Осаждение белка на основе органических растворителей для надежной очистки протеома перед масс-спектрометрией

Summary

Настоящий протокол описывает осаждение белка на основе растворителей в контролируемых условиях для надежного и быстрого восстановления и очистки образцов протеома перед масс-спектрометрией.

Abstract

В то время как многочисленные достижения в инструментах масс-спектрометрии (РС) улучшили качественный и количественный анализ протеомов, более надежные интерфейсные подходы к выделению, обогащению и обработке белков перед РС имеют решающее значение для успешной характеристики протеома. Низкое, непоследовательное восстановление белка и остаточные примеси, такие как поверхностно-активные вещества, наносят ущерб анализу РС. Осаждение белка часто считается ненадежным, трудоемким и технически сложным для выполнения по сравнению с другими стратегиями подготовки образцов. Эти проблемы преодолеваются путем использования оптимальных протоколов осаждения белка. Для осаждения ацетона комбинация конкретных солей, контроля температуры, состава растворителя и времени осаждения имеет решающее значение, в то время как эффективность осаждения хлороформа / метанола / воды зависит от надлежащего пипетирования и манипуляции с флаконами. В качестве альтернативы, эти протоколы осаждения оптимизированы и полуавтоматизированы в одноразовом отжимном картридже. В данной работе проиллюстрированы ожидаемые результаты осаждения белка на основе растворителя в традиционном формате и с использованием одноразового двухступенчатого фильтрационного и экстракционного картриджа. Это включает в себя детальную характеристику протеомных смесей с помощью анализа LC-MS/MS снизу вверх. Превосходная производительность рабочих процессов на основе SDS также демонстрируется по сравнению с незагрязненным белком.

Introduction

Анализ протеомов с помощью масс-спектрометрии становится все более строгим благодаря повышенной чувствительности, разрешению, скорости сканирования и универсальности современных приборов MS. Достижения РС способствуют повышению эффективности идентификации белка и более точному количественному определению 1,2,3,4,5. С улучшенными приборами MS исследователи требуют соответствующей последовательной стратегии подготовки образцов, способной количественно восстанавливать белки высокой чистоты за минимальное время на всех этапах рабочего процесса 6,7,8,9,10,11 . Чтобы точно отразить протеомный статус биологической системы, белки должны быть выделены из нативной матрицы образца эффективным и непредвзятым образом. С этой целью, включая денатурирующее поверхностно-активное вещество, такое как додецилсульфат натрия (SDS), обеспечивает эффективную экстракцию белка и солюбилизацию¹². Тем не менее, SDS сильно препятствует электрораспылению ионизации, вызывая серьезное подавление сигнала MS, если не устранить должным образом¹³.

Для последующего анализа протеомов доступны различные стратегии истощения SDS, такие как удержание белков над фильтром отсечения молекулярной массы, содержащимся в одноразовых спиновых картриджах 14,15,16. Метод пробоподготовки с помощью фильтра (FASP) является предпочтительным, поскольку он эффективно истощает SDS ниже 10 ppm, способствуя оптимальному РС. Тем не менее, восстановление белка с помощью FASP является переменным, что побудило к исследованию других методов. Хроматографические подходы, которые избирательно захватывают белок (или поверхностно-активное вещество), превратились в различные удобные картриджи или форматы на основе бусин 17,18,19,20,21. Учитывая эти простые и (в идеале) последовательные стратегии очистки белка, классический подход осаждения белка органическими растворителями часто упускается из виду как перспективный подход к выделению белка. В то время как осаждение растворителей успешно истощает SDS ниже критических уровней, восстановление белка является давней проблемой этого подхода. Несколько групп наблюдали смещение восстановления белка, с неприемлемо низким выходом осадков в зависимости от концентрации белка, молекулярной массы и гидрофобности^22,23. В связи с разнообразием протоколов осаждения, о которых сообщается в литературе, были разработаны стандартизированные условия осаждения. В 2013 году Crowell et al. впервые сообщили о зависимости ионной силы от эффективности осаждения белков в 80% ацетона²⁴. Было показано, что для всех исследованных белков добавление до 30 мМ хлорида натрия необходимо для максимизации выхода (до 100% восстановления). Совсем недавно Nickerson et al. показали, что сочетание еще более высокой ионной силы (до 100 мМ) с повышенной температурой (20 °C) во время осаждения ацетона давало почти количественное восстановление за 2-5 мин²⁵. Наблюдалось небольшое снижение восстановления низкомолекулярных (LMW) белков. Таким образом, последующий отчет Baghalabadi et al. продемонстрировал успешное восстановление белков и пептидов LMW (≤5 кДа) путем объединения специфических солей, особенно сульфата цинка, с более высоким уровнем органического растворителя (97% ацетона)²⁶.

В то время как совершенствование протокола осаждения обеспечивает более надежную стратегию очистки белка для протеомики на основе MS, успех обычных осадков в значительной степени зависит от пользовательской техники. Основной целью этой работы является представление надежной стратегии осаждения, которая облегчает выделение белковой гранулы из загрязняющего супернатанта. Одноразовый фильтрационный картридж был разработан для устранения пипетирования путем выделения агрегированного белка над пористым мембранным фильтром^{27 из PTFE}. МС-интерферирующие компоненты в супернатанте эффективно удаляются на короткой низкоскоростной стадии центрифугирования. Одноразовый фильтрующий картридж также предлагает сменный картридж SPE, который облегчает последующую очистку образца после рерастворимости и дополнительного переваривания белка перед масс-спектрометрией.

Здесь представлен ряд рекомендуемых рабочих процессов осаждения протеомов, включая модифицированные протоколы ацетона и хлороформа/метанола/воды²⁸ , в обычном (на основе флаконов) и полуавтоматическом формате в одноразовом двухсударственном фильтрационном и экстракционном картридже. Результирующее восстановление белка и эффективность истощения SDS выделены вместе с покрытием протеома LC-MS/MS снизу вверх, чтобы продемонстрировать ожидаемый результат от каждого протокола. Обсуждаются практические преимущества и недостатки, связанные с каждым подходом.

Protocol

1. Материальные соображения и предварительная подготовка образцов Используйте только растворители высокой чистоты (ацетон, хлороформ, метанол) (>99,5%) и химические вещества, свободные от лишней влаги. Готовят растворы хлорида натрия и сульфата цинка (1 М) в воде.ПРИМЕ…

Representative Results

На рисунке 4 обобщено ожидаемое истощение SDS после осаждения белков на основе флакона или картриджа в одноразовый фильтрующий картридж с использованием ацетона. Обычная ночная инкубация (-20 °C) в ацетоне сравнивается с протоколом быстрого осаждения ацетона при комнатно?…

Discussion

Оптимальная характеристика МС достигается при истощении остаточного СДС ниже 10 ppm. В то время как альтернативные подходы, такие как FASP и переваривание на шариках, предлагают количественное истощение SDS с переменным извлечением ^31,32,33, основной целью …

Materials

Acetone	Fisher Scientific	AC177170010	≤0.002 % aldehyde
Acetonitrile	Fisher Scientific	A998-4	HPLC grade
Ammonium Bicarbonate	Millipore Sigma	A6141-1KG	solid
Beta mercaptoethanol	Millipore Sigma	M3148-25ML	Molecular biology grade
Bromophenol blue	Millipore Sigma	B8026-5G	Bromophenol blue sodium salt
Chloroform	Fisher Scientific	C298-400	Chloroform
Formic Acid	Honeywell	56302	Eluent additive for LC-MS
Fusion Lumos Mass Spectrometer	ThermoFisher Scientific		for analysis of standard protein mixture
Glycerol	Millipore Sigma	356352-1L-M	For molecular biology, > 99%
Isopropanol	Fisher Scientific	A4641	HPLC grade
Methanol	Fisher Scientific	A452SK-4	HPLC grade
Microcentrifuge	Fisher Scientific	75-400-102	up to 21,000 xg
Microcentrifuge Tube (1.5 mL)	Fisher Scientific	05-408-130	tapered bottom
Microcentrifuge Tube         (2 mL)	Fisher Scientific	02-681-321	rounded bottom
Micropipette Tips         (0.1-10 μL)	Fisher Scientific	21-197-28	Universal pipet tip, non-sterile
Micropipette Tips         (1-200 μL)	Fisher Scientific	07-200-302	Universal pipet tip, non-sterile
Micropipette Tips        (200-1000 μL)	Fisher Scientific	07-200-303	Universal pipet tip, non-sterile
Micropipettes	Fisher Scientific	13-710-903	Micropipet Trio pack
Pepsin	Millipore Sigma	P0525000	Lyophilized powder,           >3200 units/ mg
ProTrap XG	Proteoform Scientific	PXG-0002	50 complete units per box
Sodium Chloride	Millipore Sigma	S9888-1KG	ACS reagent, >99 %
Sodium Dodecyl Sulfate	ThermoFisher Scientific	28312	powdered solid
timsTOF Pro Mass Spectrometer	Bruker		for analysis of liver proteome extract
Trifluoroacetic Acid	ThermoFisher Scientific	L06374.AP	99%
Tris	Fisher Scientific	BP152-500	Molecular biology grade
Trypsin	Millipore Sigma	9002-07-7	From bovine pancreas, TPCK-treated
Urea	Bio-Rad	1610731	solid
Water (deionized)	Sartorius Arium Mini Water Purification System	76307-662	Type 1 ultrapure (18.2 MΩ cm)
Zinc Sulfate	Millipore Sigma	307491-100G	solid