هنا ، نصف الإنتاج على نطاق واسع من الكرويات اللحمية / الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون (ASC) باستخدام نظام سحب آلي لزرع تعليق الخلية ، وبالتالي ضمان تجانس حجم وشكل الكروية. يمكن استخدام هذه الكروية ASC ككتل بناء لنهج الطباعة الحيوية 3D.
الخلايا اللحمية / الجذعية المشتقة من الدهون (ASCs) هي مجموعة فرعية من الخلايا الموجودة في الجزء الوعائي اللحمي من الأنسجة الدهنية البشرية تحت الجلد المعترف بها كمصدر كلاسيكي للخلايا اللحمية / الجذعية الوسيطة. تم نشر العديد من الدراسات مع ASCs لنهج هندسة الأنسجة القائمة على السقالات ، والتي استكشفت بشكل رئيسي سلوك هذه الخلايا بعد بذرها على السقالات النشطة بيولوجيا. ومع ذلك ، تظهر مناهج خالية من السقالات لهندسة الأنسجة في المختبر وفي الجسم الحي ، وذلك أساسا باستخدام الكرويات ، للتغلب على قيود النهج القائمة على السقالات.
الكروية هي الأنسجة الدقيقة 3D التي شكلتها عملية التجميع الذاتي. يمكنهم محاكاة البنية والبيئة الدقيقة للأنسجة الأصلية بشكل أفضل ، ويرجع ذلك أساسا إلى تكبير تفاعلات المصفوفة من خلية إلى خلية ومن خلية إلى خارج الخلية. في الآونة الأخيرة ، يتم استكشاف الكرويات بشكل رئيسي كنماذج للأمراض ، ودراسات فحص الأدوية ، ولبنات البناء للطباعة الحيوية 3D. ومع ذلك ، بالنسبة لنهج الطباعة الحيوية 3D ، فإن العديد من الكرويات ، المتجانسة في الحجم والشكل ، ضرورية للتصنيع الحيوي لنماذج الأنسجة والأعضاء المعقدة. بالإضافة إلى ذلك ، عندما يتم إنتاج الكرويات تلقائيا ، هناك فرصة ضئيلة للتلوث الميكروبيولوجي ، مما يزيد من قابلية تكرار الطريقة.
يعتبر الإنتاج الواسع النطاق للكرويات الخطوة الإلزامية الأولى لتطوير خط التصنيع الحيوي ، والذي يستمر في عملية الطباعة الحيوية 3D وينتهي في النضج الكامل لبناء الأنسجة في المفاعلات الحيوية. ومع ذلك ، فإن عدد الدراسات التي استكشفت إنتاج ASC الكروي على نطاق واسع لا يزال نادرا ، إلى جانب عدد الدراسات التي استخدمت كرويات ASC ككتل بناء للطباعة الحيوية 3D. لذلك ، تهدف هذه المقالة إلى إظهار الإنتاج الواسع النطاق للكرويات ASC باستخدام تقنية هيدروجيل غير لاصقة micromolded تنشر كرويات ASC ككتل بناء لأساليب الطباعة الحيوية 3D.
تعتبر الكرويات نهجا خاليا من السقالات في هندسة الأنسجة. ASCs قادرة على تشكيل كرويات من خلال عملية التجميع الذاتي. تزيد البنية الدقيقة ثلاثية الأبعاد للكروية من الإمكانات التجديدية ل ASCs ، بما في ذلك قدرة التمايز إلى سلالات متعددة1،2،3. تعمل هذه المجموعة البحثية مع كرويات ASC لهندسة الغضاريف والأنسجة العظمية4،5،6. الأهم من ذلك ، تعتبر الكرويات لبنات بناء في التصنيع الحيوي للأنسجة والأعضاء ، ويرجع ذلك أساسا إلى قدرتها على الاندماج.
يعتمد استخدام الكرويات لتشكيل الأنسجة على ثلاث نقاط رئيسية: (1) تطوير طرق روبوتية موحدة وقابلة للتطوير لتصنيعها الحيوي7 ، (2) التنميط الظاهري المنهجي للكرويات النسيجية8 ، (3) تطوير طرق لتجميع الأنسجة ثلاثية الأبعاد9. يمكن تشكيل هذه الكرويات بأنواع مختلفة من الخلايا والحصول عليها من خلال طرق مختلفة ، بما في ذلك السقوط المعلق ، وإعادة التجميع ، والموائع الدقيقة ، والقوالب الدقيقة8،9،10. كل من هذه الطرق لها مزايا وعيوب تتعلق بتجانس حجم وشكل الكرويات ، واستعادة الكرويات بعد التكوين ، وعدد الكرويات المنتجة ، وأتمتة العمليات ، وكثافة العمالة ، والتكاليف11.
في طريقة micromold ، يتم توزيع الخلايا وإيداعها في الجزء السفلي من micromold بسبب الجاذبية. لا يسمح الهيدروجيل غير اللاصق للخلايا بالالتصاق بالقاع ، وتؤدي التفاعلات بين الخلايا إلى تكوين كروي واحد لكل ركود 8,12. تولد طريقة التصنيع الحيوي هذه كرويات ذات حجم متجانس ومضبوط ، ويمكن استخدامها آليا للإنتاج على نطاق واسع بطريقة فعالة من حيث الوقت بأقل جهد ممكن ، ولها عوامل جيدة من حيث الفعالية من حيث التكلفة في تصميم التصنيع الحيوي للأنسجة الكروية 7,8. يمكن تطبيق هذه الطريقة لتشكيل كرويات من أي سلالة خلوية لإعداد نوع جديد من الأنسجة بخصائص يمكن التنبؤ بها ومثالية ويمكن التحكم فيها8.
يعرف التصنيع الحيوي بأنه “التوليد الآلي للمنتجات الوظيفية بيولوجيا مع التنظيم الهيكلي …”13. لذلك ، يعتبر الإنتاج الآلي للكرويات الخطوة الإلزامية الأولى لتطوير خط التصنيع الحيوي ، والذي يستمر في عملية الطباعة الحيوية 3D وينتهي في النضج الكامل للأنسجة المطبوعة بيولوجيا عن طريق الانصهار الكروي. في هذه الدراسة ، لتحسين قابلية التوسع في التصنيع الحيوي الكروي ASC ، نستخدم نظام سحب آلي لزرع تعليق الخلية ، وبالتالي ضمان تجانس حجم وشكل كروي. تظهر هذه الورقة أنه كان من الممكن إنتاج عدد كبير (الآلاف) من الكرويات اللازمة لنهج الطباعة الحيوية 3D للتصنيع الحيوي لنماذج الأنسجة الأكثر تعقيدا.
تعرض هذه الورقة الجيل الواسع النطاق من الكرويات ASC باستخدام نظام ماصة آلي. الخطوة الحاسمة للبروتوكول هي إعداد البرنامج بدقة لضمان الحجم الصحيح لتعليق الخلايا وسرعتها ومسافة السحب عليها. تم تحديد المعلمات الموصوفة في البروتوكول بعد عدد من التجارب لتحسين توزيع تعليق خلية ASC في آبار ألواح 12 …
The authors have nothing to disclose.
نشكر المعهد الوطني للمترولوجيا والجودة والتكنولوجيا (INMETRO ، RJ ، البرازيل) على استخدام مرافقه. تم دعم هذه الدراسة جزئيا من قبل مؤسسة كارلوس شاغاس فيلهو لدعم البحوث في ولاية ريو دي جانيرو (Faperj) (قانون التمويل: E26/202.682/2018 و E-26/010.001771/2019 ، والمجلس الوطني للتنمية العلمية والتكنولوجية (CNPq) (رمز التمويل: 307460/2019-3) ، ومكتب البحوث البحرية (ONR) (رمز التمويل: N62909-21-1-2091). تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل المركز الوطني للعلوم والتكنولوجيا حول الطب التجديدي – INCT Regenera (http://www.inctregenera.org.br/).
12-well plastic plate | Corning | 3512 | |
50 mL centrifuge tube | Corning | CLS430828 | |
EpMotion 5070 | Eppendorf | 5070000282 | |
epT.I.P.S. Motion | Eppendorf | 30015231 | |
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Invitrogen | 15576028 | |
fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10082147 | |
Low Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM LOW) | Gibco | 31600034 | |
MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids – 16 x 16 array | Sigma | Z764000 | |
MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids – 9 x 9 array | Sigma | Z764019 | |
phosphate saline buffer (PBS) | Sigma | 806552 | |
sodium chloride (NaCl) | Sigma | S8776 | |
tissue culture flask | Corning | 430720U | |
trypan | Lonza | 17-942E | |
trypsin | Gibco | 27250018 | |
ultrapure agarose | Invitrogen | 16500100 |