Großflächige, automatisierte Produktion von aus Fett gewonnenen Stammzellsphäroiden für den 3D-Bioprinting
Summary
Hier beschreiben wir die großtechnische Produktion von aus Fett gewonnenen Stroma-/Stammzell-Sphäroiden (ASC) unter Verwendung eines automatisierten Pipettiersystems zur Aussaat der Zellsuspension, wodurch die Homogenität der Sphäroidgröße und -form sichergestellt wird. Diese ASC-Sphäroide können als Bausteine für 3D-Bioprinting-Ansätze verwendet werden.
Abstract
Adipose-abgeleitete Stromal-/Stammzellen (ASCs) sind eine Subpopulation von Zellen, die in der stromalen vaskulären Fraktion des menschlichen subkutanen Fettgewebes vorkommen und als klassische Quelle mesenchymaler Stroma-/Stammzellen anerkannt sind. Viele Studien wurden mit ASCs für gerüstbasierte Tissue-Engineering-Ansätze veröffentlicht, die hauptsächlich das Verhalten dieser Zellen nach ihrer Aussaat auf bioaktiven Gerüsten untersuchten. Es entstehen jedoch gerüstfreie Ansätze, um Gewebe in vitro und in vivo zu entwickeln, hauptsächlich durch die Verwendung von Sphäroiden, um die Einschränkungen von gerüstbasierten Ansätzen zu überwinden.
Sphäroide sind 3D-Mikrogewebe, die durch den Selbstorganisationsprozess gebildet werden. Sie können die Architektur und Mikroumgebung von nativem Gewebe besser nachahmen, hauptsächlich aufgrund der Vergrößerung von Zell-zu-Zell- und Zell-zu-extrazellulärer Matrix-Interaktionen. In jüngster Zeit werden Sphäroide hauptsächlich als Krankheitsmodelle, Arzneimittelscreening-Studien und Bausteine für den 3D-Bioprinting untersucht. Für 3D-Bioprinting-Ansätze sind jedoch zahlreiche Sphäroide in Größe und Form erforderlich, um komplexe Gewebe- und Organmodelle bioherzustellen. Darüber hinaus besteht bei der automatischen Herstellung von Sphäroiden die Wahrscheinlichkeit einer mikrobiologischen Kontamination gering, was die Reproduzierbarkeit der Methode erhöht.
Die großtechnische Produktion von Sphäroiden gilt als erster obligatorischer Schritt für die Entwicklung einer Biofabrikationslinie, die im 3D-Bioprinting-Prozess fortgesetzt wird und in der vollständigen Reifung des Gewebekonstrukts in Bioreaktoren endet. Die Anzahl der Studien, die die groß angelegte ASC-Sphäroidproduktion untersuchten, ist jedoch immer noch gering, zusammen mit der Anzahl der Studien, die ASC-Sphäroide als Bausteine für den 3D-Bioprinting verwendeten. Daher zielt dieser Artikel darauf ab, die großtechnische Produktion von ASC-Sphäroiden unter Verwendung einer nicht klebenden mikrogeformten Hydrogeltechnik zu zeigen, die ASC-Sphäroide als Bausteine für 3D-Bioprinting-Ansätze ausbreitet.
Introduction
Sphäroide gelten als gerüstfreier Ansatz im Tissue Engineering. ASCs sind in der Lage, Sphäroide durch den Selbstorganisationsprozess zu bilden. Die 3D-Mikroarchitektur des Sphäroides erhöht das Regenerationspotenzial von ASCs, einschließlich der Differenzierungskapazität in mehrere Linien 1,2,3. Diese Forschungsgruppe hat mit ASC-Sphäroiden für Knorpel- und Knochengewebe-Engineering gearbeitet 4,5,6. Noch wichtiger ist, dass Sphäroide als Bausteine in der Biofabrikation von Geweben und Organen gelten, hauptsächlich aufgrund ihrer Fusionskapazität.
Der Einsatz von Sphäroiden zur Gewebebildung hängt von drei Hauptpunkten ab: (1) der Entwicklung standardisierter und skalierbarer robotischer Methoden für deren Biofabrikation7, (2) der systematischen Phänotypisierung von Gewebesphäroiden8, (3) der Entwicklung von Methoden zur Montage von 3D-Geweben9. Diese Sphäroide können mit verschiedenen Zelltypen gebildet und durch verschiedene Methoden erhalten werden, einschließlich hängender Tropfen, Reaggregation, Mikrofluidik und Mikroformen 8,9,10. Jede dieser Methoden hat Vor- und Nachteile in Bezug auf die Homogenität der Größe und Form der Sphäroide, die Rückgewinnung der Sphäroide nach der Bildung, die Anzahl der produzierten Sphäroide, die Prozessautomatisierung, die Arbeitsintensität und die Kosten11.
Bei der Mikroform-Methode werden die Zellen aufgrund der Schwerkraft am Boden der Mikroform dosiert und abgeschieden. Das nicht adhäsive Hydrogel erlaubt es den Zellen nicht, am Boden zu haften, und Zell-zu-Zell-Wechselwirkungen führen zur Bildung eines einzelnen Sphäroids pro Rezession 8,12. Diese Biofabrikationsmethode erzeugt Sphäroide homogener und kontrollierter Größe, kann mit minimalem Aufwand zeiteffizient für die Großserienproduktion robotisiert werden und hat gute kosteneffizienzkritische Faktoren bei der Konstruktion einer Biofabrikation von Gewebesphäroid 7,8. Diese Methode kann angewendet werden, um Sphäroide jeder Zelllinie zu bilden, um einen neuen Gewebetyp mit vorhersagbaren, optimalen und kontrollierbaren Eigenschaftenherzustellen 8.
Biofabrikation ist definiert als “die automatisierte Erzeugung biologisch funktioneller Produkte mit struktureller Organisation …“13. Daher gilt die automatisierte Herstellung von Sphäroiden als erster obligatorischer Schritt für die Entwicklung einer Biofabrikationslinie, die im 3D-Bioprinting-Prozess fortgesetzt wird und in der vollständigen Reifung des biogedruckten Gewebes durch Sphäroidfusion endet. Um die Skalierbarkeit der ASC-Sphäroid-Biofabrikation zu verbessern, verwenden wir in dieser Studie ein automatisiertes Pipettiersystem, um die Zellsuspension zu säen, wodurch die Homogenität der Sphäroidgröße und -form sichergestellt wird. Dieses Papier zeigt, dass es möglich war, eine große Anzahl (Tausende) von Sphäroiden herzustellen, die für 3D-Bioprinting-Ansätze benötigt werden, um komplexere Gewebemodelle bioherzustellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieser Beitrag stellt die großtechnische Erzeugung von ASC-Sphäroiden mit einem automatisierten Pipettensystem vor. Der kritische Schritt des Protokolls besteht darin, die Software genau einzurichten, um das richtige Volumen der Zellsuspension, die Geschwindigkeit und den richtigen Abstand für das Pipettieren sicherzustellen. Die im Protokoll beschriebenen Parameter wurden nach einer Reihe von Versuchen bestimmt, um die Dosierung der ASC-Zellsuspension in die Vertiefungen von 12-Well-Platten mit mikrogeformten, nicht …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken dem National Institute of Metrology, Quality and Technology (INMETRO, RJ, Brasilien) für die Nutzung seiner Einrichtungen. Diese Studie wurde teilweise von der Carlos Chagas Filho Foundation for Research Support des Bundesstaates Rio de Janeiro (Faperj) (Finanzcode: E26/202.682/2018 und E-26/010.001771/2019), dem Nationalen Rat für wissenschaftliche und technologische Entwicklung (CNPq) (Finanzcode: 307460/2019-3) und dem Office of Naval Research (ONR) (Finanzcode: N62909-21-1-2091) unterstützt. Diese Arbeit wurde teilweise vom National Center of Science and Technology on Regenerative Medicine-INCT Regenera (http://www.inctregenera.org.br/) unterstützt.
Materials
| 12-well plastic plate | Corning | 3512 | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | CLS430828 | |
| EpMotion 5070 | Eppendorf | 5070000282 | |
| epT.I.P.S. Motion | Eppendorf | 30015231 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Invitrogen | 15576028 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10082147 | |
| Low Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM LOW) | Gibco | 31600034 | |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids – 16 x 16 array | Sigma | Z764000 | |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids – 9 x 9 array | Sigma | Z764019 | |
| phosphate saline buffer (PBS) | Sigma | 806552 | |
| sodium chloride (NaCl) | Sigma | S8776 | |
| tissue culture flask | Corning | 430720U | |
| trypan | Lonza | 17-942E | |
| trypsin | Gibco | 27250018 | |
| ultrapure agarose | Invitrogen | 16500100 |
Referências
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