Kütle Spektrometrisinden Önce Sağlam Proteom Saflaştırması için Organik Solvent Bazlı Protein Yağışı
Summary
Mevcut protokol, kütle spektrometrisinden önce proteom numunelerinin sağlam ve hızlı geri kazanımı ve saflaştırılması için kontrollü koşullar altında çözücü bazlı protein çökeltmesini açıklamaktadır.
Abstract
Kütle spektrometresi (MS) cihazlarındaki çoklu ilerlemeler kalitatif ve kantitatif proteom analizini geliştirmiş olsa da, MS’ten önce proteinleri izole etmek, zenginleştirmek ve işlemek için daha güvenilir ön uç yaklaşımları başarılı proteom karakterizasyonu için kritik öneme sahiptir. Düşük, tutarsız protein geri kazanımı ve yüzey aktif maddeler gibi artık safsızlıklar MS analizine zararlıdır. Protein çökeltmesi genellikle diğer numune hazırlama stratejilerine kıyasla güvenilmez, zaman alıcı ve teknik olarak gerçekleştirilmesi zor olarak kabul edilir. Bu endişeler, optimal protein çökeltme protokolleri kullanılarak aşılır. Aseton çökeltmesi için, spesifik tuzların, sıcaklık kontrolünün, çözücü bileşiminin ve çökeltme süresinin kombinasyonu kritik öneme sahipken, kloroform/metanolün/su çökeltmesinin verimliliği uygun pipetleme ve şişe manipülasyonuna bağlıdır. Alternatif olarak, bu çökeltme protokolleri tek kullanımlık bir spin kartuşu içinde kolaylaştırılmış ve yarı otomatiktir. Geleneksel formatta ve tek kullanımlık, iki aşamalı bir filtreleme ve ekstraksiyon kartuşu kullanılarak solvent bazlı protein çökeltmesinin beklenen sonuçları bu çalışmada gösterilmiştir. Bu, proteomik karışımların aşağıdan yukarıya LC-MS / MS analizi ile ayrıntılı karakterizasyonunu içerir. SDS tabanlı iş akışlarının üstün performansı, kontamine olmayan proteinlere göre de gösterilmiştir.
Introduction
Kütle spektrometresi ile proteom analizi, modern MS cihazlarının gelişmiş hassasiyeti, çözünürlüğü, tarama hızı ve çok yönlülüğü nedeniyle giderek daha titiz hale gelmiştir. MS ilerlemeleri, daha fazla protein tanımlama verimliliğine ve daha hassas kantitasyona katkıda bulunur 1,2,3,4,5. Geliştirilmiş MS enstrümantasyonu ile araştırmacılar, iş akışının tüm aşamalarında minimum sürede yüksek saflıkta proteinlerin kantitatif geri kazanımını sağlayabilen, buna karşılık gelen tutarlı bir ön uç numune hazırlama stratejisi talep etmektedirler 6,7,8,9,10,11 . Biyolojik bir sistemin proteom durumunu doğru bir şekilde yansıtmak için, proteinler doğal numune matrisinden verimli ve tarafsız bir şekilde izole edilmelidir. Bu amaçla, sodyum dodesil sülfat (SDS) gibi denatüre edici bir yüzey aktif madde de dahil olmak üzere, etkili protein ekstraksiyonu ve çözündürme sağlar12. Bununla birlikte, SDS, elektrosprey iyonizasyonuna güçlü bir şekilde müdahale eder ve uygun şekilde elimine edilmezse ciddi MS sinyal bastırmasına neden olur13.
Sonraki proteom analizi için, proteinlerin tek kullanımlık spin kartuşları14,15,16’da bulunan moleküler ağırlık kesme filtresinin üzerinde tutulması gibi çeşitli SDS tükenme stratejileri mevcuttur. Filtre destekli numune hazırlama yöntemi (FASP), SDS’yi 10 ppm’nin altında etkili bir şekilde tükettiği ve optimal MS’yi kolaylaştırdığı için tercih edilir. Bununla birlikte, FASP ile protein geri kazanımı değişkendir ve bu da diğer tekniklerin araştırılmasına neden olmuştur. Proteini (veya yüzey aktif maddeyi) seçici olarak yakalayan kromatografik yaklaşımlar, çeşitli uygun kartuşlara veya boncuk bazlı formatlara dönüşmüştür 17,18,19,20,21. Protein saflaştırmaya yönelik bu basit ve (ideal olarak) tutarlı stratejiler göz önüne alındığında, organik çözücülerle protein çökeltmesinin klasik yaklaşımı genellikle protein izolasyonuna umut verici bir yaklaşım olarak göz ardı edilir. Solvent çökeltmesinin SDS’yi kritik seviyelerin altına başarıyla tükettiği gösterilmiş olsa da, protein geri kazanımı bu yaklaşımın uzun süredir devam eden bir endişesi olmuştur. Birden fazla grup, protein konsantrasyonunun, moleküler ağırlığın ve hidrofobikliğin bir fonksiyonu olarak kabul edilemez derecede düşük yağış verimi ile bir protein geri kazanım önyargısı gözlemlemiştir22,23. Literatürde bildirilen yağış protokollerinin çeşitliliği nedeniyle standartlaştırılmış yağış koşulları geliştirilmiştir. 2013 yılında, Crowell ve ark. ilk olarak% 80 aseton24’teki proteinlerin çökeltme verimliliğine iyonik mukavemetin bağımlılığını bildirmiştir. İncelenen tüm proteinler için, 30 mM’ye kadar sodyum klorür ilavesinin, verimi en üst düzeye çıkarmak için gerekli olduğu gösterilmiştir (% 100’e kadar geri kazanım). Daha yakın zamanlarda, Nickerson ve ark., aseton yağışı sırasında daha yüksek iyonik mukavemetin (100 mM’ye kadar) yüksek sıcaklık (20 ° C) ile kombinasyonunun 2-5 dakika25’te neredeyse kantitatif iyileşme sağladığını göstermiştir. Düşük moleküler ağırlıklı (LMW) proteinlerin geri kazanımında hafif bir düşüş gözlendi. Bu nedenle, Baghalabadi ve ark. tarafından hazırlanan bir sonraki rapor, spesifik tuzları, özellikle çinko sülfatı, daha yüksek bir organik çözücü (% 97 aseton) ile birleştirerek LMW proteinlerinin ve peptitlerinin (≤5 kDa) başarılı bir şekilde geri kazanıldığını göstermiştir26.
Yağış protokolünün rafine edilmesi, MS bazlı proteomikler için daha güvenilir bir protein saflaştırma stratejisi sunarken, geleneksel çökeltmenin başarısı büyük ölçüde kullanıcı tekniğine dayanmaktadır. Bu çalışmanın birincil amacı, protein peletinin kirletici süpernatandan izolasyonunu kolaylaştıran sağlam bir çökeltme stratejisi sunmaktır. Gözenekli PTFE membran filtresi27 üzerinde agrega proteini izole ederek pipetlemeyi ortadan kaldırmak için tek kullanımlık bir filtreleme kartuşu geliştirilmiştir. Süpernatanttaki MS müdahale eden bileşenler, kısa, düşük hızlı bir santrifüjleme adımında etkili bir şekilde çıkarılır. Tek kullanımlık filtre kartuşu ayrıca, kütle spektrometrisinden önce, çözündürme ve isteğe bağlı protein sindiriminin ardından numunenin temizlenmesini kolaylaştıran değiştirilebilir bir SPE kartuşu sunar.
Modifiye aseton ve kloroform/metanol/su28 protokolleri de dahil olmak üzere bir dizi önerilen proteom çökeltme iş akışı, geleneksel (şişe bazlı) ve tek kullanımlık iki durumlu filtreleme ve ekstraksiyon kartuşunda yarı otomatik bir formatta sunulmaktadır. Elde edilen protein geri kazanımları ve SDS tükenme verimlilikleri, her protokolden beklenen sonucu göstermek için aşağıdan yukarıya LC-MS / MS proteom kapsamı ile birlikte vurgulanır. Her yaklaşımla ilişkili pratik faydalar ve dezavantajlar tartışılmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Optimal MS karakterizasyonu, artık SDS 10 ppm’nin altında tükendiğinde elde edilir. FASP ve boncuk üzerinde sindirim gibi alternatif yaklaşımlar, değişken geri kazanım31,32,33 ile kantitatif SDS tükenmesi sunarken, yağışın birincil amacı saflığı ve verimi aynı anda en üst düzeye çıkarmaktır. Bu, protein peletini rahatsız etmeden süpernatantın (SDS içeren) etkili bir şekilde izole edilmesine bağlıd…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi tarafından finanse edilmiştir. Yazarlar, MS verilerinin elde edilmesine katkılarından dolayı Hasta Çocuklar Hastanesi’ndeki (Toronto, Kanada) Bioinformatics Solutions Inc. (Waterloo, Kanada) ve SPARC BioCentre’a (Moleküler Analiz) teşekkür eder.
Materials
| Acetone | Fisher Scientific | AC177170010 | ≤0.002 % aldehyde |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-4 | HPLC grade |
| Ammonium Bicarbonate | Millipore Sigma | A6141-1KG | solid |
| Beta mercaptoethanol | Millipore Sigma | M3148-25ML | Molecular biology grade |
| Bromophenol blue | Millipore Sigma | B8026-5G | Bromophenol blue sodium salt |
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-400 | Chloroform |
| Formic Acid | Honeywell | 56302 | Eluent additive for LC-MS |
| Fusion Lumos Mass Spectrometer | ThermoFisher Scientific | for analysis of standard protein mixture | |
| Glycerol | Millipore Sigma | 356352-1L-M | For molecular biology, > 99% |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A4641 | HPLC grade |
| Methanol | Fisher Scientific | A452SK-4 | HPLC grade |
| Microcentrifuge | Fisher Scientific | 75-400-102 | up to 21,000 xg |
| Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Fisher Scientific | 05-408-130 | tapered bottom |
| Microcentrifuge Tube (2 mL) | Fisher Scientific | 02-681-321 | rounded bottom |
| Micropipette Tips (0.1-10 μL) | Fisher Scientific | 21-197-28 | Universal pipet tip, non-sterile |
| Micropipette Tips (1-200 μL) | Fisher Scientific | 07-200-302 | Universal pipet tip, non-sterile |
| Micropipette Tips (200-1000 μL) | Fisher Scientific | 07-200-303 | Universal pipet tip, non-sterile |
| Micropipettes | Fisher Scientific | 13-710-903 | Micropipet Trio pack |
| Pepsin | Millipore Sigma | P0525000 | Lyophilized powder, >3200 units/ mg |
| ProTrap XG | Proteoform Scientific | PXG-0002 | 50 complete units per box |
| Sodium Chloride | Millipore Sigma | S9888-1KG | ACS reagent, >99 % |
| Sodium Dodecyl Sulfate | ThermoFisher Scientific | 28312 | powdered solid |
| timsTOF Pro Mass Spectrometer | Bruker | for analysis of liver proteome extract | |
| Trifluoroacetic Acid | ThermoFisher Scientific | L06374.AP | 99% |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-500 | Molecular biology grade |
| Trypsin | Millipore Sigma | 9002-07-7 | From bovine pancreas, TPCK-treated |
| Urea | Bio-Rad | 1610731 | solid |
| Water (deionized) | Sartorius Arium Mini Water Purification System | 76307-662 | Type 1 ultrapure (18.2 MΩ cm) |
| Zinc Sulfate | Millipore Sigma | 307491-100G | solid |
Referências
- Kilpatrick, L. E., Kilpatrick, E. L. Optimizing high-resolution mass spectrometry for the identification of low-abundance post-translational modifications of intact proteins. Journal of Proteome Research. 16 (9), 3255-3265 (2017).
- Scheffler, K., Viner, R., Damoc, E. High resolution top-down experimental strategies on the Orbitrap platform. Journal of Proteomics. 175, 42-55 (2018).
- Quaranta, A., et al. N -Glycosylation profiling of intact target proteins by high-resolution mass spectrometry (MS) and glycan analysis using ion mobility-MS/MS. Analyst. 145 (5), 1737-1748 (2020).
- Van Der Burgt, Y. E. M., et al. Structural analysis of monoclonal antibodies by ultrahigh resolution MALDI in-source decay FT-ICR mass spectrometry. Analytical Chemistry. 91 (3), 2079-2085 (2019).
- Anderson, L. C., et al. Identification and characterization of human proteoforms by top-down LC-21 Tesla FT-ICR mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 16 (2), 1087-1096 (2017).
- Nickerson, J. L., et al. Recent advances in top-down proteome sample processing ahead of MS analysis. Mass Spectrometry Reviews. , (2021).
- Kelly, R. T. Single-cell Proteomics: Progress and Prospects. Molecular and Cellular Proteomics. 19 (11), 1739-1748 (2020).
- Alexovič, M., Sabo, J., Longuespée, R. Microproteomic sample preparation. Proteomics. 21 (9), 2000318 (2021).
- Shishkova, E., Coon, J. J. Rapid preparation of human blood plasma for bottom-up proteomics analysis. STAR Protocols. 2 (4), 100856 (2021).
- Duong, V. A., Park, J. M., Lee, H. Review of three-dimensional liquid chromatography platforms for bottom-up proteomics. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1524 (2020).
- Gan, G., et al. SCASP: A simple and robust SDS-aided sample preparation method for proteomic research. Molecular and Cellular Proteomics. 20, 100051 (2021).
- Kachuk, C., Doucette, A. A. The benefits (and misfortunes) of SDS in top-down proteomics. Journal of Proteomics. 175, 75-86 (2018).
- Rundlett, K. L., Armstrong, D. W. Mechanism of signal suppression by anionic surfactants in capillary electrophoresis-electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Chemistry. 68 (19), 3493-3497 (1996).
- Wis, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).
- Ni, M., et al. Modified filter-aided sample preparation (FASP) method increases peptide and protein identifications for shotgun proteomics. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 31 (2), 171-178 (2017).
- Zhao, Q., et al. imFASP: An integrated approach combining in-situ filter-aided sample pretreatment with microwave-assisted protein digestion for fast and efficient proteome sample preparation. Analytica Chimica Acta. 912, 58-64 (2016).
- Kanshin, E., et al. Ultrasensitive proteome analysis using paramagnetic bead technology. Molecular Systems Biology. 10 (10), 757 (2014).
- Hughes, C. S., et al. Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments. Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).
- Dagley, L. F., Infusini, G., Larsen, R. H., Sandow, J. J., Webb, A. I. Universal solid-phase protein preparation (USP3) for bottom-up and top-down proteomics. Journal of Proteome Research. 18 (7), 2915-2924 (2019).
- Hengel, S. M., et al. Evaluation of SDS depletion using an affinity spin column and IMS-MS detection. Proteomics. 12 (21), 3138-3142 (2012).
- Zougman, A., Selby, P. J., Banks, R. E. Suspension trapping (STrap) sample preparation method for bottom-up proteomics analysis. PROTEOMICS. 14 (9), 1006-1010 (2014).
- Thongboonkerd, V., McLeish, K. R., Arthur, J. M., Klein, J. B. Proteomic analysis of normal human urinary proteins isolated by acetone precipitation or ultracentrifugation. Kidney International. 62 (4), 1461-1469 (2002).
- Klont, F., et al. Assessment of sample preparation bias in mass spectrometry-based proteomics. Analytical Chemistry. 90 (8), 5405-5413 (2018).
- Crowell, A. M. J., Wall, M. J., Doucette, A. A. Maximizing recovery of water-soluble proteins through acetone precipitation. Analytica Chimica Acta. 796, 48-54 (2013).
- Nickerson, J. L., Doucette, A. A. Rapid and quantitative protein precipitation for proteome analysis by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 19 (5), 2035-2042 (2020).
- Baghalabadi, V., Doucette, A. A. Mass spectrometry profiling of low molecular weight proteins and peptides isolated by acetone precipitation. Analytica Chimica Acta. 1138, 38-48 (2020).
- Crowell, A. M. J., MacLellan, D. L., Doucette, A. A. A two-stage spin cartridge for integrated protein precipitation, digestion and SDS removal in a comparative bottom-up proteomics workflow. Journal of Proteomics. 118, 140-150 (2015).
- Wessel, D., Flügge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Analytical Biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).
- Arand, M., Friedberg, T., Oesch, F. Colorimetric quantitation of trace amounts of sodium lauryl sulfate in the presence of nucleic acids and proteins. Analytical Biochemistry. 207 (1), 73-75 (1992).
- Tukey, J. W. Exploratory data analysis. Biometrics. 33, 768 (1977).
- Ludwig, K. R., Schroll, M. M., Hummon, A. B. Comparison of in-solution, FASP, and S-Trap based digestion methods for bottom-up proteomic studies. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2480-2490 (2018).
- Sielaff, M., et al. Evaluation of FASP, SP3, and iST protocols for proteomic sample preparation in the low microgram range. Journal of Proteome Research. 16 (11), 4060-4072 (2017).
- Supasri, K. M., et al. Evaluation of filter, paramagnetic, and STAGETips aided workflows for proteome profiling of symbiodiniaceae. Processes. 9 (6), 983 (2021).
- Botelho, D., et al. Top-down and bottom-up proteomics of SDS-containing solutions following mass-based separation. Journal of Proteome Research. 9 (6), 2863-2870 (2010).
- Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis. Electrophoresis. 31 (21), 3573-3579 (2010).
- Antonioli, P., Bachi, A., Fasoli, E., Righetti, P. G. Efficient removal of DNA from proteomic samples prior to two-dimensional map analysis. Journal of Chromatography A. 1216 (17), 3606-3612 (2009).
- Bryzgunova, O., et al. A reliable method to concentrate circulating DNA. Analytical Biochemistry. 408 (2), 354-356 (2011).
- Asakura, T., Adachi, K., Schwartz, E. Stabilizing effect of various organic solvents on protein. Journal of Biological Chemistry. 253 (18), 6423-6425 (1978).
- Loo, J. A., Loo, R. R. O., Udseth, H. R., Edmonds, C. G., Smith, R. D. Solvent-induced conformational changes of polypeptides probed by electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5 (3), 101-105 (1991).
- Simpson, D. M., Beynon, R. J. Acetone precipitation of proteins and the modification of peptides. Journal of Proteome Research. 9 (1), 444-450 (2010).
- Güray, M. Z., Zheng, S., Doucette, A. A. Mass spectrometry of intact proteins reveals +98 u chemical artifacts following precipitation in acetone. Journal of Proteome Research. 16 (2), 889-897 (2017).
- Doucette, A. A., Vieira, D. B., Orton, D. J., Wall, M. J. Resolubilization of precipitated intact membrane proteins with cold formic acid for analysis by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 13 (12), 6001-6012 (2014).
- Beavis, R. C., Chait, B. T. Rapid, sensitive analysis of protein mixtures by mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (17), 6873-6877 (1992).
- Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer’s β-Amyloid protein is covalently modified when dissolved in formic acid. Journal of Neurochemistry. 54 (6), 2050-2056 (1990).
- Vuckovic, D., Dagley, L. F., Purcell, A. W., Emili, A. Membrane proteomics by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry: Analytical approaches and challenges. Proteomics. 13 (3-4), 404-423 (2013).
- Smith, L. M., et al. The human proteoform project: Defining the human proteome. Science Advances. 7 (46), (2021).
