Production automatisée à grande échelle de sphéroïdes de cellules souches dérivées de cellules adipeuses pour la bioimpression 3D
Summary
Ici, nous décrivons la production à grande échelle de sphéroïdes stromaux / cellules souches (ASC) dérivés des adipeux à l’aide d’un système de pipetage automatisé pour ensemencer la suspension cellulaire, assurant ainsi l’homogénéité de la taille et de la forme des sphéroïdes. Ces sphéroïdes ASC peuvent être utilisés comme blocs de construction pour les approches de bio-impression 3D.
Abstract
Les cellules stromales/souches (ASC) dérivées des adiposes sont une sous-population de cellules présentes dans la fraction vasculaire stromale du tissu adipeux sous-cutané humain reconnu comme une source classique de cellules stromales/souches mésenchymateuses. De nombreuses études ont été publiées avec des ASC pour des approches d’ingénierie tissulaire basées sur des échafaudages, qui ont principalement exploré le comportement de ces cellules après leur ensemencement sur des échafaudages bioactifs. Cependant, des approches sans échafaudage émergent pour concevoir des tissus in vitro et in vivo, principalement en utilisant des sphéroïdes, afin de surmonter les limites des approches basées sur des échafaudages.
Les sphéroïdes sont des microtissus 3D formés par le processus d’auto-assemblage. Ils peuvent mieux imiter l’architecture et le microenvironnement des tissus natifs, principalement en raison du grossissement des interactions de cellule à cellule et de matrice de cellule à extracellulaire. Récemment, les sphéroïdes sont principalement explorés en tant que modèles de maladies, études de dépistage de médicaments et éléments constitutifs de la bioimpression 3D. Cependant, pour les approches de bio-impression 3D, de nombreux sphéroïdes, de taille et de forme homogènes, sont nécessaires pour biofabriquer des modèles complexes de tissus et d’organes. De plus, lorsque les sphéroïdes sont produits automatiquement, il y a peu de risques de contamination microbiologique, ce qui augmente la reproductibilité de la méthode.
La production à grande échelle de sphéroïdes est considérée comme la première étape obligatoire pour le développement d’une ligne de biofabrication, qui se poursuit dans le processus de bioimpression 3D et se termine par la maturation complète de la construction tissulaire dans les bioréacteurs. Cependant, le nombre d’études qui ont exploré la production de sphéroïdes ASC à grande échelle est encore rare, ainsi que le nombre d’études qui ont utilisé des sphéroïdes ASC comme éléments constitutifs de la bioimpression 3D. Par conséquent, cet article vise à montrer la production à grande échelle de sphéroïdes ASC à l’aide d’une technique d’hydrogel micromoulé non adhésif répandant des sphéroïdes ASC comme éléments constitutifs pour les approches de bioimpression 3D.
Introduction
Les sphéroïdes sont considérés comme une approche sans échafaudage dans l’ingénierie tissulaire. Les ASC sont capables de former des sphéroïdes par le processus d’auto-assemblage. La microarchitecture 3D du sphéroïde augmente le potentiel de régénération des ASC, y compris la capacité de différenciation en plusieurs lignées 1,2,3. Ce groupe de recherche a travaillé avec des sphéroïdes ASC pour l’ingénierie du cartilage et des tissus osseux 4,5,6. Plus important encore, les sphéroïdes sont considérés comme des éléments constitutifs de la biofabrication des tissus et des organes, principalement en raison de leur capacité de fusion.
L’utilisation des sphéroïdes pour la formation des tissus dépend de trois points principaux: (1) le développement de méthodes robotiques standardisées et évolutives pour leur biofabrication7, (2) le phénotypage systématique des sphéroïdes tissulaires8, (3) le développement de méthodes pour l’assemblage de tissus 3D9. Ces sphéroïdes peuvent être formés avec différents types de cellules et obtenus par diverses méthodes, y compris la goutte suspendue, la réagrégation, la microfluidique et les micromoules 8,9,10. Chacune de ces méthodes présente des avantages et des inconvénients liés à l’homogénéité de la taille et de la forme des sphéroïdes, à la récupération des sphéroïdes après leur formation, au nombre de sphéroïdes produits, à l’automatisation des processus, à l’intensité de la main-d’œuvre et aux coûts11.
Dans la méthode du micromoulage, les cellules sont distribuées et déposées au fond du micromoulage en raison de la gravité. L’hydrogel non adhésif ne permet pas aux cellules d’adhérer au fond, et les interactions cellule-à-cellule conduisent à la formation d’un seul sphéroïde par récession 8,12. Cette méthode de biofabrication génère des sphéroïdes de taille homogène et contrôlée, peut être robotisée pour une production à grande échelle de manière rapide avec un minimum d’effort, et présente de bons facteurs critiques de rentabilité dans la conception d’une biofabrication de sphéroïde tissulaire 7,8. Cette méthode peut être appliquée pour former des sphéroïdes de n’importe quelle lignée cellulaire afin de préparer un nouveau type de tissu avec des caractéristiques prévisibles, optimales et contrôlables8.
La biofabrication est définie comme « la génération automatisée de produits biologiquement fonctionnels avec une organisation structurelle… »13. Par conséquent, la production automatisée de sphéroïdes est considérée comme la première étape obligatoire pour le développement d’une ligne de biofabrication, qui se poursuit dans le processus de bio-impression 3D et se termine par la maturation complète du tissu bioimprimé par fusion sphéroïde. Dans cette étude, pour améliorer l’évolutivité de la biofabrication des sphéroïdes ASC, nous utilisons un système de pipetage automatisé pour ensemencer la suspension cellulaire, assurant ainsi l’homogénéité de la taille et de la forme des sphéroïdes. Cet article montre qu’il était possible de produire un grand nombre (des milliers) de sphéroïdes nécessaires aux approches de bio-impression 3D pour biofabriquer des modèles tissulaires plus complexes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet article présente la génération à grande échelle de sphéroïdes ASC à l’aide d’un système de pipette automatisé. L’étape critique du protocole consiste à configurer avec précision le logiciel pour assurer le volume correct de suspension de cellule, la vitesse et la distance pour le pipetage. Les paramètres décrits dans le protocole ont été déterminés après un certain nombre d’essais afin d’optimiser la distribution de la suspension de cellules ASC dans les puits de plaques de 12 puits cont…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions l’Institut national de métrologie, de qualité et de technologie (INMETRO, RJ, Brésil) pour l’utilisation de ses installations. Cette étude a été partiellement soutenue par la Fondation Carlos Chagas Filho pour le soutien à la recherche de l’État de Rio de Janeiro (Faperj) (code financier: E26/202.682/2018 et E-26/010.001771/2019), le Conseil national pour le développement scientifique et technologique (CNPq) (code financier: 307460/2019-3) et l’Office de la recherche navale (ONR) (code financier: N62909-21-1-2091). Ce travail a été partiellement soutenu par le National Center of Science and Technology on Regenerative Medicine-INCT Regenera (http://www.inctregenera.org.br/).
Materials
| 12-well plastic plate | Corning | 3512 | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | CLS430828 | |
| EpMotion 5070 | Eppendorf | 5070000282 | |
| epT.I.P.S. Motion | Eppendorf | 30015231 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Invitrogen | 15576028 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10082147 | |
| Low Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM LOW) | Gibco | 31600034 | |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids – 16 x 16 array | Sigma | Z764000 | |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids – 9 x 9 array | Sigma | Z764019 | |
| phosphate saline buffer (PBS) | Sigma | 806552 | |
| sodium chloride (NaCl) | Sigma | S8776 | |
| tissue culture flask | Corning | 430720U | |
| trypan | Lonza | 17-942E | |
| trypsin | Gibco | 27250018 | |
| ultrapure agarose | Invitrogen | 16500100 |
Referências
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