ترسيب البروتين العضوي القائم على المذيبات لتنقية البروتيوم القوية قبل قياس الطيف الكتلي
Summary
يصف هذا البروتوكول هطول البروتين القائم على المذيبات في ظل ظروف خاضعة للرقابة من أجل الاسترداد والتنقية القويين والسريعين لعينات البروتيوم قبل قياس الطيف الكتلي.
Abstract
في حين أن التطورات المتعددة في أدوات قياس الطيف الكتلي (MS) قد حسنت التحليل النوعي والكمي للبروتينات، فإن النهج الأمامية الأكثر موثوقية لعزل البروتينات وإثرائها ومعالجتها قبل التصلب المتعدد أمر بالغ الأهمية لتوصيف البروتيوم الناجح. إن استرداد البروتين المنخفض وغير المتناسق والشوائب المتبقية مثل المواد الخافضة للتوتر السطحي تضر بتحليل مرض التصلب العصبي المتعدد. غالبا ما يعتبر هطول الأمطار البروتينية غير موثوق به ، ويستغرق وقتا طويلا ، ويمثل تحديا تقنيا للأداء مقارنة باستراتيجيات إعداد العينات الأخرى. يتم التغلب على هذه المخاوف من خلال استخدام بروتوكولات هطول الأمطار البروتينية المثلى. بالنسبة لهطول الأمطار الأسيتون ، فإن الجمع بين أملاح محددة ، والتحكم في درجة الحرارة ، وتكوين المذيبات ، ووقت هطول الأمطار أمر بالغ الأهمية ، في حين أن كفاءة ترسيب الكلوروفورم / الميثانول / الماء تعتمد على السحب السليم والتلاعب بالقارورة. بدلا من ذلك ، يتم تبسيط بروتوكولات هطول الأمطار هذه وشبه آلية داخل خرطوشة دوران يمكن التخلص منها. يتم توضيح النتائج المتوقعة من ترسيب البروتين القائم على المذيبات في الشكل التقليدي واستخدام خرطوشة ترشيح واستخراج يمكن التخلص منها على مرحلتين. ويشمل ذلك التوصيف التفصيلي للمخاليط البروتينية عن طريق تحليل LC-MS/MS من أسفل إلى أعلى. كما يظهر الأداء المتفوق لسير العمل القائم على SDS بالنسبة للبروتين غير الملوث.
Introduction
أصبح تحليل البروتيوم بواسطة مطياف الكتلة صارما بشكل متزايد ، نظرا للحساسية المحسنة والدقة وسرعة المسح الضوئي وتعدد استخدامات أجهزة MS الحديثة. تساهم تطورات التصلب المتعدد في زيادة كفاءة تحديد البروتين وزيادة دقة الكمية1،2،3،4،5. مع تحسين أجهزة MS ، يطلب الباحثون استراتيجية متسقة لإعداد العينات الأمامية قادرة على الاسترداد الكمي للبروتينات عالية النقاء في أقل وقت ممكن عبر جميع مراحل سير العمل 6,7,8,9,10,11 . لتعكس بدقة حالة البروتيوم للنظام البيولوجي ، يجب عزل البروتينات من مصفوفة العينة الأصلية بطريقة فعالة وغير متحيزة. تحقيقا لهذه الغاية ، بما في ذلك الفاعل بالسطح ، مثل كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) ، يضمن استخراج البروتين الفعال والذوبان12. ومع ذلك ، فإن SDS تتداخل بشدة مع تأين الرش الكهربائي ، مما يتسبب في قمع إشارة MS الشديد إذا لم يتم القضاء عليها بشكل صحيح13.
تتوفر استراتيجيات استنفاد SDS مختلفة لتحليل البروتيوم اللاحق ، مثل الاحتفاظ بالبروتينات فوق مرشح قطع الوزن الجزيئي الموجود داخل خراطيش الدوران التي يمكن التخلص منها 14،15،16. يفضل استخدام طريقة تحضير العينات بمساعدة المرشح (FASP) لأنها تستنفد SDS بشكل فعال أقل من 10 جزء في المليون ، مما يسهل MS الأمثل. ومع ذلك ، فإن استعادة البروتين باستخدام FASP متغيرة ، مما دفع إلى استكشاف تقنيات أخرى. تطورت الأساليب الكروماتوغرافية التي تلتقط البروتين (أو الفاعل بالسطح) بشكل انتقائي إلى خراطيش مريحة مختلفة أو تنسيقات قائمة على الخرز17،18،19،20،21. بالنظر إلى هذه الاستراتيجيات البسيطة والمتسقة (من الناحية المثالية) لتنقية البروتين ، غالبا ما يتم تجاهل النهج الكلاسيكي لهطول الأمطار بالبروتين باستخدام المذيبات العضوية كنهج واعد لعزل البروتين. في حين تبين أن هطول الأمطار المذيبات يستنفد SDS إلى ما دون المستويات الحرجة بنجاح ، فإن استعادة البروتين كانت مصدر قلق طويل الأمد لهذا النهج. لاحظت مجموعات متعددة تحيزا في استعادة البروتين ، مع غلة هطول الأمطار المنخفضة بشكل غير مقبول كدالة لتركيز البروتين والوزن الجزيئي وكره الماء22,23. نظرا لتنوع بروتوكولات هطول الأمطار المبلغ عنها في الأدبيات ، تم تطوير ظروف هطول الأمطار الموحدة. في عام 2013 ، أبلغ Crowell et al. لأول مرة عن اعتماد القوة الأيونية على كفاءة هطول الأمطار للبروتينات في 80٪ من الأسيتون24. بالنسبة لجميع البروتينات التي تم فحصها ، تبين أن إضافة ما يصل إلى 30 ملليمتر كلوريد الصوديوم ضرورية لتحقيق أقصى قدر من الغلة (ما يصل إلى 100٪ من الانتعاش). في الآونة الأخيرة ، أظهر نيكرسون وآخرون أن الجمع بين قوة أيونية أعلى (تصل إلى 100 ملليمتر) مع درجة حرارة مرتفعة (20 درجة مئوية) أثناء هطول الأمطار الأسيتون أعطى استردادا كميا قريبا في 2-5 دقيقة25. لوحظ انخفاض طفيف في استعادة البروتينات منخفضة الوزن الجزيئي (LMW). ولذلك، أظهر تقرير لاحق أعده باغالابادي وآخرون الاسترداد الناجح لبروتينات الكائنات الحية المحورة وببتيدات (≤5 كيلوداد) عن طريق الجمع بين أملاح محددة، ولا سيما كبريتات الزنك، مع مستوى أعلى من المذيبات العضوية (97٪ من الأسيتون)26.
في حين أن تحسين بروتوكول هطول الأمطار يضفي استراتيجية أكثر موثوقية لتنقية البروتين للبروتينات القائمة على MS ، فإن نجاح هطول الأمطار التقليدي يعتمد بشكل كبير على تقنية المستخدم. الهدف الأساسي من هذا العمل هو تقديم استراتيجية قوية لهطول الأمطار تسهل عزل حبيبات البروتين عن المادة الفائقة الملوثة. تم تطوير خرطوشة ترشيح يمكن التخلص منها للقضاء على السحب عن طريق عزل البروتين المجمع فوق مرشح غشاء PTFE المسامي27. تتم إزالة مكونات التداخل MS في supernatant بشكل فعال في خطوة طرد مركزي قصيرة ومنخفضة السرعة. توفر خرطوشة المرشح التي يمكن التخلص منها أيضا خرطوشة SPE قابلة للتبديل، مما يسهل تنظيف العينات لاحقا بعد إعادة الذوبان وهضم البروتين الاختياري، قبل قياس الطيف الكتلي.
يتم عرض سلسلة من سير عمل هطول الأمطار البروتيني الموصى به هنا ، بما في ذلك بروتوكولات الأسيتون والكلوروفورم / الميثانول / الماءالمعدلة 28 ، في شكل تقليدي (قائم على القارورة) وشبه آلي في خرطوشة ترشيح واستخراج ثنائية الحالة يمكن التخلص منها. يتم تسليط الضوء على عمليات استرداد البروتين الناتجة وكفاءة استنفاد SDS ، إلى جانب تغطية LC-MS / MS البروتينية من أسفل إلى أعلى ، لإظهار النتيجة المتوقعة من كل بروتوكول. وتناقش الفوائد والعيوب العملية المرتبطة بكل نهج.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتم تحقيق التوصيف الأمثل للتصلب المتعدد عند استنفاد SDS المتبقي أقل من 10 أجزاء في المليون. في حين أن النهج البديلة ، مثل FASP والهضم على الخرز ، توفر استنفاد SDS الكمي مع الاسترداد المتغير31،32،33 ، فإن الهدف الأساسي من هطول الأمطار هو تحقيق أقصى قدر من…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من قبل مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا. يشكر المؤلفون شركة Bioinformatics Solutions Inc. (واترلو ، كندا) و SPARC BioCentre (التحليل الجزيئي) في مستشفى الأطفال المرضى (تورونتو ، كندا) لمساهماتهم في الحصول على بيانات MS.
Materials
| Acetone | Fisher Scientific | AC177170010 | ≤0.002 % aldehyde |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-4 | HPLC grade |
| Ammonium Bicarbonate | Millipore Sigma | A6141-1KG | solid |
| Beta mercaptoethanol | Millipore Sigma | M3148-25ML | Molecular biology grade |
| Bromophenol blue | Millipore Sigma | B8026-5G | Bromophenol blue sodium salt |
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-400 | Chloroform |
| Formic Acid | Honeywell | 56302 | Eluent additive for LC-MS |
| Fusion Lumos Mass Spectrometer | ThermoFisher Scientific | for analysis of standard protein mixture | |
| Glycerol | Millipore Sigma | 356352-1L-M | For molecular biology, > 99% |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A4641 | HPLC grade |
| Methanol | Fisher Scientific | A452SK-4 | HPLC grade |
| Microcentrifuge | Fisher Scientific | 75-400-102 | up to 21,000 xg |
| Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Fisher Scientific | 05-408-130 | tapered bottom |
| Microcentrifuge Tube (2 mL) | Fisher Scientific | 02-681-321 | rounded bottom |
| Micropipette Tips (0.1-10 μL) | Fisher Scientific | 21-197-28 | Universal pipet tip, non-sterile |
| Micropipette Tips (1-200 μL) | Fisher Scientific | 07-200-302 | Universal pipet tip, non-sterile |
| Micropipette Tips (200-1000 μL) | Fisher Scientific | 07-200-303 | Universal pipet tip, non-sterile |
| Micropipettes | Fisher Scientific | 13-710-903 | Micropipet Trio pack |
| Pepsin | Millipore Sigma | P0525000 | Lyophilized powder, >3200 units/ mg |
| ProTrap XG | Proteoform Scientific | PXG-0002 | 50 complete units per box |
| Sodium Chloride | Millipore Sigma | S9888-1KG | ACS reagent, >99 % |
| Sodium Dodecyl Sulfate | ThermoFisher Scientific | 28312 | powdered solid |
| timsTOF Pro Mass Spectrometer | Bruker | for analysis of liver proteome extract | |
| Trifluoroacetic Acid | ThermoFisher Scientific | L06374.AP | 99% |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-500 | Molecular biology grade |
| Trypsin | Millipore Sigma | 9002-07-7 | From bovine pancreas, TPCK-treated |
| Urea | Bio-Rad | 1610731 | solid |
| Water (deionized) | Sartorius Arium Mini Water Purification System | 76307-662 | Type 1 ultrapure (18.2 MΩ cm) |
| Zinc Sulfate | Millipore Sigma | 307491-100G | solid |
Referências
- Kilpatrick, L. E., Kilpatrick, E. L. Optimizing high-resolution mass spectrometry for the identification of low-abundance post-translational modifications of intact proteins. Journal of Proteome Research. 16 (9), 3255-3265 (2017).
- Scheffler, K., Viner, R., Damoc, E. High resolution top-down experimental strategies on the Orbitrap platform. Journal of Proteomics. 175, 42-55 (2018).
- Quaranta, A., et al. N -Glycosylation profiling of intact target proteins by high-resolution mass spectrometry (MS) and glycan analysis using ion mobility-MS/MS. Analyst. 145 (5), 1737-1748 (2020).
- Van Der Burgt, Y. E. M., et al. Structural analysis of monoclonal antibodies by ultrahigh resolution MALDI in-source decay FT-ICR mass spectrometry. Analytical Chemistry. 91 (3), 2079-2085 (2019).
- Anderson, L. C., et al. Identification and characterization of human proteoforms by top-down LC-21 Tesla FT-ICR mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 16 (2), 1087-1096 (2017).
- Nickerson, J. L., et al. Recent advances in top-down proteome sample processing ahead of MS analysis. Mass Spectrometry Reviews. , (2021).
- Kelly, R. T. Single-cell Proteomics: Progress and Prospects. Molecular and Cellular Proteomics. 19 (11), 1739-1748 (2020).
- Alexovič, M., Sabo, J., Longuespée, R. Microproteomic sample preparation. Proteomics. 21 (9), 2000318 (2021).
- Shishkova, E., Coon, J. J. Rapid preparation of human blood plasma for bottom-up proteomics analysis. STAR Protocols. 2 (4), 100856 (2021).
- Duong, V. A., Park, J. M., Lee, H. Review of three-dimensional liquid chromatography platforms for bottom-up proteomics. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1524 (2020).
- Gan, G., et al. SCASP: A simple and robust SDS-aided sample preparation method for proteomic research. Molecular and Cellular Proteomics. 20, 100051 (2021).
- Kachuk, C., Doucette, A. A. The benefits (and misfortunes) of SDS in top-down proteomics. Journal of Proteomics. 175, 75-86 (2018).
- Rundlett, K. L., Armstrong, D. W. Mechanism of signal suppression by anionic surfactants in capillary electrophoresis-electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Chemistry. 68 (19), 3493-3497 (1996).
- Wis, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).
- Ni, M., et al. Modified filter-aided sample preparation (FASP) method increases peptide and protein identifications for shotgun proteomics. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 31 (2), 171-178 (2017).
- Zhao, Q., et al. imFASP: An integrated approach combining in-situ filter-aided sample pretreatment with microwave-assisted protein digestion for fast and efficient proteome sample preparation. Analytica Chimica Acta. 912, 58-64 (2016).
- Kanshin, E., et al. Ultrasensitive proteome analysis using paramagnetic bead technology. Molecular Systems Biology. 10 (10), 757 (2014).
- Hughes, C. S., et al. Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments. Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).
- Dagley, L. F., Infusini, G., Larsen, R. H., Sandow, J. J., Webb, A. I. Universal solid-phase protein preparation (USP3) for bottom-up and top-down proteomics. Journal of Proteome Research. 18 (7), 2915-2924 (2019).
- Hengel, S. M., et al. Evaluation of SDS depletion using an affinity spin column and IMS-MS detection. Proteomics. 12 (21), 3138-3142 (2012).
- Zougman, A., Selby, P. J., Banks, R. E. Suspension trapping (STrap) sample preparation method for bottom-up proteomics analysis. PROTEOMICS. 14 (9), 1006-1010 (2014).
- Thongboonkerd, V., McLeish, K. R., Arthur, J. M., Klein, J. B. Proteomic analysis of normal human urinary proteins isolated by acetone precipitation or ultracentrifugation. Kidney International. 62 (4), 1461-1469 (2002).
- Klont, F., et al. Assessment of sample preparation bias in mass spectrometry-based proteomics. Analytical Chemistry. 90 (8), 5405-5413 (2018).
- Crowell, A. M. J., Wall, M. J., Doucette, A. A. Maximizing recovery of water-soluble proteins through acetone precipitation. Analytica Chimica Acta. 796, 48-54 (2013).
- Nickerson, J. L., Doucette, A. A. Rapid and quantitative protein precipitation for proteome analysis by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 19 (5), 2035-2042 (2020).
- Baghalabadi, V., Doucette, A. A. Mass spectrometry profiling of low molecular weight proteins and peptides isolated by acetone precipitation. Analytica Chimica Acta. 1138, 38-48 (2020).
- Crowell, A. M. J., MacLellan, D. L., Doucette, A. A. A two-stage spin cartridge for integrated protein precipitation, digestion and SDS removal in a comparative bottom-up proteomics workflow. Journal of Proteomics. 118, 140-150 (2015).
- Wessel, D., Flügge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Analytical Biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).
- Arand, M., Friedberg, T., Oesch, F. Colorimetric quantitation of trace amounts of sodium lauryl sulfate in the presence of nucleic acids and proteins. Analytical Biochemistry. 207 (1), 73-75 (1992).
- Tukey, J. W. Exploratory data analysis. Biometrics. 33, 768 (1977).
- Ludwig, K. R., Schroll, M. M., Hummon, A. B. Comparison of in-solution, FASP, and S-Trap based digestion methods for bottom-up proteomic studies. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2480-2490 (2018).
- Sielaff, M., et al. Evaluation of FASP, SP3, and iST protocols for proteomic sample preparation in the low microgram range. Journal of Proteome Research. 16 (11), 4060-4072 (2017).
- Supasri, K. M., et al. Evaluation of filter, paramagnetic, and STAGETips aided workflows for proteome profiling of symbiodiniaceae. Processes. 9 (6), 983 (2021).
- Botelho, D., et al. Top-down and bottom-up proteomics of SDS-containing solutions following mass-based separation. Journal of Proteome Research. 9 (6), 2863-2870 (2010).
- Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis. Electrophoresis. 31 (21), 3573-3579 (2010).
- Antonioli, P., Bachi, A., Fasoli, E., Righetti, P. G. Efficient removal of DNA from proteomic samples prior to two-dimensional map analysis. Journal of Chromatography A. 1216 (17), 3606-3612 (2009).
- Bryzgunova, O., et al. A reliable method to concentrate circulating DNA. Analytical Biochemistry. 408 (2), 354-356 (2011).
- Asakura, T., Adachi, K., Schwartz, E. Stabilizing effect of various organic solvents on protein. Journal of Biological Chemistry. 253 (18), 6423-6425 (1978).
- Loo, J. A., Loo, R. R. O., Udseth, H. R., Edmonds, C. G., Smith, R. D. Solvent-induced conformational changes of polypeptides probed by electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5 (3), 101-105 (1991).
- Simpson, D. M., Beynon, R. J. Acetone precipitation of proteins and the modification of peptides. Journal of Proteome Research. 9 (1), 444-450 (2010).
- Güray, M. Z., Zheng, S., Doucette, A. A. Mass spectrometry of intact proteins reveals +98 u chemical artifacts following precipitation in acetone. Journal of Proteome Research. 16 (2), 889-897 (2017).
- Doucette, A. A., Vieira, D. B., Orton, D. J., Wall, M. J. Resolubilization of precipitated intact membrane proteins with cold formic acid for analysis by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 13 (12), 6001-6012 (2014).
- Beavis, R. C., Chait, B. T. Rapid, sensitive analysis of protein mixtures by mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (17), 6873-6877 (1992).
- Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer’s β-Amyloid protein is covalently modified when dissolved in formic acid. Journal of Neurochemistry. 54 (6), 2050-2056 (1990).
- Vuckovic, D., Dagley, L. F., Purcell, A. W., Emili, A. Membrane proteomics by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry: Analytical approaches and challenges. Proteomics. 13 (3-4), 404-423 (2013).
- Smith, L. M., et al. The human proteoform project: Defining the human proteome. Science Advances. 7 (46), (2021).
