at resultaterne kan opnås inden for en kort tidsramme og giver tid til fejlfinding og gentagelse af eksperimenter, hvis det er nødvendigt. Denne protokol kan let replikeres på tværs af mange laboratorieindstillinger ved hjælp af standard mikrobiologi og celledyrkningsudstyr. Men når man isolerer gær eller forme fra international jord, kræves der ekstra forholdsregler. Alt ikke-engangsplastisk udstyr, såsom plastbakker og cellespredere, skal steriliseres ved nedsænkning i 10% blegemiddel efterfulgt af autoklavering. Den brugte bænkfrakke skal forsegles i en plastikpose og steriliseres i en autoklave inden kassering.

For at bemærke kan antallet og identiteten af gær isoleret ved hjælp af protokollen ovenfor begrænses af de anvendte inkubationsbetingelser og medier. For eksempel kan 24 timers inkubation i rulletromlen favorisere isoleringen af hurtigt voksende aerobe gær over langsomt voksende arter. Derudover kan brugen af næringsrigt YEPD-medium til gærisolering have udelukket gærarter med forskellige næringsbehov og præferencer. Desuden oplever de fleste steder, der er udtaget her, sæsonvariationer i temperatur og andre klimatiske forhold i løbet af året. Hvis tiden og ressourcerne tillader det, kan de samme jordprøver behandles under en række forskellige temperaturer for at muliggøre isolering af et bredere udvalg af gær, der befinder sig i disse jordarter.

Mens kulturuafhængige metoder er afgørende for at belyse store mønstre i miljømæssig svampediversitet, er de ikke tilstrækkeligt informative for målgrupper af svampe som gær. Brugen af kulturafhængig isolation muliggjorde en omfattende undersøgelse af den globale jordgærdiversitet og dens forudsigere9. Mens metagenomics-undersøgelsen udført af Tedersoo og kolleger identificerede globale prædiktorer og mønstre i jordens svampediversitet, kunne omfanget af disse fund specifikt for gærdiversitet ikke belyses2. Tedersoo og kolleger identificerede gennemsnitlig årlig nedbør som en vigtig klimatisk drivkraft for jordens svampediversitet over hele verden2. Denne undersøgelse fandt en lignende sammenhæng mellem gennemsnitlig årlig nedbør og dyrkbar gærdiversitet i globale jordarter og fremhævede, at kulturafhængige metoder kan supplere og udvide resultaterne af high-throughput sekventeringsmetoder9.

Tilsætningen af chloramphenicol er et vigtigt skridt i fremstillingen af både faste og flydende medier for at forhindre svampevækstinterferens af bakterier. Tilsætningen af chloramphenicol til flydende medier er afgørende, da manglen på antibiotika vil gøre det muligt for bakterierne i jorden at fermentere. Dette vil føre til produktion af gasser, der med magt åbner mikrocentrifugerør eller 13 ml kulturrør, der anvendes under jordinkubation i protokollen. Hvis bakteriel forurening i chloramphenicol indeholdende agar / bouillon er et problem, kan chloramphenicol erstattes eller suppleres med stærkere antibiotika. Ved isolering af A. fumigatus fra jord kan SD bouillon erstattes med en Tween 20 opløsning (0,2 M NaCl med 1% Tween 20) for at hjælpe med at suspendere den hydrofobe A. fumigatus conidia35,36. Efter suspension kan 100 μL belagt på SD-agar og inkuberes ved 50 °C.

Aspergillus fumigatus vokser hurtigt og sporulerer rigeligt, når det inkuberes alene på både SD agar og MEA medier mellem 22 ° C og 50 ° C. Afhængigt af hvilke andre termotolerante arter der er til stede i jordprøven, kan A. fumigatus vækst og sporulation imidlertid hindres (figur 3A, D). Under en sådan situation kan der kræves et til flere subkultureringstrin for at opnå en ren koloni til efterfølgende høst og karakterisering.

Fragmentanalysen af A. fumigatus stammer i figur 5 blev udført ved hjælp af programmet Osiris. Flere PCR-artefakter er blevet fremhævet i figur 5C og diskuteres detaljeret af De Valk et al.30. B-1 stammende toppe, der har kortere gentagelsesværdier, skyldes strengglidning under syntesen af antisense-strengen af DNA-polymerasen. N-1-toppe opstår, hvis DNA-koncentrationen er for høj under PCR. Den anbefalede DNA-koncentration er 0,1 ng som angivet i protokollen ovenfor. En anden artefakt er farvestofblødning, der kan afhjælpes ved hjælp af fluorescerende etiketter med ikke-overlappende absorbansbølgelængder. For eksempel genererer de fluorescerende etiketter 6-FAM, HEX og ATTO550 samt LIZ600-farvestofstandarden forskellige fragmenttoppe (figur 5). Endelig, for at forhindre off-scale toppe, fortyndes hver PCR-reaktion (i dette tilfælde var det ~ 50x fortynding) før kapillær elektroforese. For yderligere at reducere fluorescensen af de ubrugte fremadgående primere i reaktionsblandingen halveres de fremadgående primerkoncentrationer i forhold til de omvendte primere, når masterblandingen oprettes.

Den høje gennemstrømning og konservative karakter af denne protokol giver mulighed for en relativt hurtig og nem erhvervelse af mange gær og forme fra jord. Prøveudtagningsmetoden er dog to hovedbegrænsninger. For det første blev de morfologiske egenskaber ved gærkolonier dyrket af jord brugt til at vælge unikke arter. Disse blev derefter subkultureret og brugt til artsidentifikation via ITS-sekventering. Dette blev gjort for at maksimere repræsentationen af tilstedeværende gærarter. Gærarter, der delte lignende eller identiske morfologier med de udvalgte kolonier, kan dog undlade at blive subkultureret. For det andet, under A. fumigatus-isolering , da kun en individuel koloni vælges pr. Jordprøve, vil tilstedeværelsen af flere individer i jordprøven blive savnet. Dette kan føre til en underrepræsentation af den sande genetiske mangfoldighed, der findes i stikprøvepopulationen, da der ikke indsamles unikke genotyper, der er til stede i den samme jordprøve. For at afbøde dette problem kan der under striben for enkeltkolonitrin efter den første dyrkning på faste medier indsamles flere enkeltkolonier for at opnå yderligere genotyper. Den lille mængde jord, der anvendes pr. prøve, hjælper med at minimere denne prøveudtagningsbegrænsning sammenlignet med metoder, der anvendte større mængder jord pr. prøve.

Brugen af denne højkapacitets- og arbejdseffektive protokol til isolering af gær og skimmel vil øge antallet af individer inden for jordpopulationen, samtidig med at der bruges mindre indsats pr. Prøve. Stigningen i statistisk effekt vil give et bedre billede af dyrkbare gærsamfund i jorden og hjælpe med at karakterisere jordpopulationer af A. fumigatus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.

Acknowledgments

Denne forskning blev støttet af tilskud fra Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (Grant No. ALLRP 570780-2021) og McMaster University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Sarstedt Inc 72.690.001
Benomyl powder  Toronto Research Chemicals B161380
Chloramphenicol powder  Sigma-Aldrich SKU: C0378-5G
Dextrose Sigma-Aldrich SKU: D9434-500G
Fragment Analysis Software NCBI's Osiris https://www.ncbi.nlm.nih.gov/osiris/
ITS sequence database NCBI GenBank  https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/
ITS sequence database UNITE  https://unite.ut.ee/
Peptone Sigma-Aldrich SKU: P5905-500G
Reusable cell spreaders  Fisher Scientific 08-100-12
Sterile 10 cm diameter Petri dishes  Sarstedt Inc 83.3902
Sterile 13 mL culture tubes  Sarstedt Inc 62.515.006
Wooden plain-tipped applicator sticks  Fisher Scientific 23-400-112
Yeast extract Sigma-Aldrich SKU: Y1625-250G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frac, M., Hannula, S. E., Belka, M., Jȩdryczka, M. Fungal biodiversity and their role in soil health. Frontiers in Microbiology. 9, 707 (2018).
  2. Tedersoo, L., et al. Global diversity and geography of soil fungi. Science. 346 (6213), 1256688 (2014).
  3. Egidi, E., et al. A few Ascomycota taxa dominate soil fungal communities worldwide. Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).
  4. Yurkov, A. M. Yeasts of the soil - obscure but precious. Yeast. 35 (5), 369-378 (2018).
  5. Botha, A. The importance and ecology of yeasts in soil. Soil Biology and Biochemistry. 43 (1), 1-8 (2011).
  6. Connell, L., et al. Diversity of soil yeasts isolated from South Victoria Land, Antarctica. Microbial Ecology. 56 (3), 448-459 (2008).
  7. Vishniac, H. S. A multivariate analysis of soil yeasts isolated from a latitudinal gradient. Microbial Ecology. 52 (1), 90-103 (2006).
  8. Kurtzman, C., Fell, J. W., Boekhout, T. The Yeasts: A Taxonomic Study. , Elsevier. (2011).
  9. Samarasinghe, H., et al. Global patterns in culturable soil yeast diversity. iScience. 24 (10), 103098 (2021).
  10. Xu, J. Fungal DNA barcoding. Genome. 59 (11), 913-932 (2016).
  11. Samarasinghe, H., Aljohani, R., Jimenez, C., Xu, J. Fantastic yeasts and where to find them: the discovery of a predominantly clonal Cryptococcus deneoformans population in Saudi Arabian soils. FEMS Microbiology Ecology. 95 (9), 122 (2019).
  12. Aljohani, R., Samarasinghe, H., Ashu, T., Xu, J. Diversity and relationships among strains of culturable yeasts in agricultural soils in Cameroon. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
  13. Carini, P., et al. Relic DNA is abundant in soil and obscures estimates of soil microbial diversity. Nature Microbiology. 2 (3), 1-6 (2016).
  14. Xu, J. Fungal species concepts in the genomics era. Genome. 63 (9), 459-468 (2020).
  15. Brakhage, A. A., Langfelder, K. Menacing mold: The molecular biology of Aspergillus fumigatus. Annual Review of Microbiology. 56 (1), 433-455 (2002).
  16. Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R., Denning, D. Global and multi-national prevalence of fungal diseases-Estimate precision. Journal of Fungi. 3 (4), 57 (2017).
  17. Alcazar-Fuoli, L., Mellado, E., Alastruey-Izquierdo, A., Cuenca-Estrella, M., Rodriguez-Tudela, J. L. Aspergillus section Fumigati: Antifungal susceptibility patterns and sequence-based identification. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (4), 1244-1251 (2008).
  18. Rocchi, S., Godeau, C., Scherer, E., Reboux, G., Millon, L. One year later: The effect of changing azole-treated bulbs for organic tulips bulbs in hospital environment on the azole-resistant Aspergillus fumigatus rate. Medical Mycology. 59 (7), 741-743 (2021).
  19. Chowdhary, A., et al. Clonal expansion and emergence of environmental multiple-triazole-resistant Aspergillus fumigatus strains carrying the TR34/L98H mutations in the cyp51A gene in India. PLoS ONE. 7 (12), 52871 (2012).
  20. Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. Aspergillus fumigatus-what makes the species a ubiquitous human fungal pathogen. PLoS pathogens. 9 (12), 1003743 (2013).
  21. Sewell, T. R., et al. Nonrandom distribution of azole resistance across the global population of Aspergillus fumigatus. mBio. 10 (3), 00392 (2019).
  22. Ashu, E. E., Hagen, F., Chowdhary, A., Meis, J. F., Xu, J. Global population genetic analysis of Aspergillus fumigatus. mSphere. 2 (1), 00019 (2017).
  23. Heo, S. T., et al. Changes in in vitro ausceptibility patterns of Aspergillus to triazoles and correlation with aspergillosis outcome in a tertiary care cancer center, 1999-2015. Clinical Infectious Diseases. 65 (2), 216-225 (2017).
  24. de Valk, H. A., et al. Use of a novel panel of nine short tandem repeats for exact and high-resolution fingerprinting of Aspergillus fumigatus isolates. Journal of Clinical Microbiology. 43 (8), 4112-4120 (2005).
  25. Yurkov, A. M., Kemler, M., Begerow, D. Assessment of yeast diversity in soils under different management regimes. Fungal Ecology. 5 (1), 24-35 (2012).
  26. Calhelha, R. C., Andrade, J. V., Ferreira, I. C., Estevinho, L. M. Toxicity effects of fungicide residues on the wine-producing process. Food Microbiology. 23 (4), 393-398 (2006).
  27. Thomas, J. H., Neff, N. F., Botstein, D. Isolation and characterization of mutations in the Β-tubulin gene of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 111 (4), 715-734 (1985).
  28. Xu, J., Ramos, A. R., Vilgalys, R., Mitchell, T. G. Clonal and spontaneous origins of fluconazole resistance in Candida albicans. Journal of Clinical Microbiology. 38 (3), 1214 (2000).
  29. Paoletti, M., et al. Evidence for sexuality in the opportunistic fungal pathogen Aspergillus fumigatus. Current Biology. 15 (13), 1242-1248 (2005).
  30. De Valk, H. A., Meis, J. F. G. M., De Pauw, B. E., Donnelly, P. J., Klaassen, C. H. W. Comparison of two highly discriminatory molecular fingerprinting assays for analysis of multiple Aspergillus fumigatus isolates from patients with invasive aspergillosis. Journal of Clinical Microbiology. 45 (5), 1415-1419 (2007).
  31. Bates, D., Mächler, M., Bolker, B. M., Walker, S. C. Fitting linear mixed-effects models using lme4. Journal of Statistical Software. 67 (1), 1-48 (2015).
  32. Camacho, C., Madden, T., Tao, T., Agarwala, R., Morgulis, A. BLAST ® Command Line Applications User Manual. National Center for Biotechnology Information. , 1-95 (2022).
  33. Ashu, E. E., Korfanty, G. A., Xu, J. Evidence of unique genetic diversity in Aspergillus fumigatus isolates from Cameroon. Mycoses. 60 (11), 739-748 (2017).
  34. Korfanty, G. A., Dixon, M., Jia, H., Yoell, H., Xu, J. Genetic diversity and dispersal of Aspergillus fumigatus in Arctic soils. Genes. 13 (1), 19 (2021).
  35. Snelders, E., et al. Possible environmental origin of resistance of Aspergillus fumigatus to medical triazoles. Applied and Environmental Microbiology. 75 (12), 4053-4057 (2009).
  36. Wang, H. -C., et al. mechanisms and genetic relatedness of the human pathogenic fungus Aspergillus fumigatus exhibiting resistance to medical azoles in the environment of Taiwan. Environmental Microbiology. 20 (1), 270-280 (2018).

Tags

Biologi udgave 183 Gærdiversitet Aspergillus fumigatus ren kultur morfotyping DNA-stregkodning mikrosatellitgenotypning
Isolering af dyrkbare gær og skimmelsvampe fra jord for at undersøge svampepopulationsstruktur
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Samarasinghe, H., Korfanty, G., Xu,… More

Samarasinghe, H., Korfanty, G., Xu, J. Isolation of Culturable Yeasts and Molds from Soils to Investigate Fungal Population Structure. J. Vis. Exp. (183), e63396, doi:10.3791/63396 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter