Fingerprinting Cardiolipine in leukocyten door massaspectrometrie voor een snelle diagnose van het Barth-syndroom
Summary
Dit protocol laat zien hoe een massaspectrometrische “vingerafdruk” van leukocyten cardiolipine kan worden verkregen voor de diagnose van het Barth-syndroom. De beoordeling van de verhoogde monolysocardiolipine tot cardiolipine ratio onderscheidt patiënten met barthsyndroom van controle hartfalen patiënten met 100% sensitiviteit en specificiteit.
Abstract
Cardiolipine (CL), een dimerisch fosfolipide met vier vetzuurketens in zijn structuur, is de lipidemarker van mitochondriën, waarbij het een cruciale rol speelt in de werking van het binnenmembraan. De metaboliet monolysocardiolipin (MLCL) is fysiologisch bijna afwezig in het lipide-extract van dierlijke cellen en het uiterlijk ervan is het kenmerk van het Barth-syndroom (BTHS), een zeldzame en vaak verkeerd gediagnosticeerde genetische ziekte die ernstige cardiomyopathie in de kindertijd veroorzaakt. De hier beschreven methode genereert een “cardiolipine-vingerafdruk” en maakt een eenvoudige test van de relatieve niveaus van CL- en MLCL-soorten in cellulaire lipideprofielen mogelijk. In het geval van leukocyten is slechts 1 ml bloed nodig om de MLCL / CL-verhouding te meten via matrixondersteunde laserdesorptie-ionisatie – time-of-flight / massaspectrometrie (MALDI-TOF / MS) net binnen 2 uur na bloedonttrekking. De test is eenvoudig en kan gemakkelijk worden geïntegreerd in het routinewerk van een klinisch biochemisch laboratorium om te screenen op BTHS. De test toont 100% sensitiviteit en specificiteit voor BTHS, waardoor het een geschikte diagnostische test is.
Introduction
Barth-syndroom (BTHS) is een zeldzame X-gebonden ziekte die wordt gekenmerkt door cardiomyopathie met vroege aanvang, myopathie van de skeletspieren, groeivertraging, neutropenie, variabele mitochondriale respiratoire ketendisfunctie en abnormale mitochondriale structuur 1,2,3,4,5. BTHS heeft een prevalentie van één geval per miljoen mannen met momenteel minder dan 250 bekende gevallen wereldwijd, hoewel het algemeen wordt aanvaard dat de ziekte ondergediagnosticeerd is 2,6. BTHS is het gevolg van functieverliesmutaties van het Tafazzin (TAFAZZIN)-gen gelokaliseerd op chromosoom Xq28.12 7,8, waardoor een gebrekkige remodellering van het mitochondriale fosfolippide-cardiolipine (CL) ontstaat, een proces dat normaal gesproken leidt tot een zeer symmetrische en onverzadigde acylsamenstelling 9,10. CL wordt beschouwd als het kenmerkende lipide van mitochondriën, waar het een belangrijk bestanddeel van het binnenmembraan is, van vitaal belang voor oxidatieve fosforylering (d.w.z. mitochondriaal energiemetabolisme), supercomplexvorming, eiwitimport en betrokken bij mitochondriale dynamica, mitofagie en apoptose 11,12,13,14,15,16 . Bij TAFAZZIN-functieverlies mislukt cl-remodellering en ontstaan specifieke fosfolipideafwijkingen in mitochondriën van BTHS-patiënten: het volwassen CL-niveau (CLm) is verlaagd, terwijl verhoogde niveaus van monolysocardiolipine (MLCL) en veranderde CL-acylsamenstelling (d.w.z. onrijpe CL-soorten, CLi) optreden. Dit brengt een dramatische stijging van de MLCL/CL-ratio17 met zich mee.
De diagnose van BTHS is vaak moeilijk, omdat de aandoening extreem variabele klinische en biochemische kenmerken vertoont en in de loop van de tijd kan verschillen tussen getroffen personen uit dezelfde familie en binnen een patiënt 3,5. Veel BTHS-jongens vertonen een zeer hoog niveau van uitscheiding van 3-methylglutaconzuur (3-MGCA) in de urine, maar het urineniveau kan normaal zijn of slechts licht verhoogd bij patiënten in de loop van de tijd3. Verhoogde 3-MGCA is echter een kenmerk van verschillende andere mitochondriale en niet-mitochondriale aandoeningen, zoals 3-methylglutaconyl-CoA hydratasedeficiëntie (AUH-defect), 3-methylglutaconzuuracidurie, dystonie-doofheid, encefalopathie, Leigh-achtig (MEGDEL) -syndroom, Costeff-syndroom en gedilateerde cardiomyopathie met ataxie (DCMA) -syndroom18,19 . Vandaar dat de slechte specificiteit van 3-MCGA als marker voor BTHS en de enorme variabiliteit bij patiënten de biochemische diagnose dubbelzinnig maken.
Bovendien zijn er meer dan 120 verschillende TAFAZZIN-mutaties beschreven die de aandoening5 veroorzaken en daarom kan een genetische diagnose ingewikkeld, traag en duur zijn. Bovendien kan moleculaire analyse van het TAFAZZIN-gen leiden tot vals-negatieve resultaten in de aanwezigheid van mutaties in niet-coderende of regulerende sequenties3. BTHS kan ondubbelzinnig worden getest door de relatieve hoeveelheden en verdeling van (monolyso-)CL-soorten te bepalen en bevestigd door TAFAZZIN-gensequencing of vice versa.
Een praktijktest voor diagnose is het meten van de MLCL/CL-verhouding door middel van High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) en Electro Spray Ionization / Mass spectrometry (ESI/MS) analyse in bloedvlek20,21. Het meten van het CL-niveau alleen is niet voldoende voor de diagnose, omdat sommige patiënten bijna normale niveaus van CL hebben, maar een veranderde MLCL / CL-verhouding. Daarom heeft de meting van de MLCL/CL-ratio 100% sensitiviteit en specificiteit voor BTHS-diagnose21. Een andere gevalideerde methode op basis van HPLC- en ESI/MS-analyse is opgezet op leukocyten22, maar de complexe chromatografische technieken voor scheiding van eerder geëxtraheerde lipiden en de duurheid van de instrumenten beperken deze analyse tot enkele klinische laboratoria. Al deze factoren, samen met het ontbreken van een eenvoudige diagnostische test, hebben bijgedragen aan de onderdiagnose van de aandoening.
MALDI-TOF/MS is een ander geldig hulpmiddel in lipidenanalyse23,24. Deze analytische techniek kan worden gebruikt om direct lipideprofielen van verschillende biologische monsters te verkrijgen, waardoor extractie- en scheidingsstappen 25,26,27,28,29 worden overgeslagen, inclusief in weefselsecties voor MS Imaging-toepassingen 30. Gezien dit voordeel werd een eenvoudige en snelle methode ontwikkeld om BTHS te diagnosticeren door mitochondriale CL in intacte leukocyten te profileren met MALDI-TOF/MS28. Leukocytenisolatie van slechts 1 ml volbloed door erytrocytenbezinking en lysis is eenvoudig en vereist geen speciale apparatuur of reagentia. Bovendien werd een snel lipide “mini-extractie” protocol beschreven dat van toepassing is op minieme hoeveelheden leukocyten om de succesvolle verwerving van spectra met schonere MS-signalen met een hogere signaal-ruisverhouding (S / N) te rechtvaardigen dan in die verkregen uit intacte leukocyten28. Deze verdere stap kost weinig tijd en zorgt ervoor dat analyses reproduceerbaar zijn, zelfs wanneer ze worden uitgevoerd op MS-instrumenten met een slechte gevoeligheid. Kortom, de hier beschreven analysemethode vereist minimale monstervoorbereiding omdat tijdrovende en arbeidsintensieve chromatografische lipidescheiding kan worden overgeslagen, waardoor de test wordt versneld.
Protocol
Representative Results
Discussion
Barth-syndroom is een aangeboren fout van het metabolisme en een levensveranderende aandoening die waarschijnlijk ondergediagnosticeerd is 2,6. Zoals eerder vermeld, kan een bijdragende factor het ontbreken van een eenvoudige diagnostische test zijn. Hier werd een eenvoudige en snelle methode beschreven om de MLCL/CL-verhouding door MALDI-TOF/MS in leukocyten te meten voor BTHS-screening. Bovendien zijn MALDI-TOF massaspectrometers wijd verspreid over klinis…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn de mensen met BTHS en hun families dankbaar voor hun deelname aan ons onderzoek. We bedanken de Barth Syndrome Foundation US en de Barth Syndrome UK Trust voor hun steun en voor hun hulp bij het verzamelen van de bloedmonsters tijdens de jaarlijkse bijeenkomst in Bristol. Deze studie werd gefinancierd door Barth Syndrome Foundation US, Barth Italia Onlus en Apulia Region.
Materials
| 1,1′,2,2′-tetratetradecanoyl cardiolipin | Avanti Polar Lipids | 750332 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
| 1,1′2,2′-tetra- (9Z-octadecenoyl) cardiolipin | Avanti Polar Lipids | 710335 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
| 1,2-di- (9Z-hexadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar Lipids | 878130 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
| 1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phosphate | Avanti Polar Lipids | 830845 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
| 1,2-ditetradecanoyl-snglycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol) | Avanti Polar Lipids | 840445 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
| 1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine | Avanti Polar Lipids | 840033 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
| 2-Propanol, ACS reagent, ≥99.5% | Merck Life Science S.r.l. | 190764 | |
| 9-Aminoacridine hemihydrate, 98% | Acros Organics | 134410010 | |
| Acetonitrile, ACS reagent, ≥99.5% | Merck Life Science S.r.l. | 360457 | |
| Chloroform, ACS reagent, ≥99.8% | Merck Life Science S.r.l. | 319988 | |
| Dextran from Leuconostoc spp. Mr 450,000-650,000 | Merck Life Science S.r.l. | 31392 | |
| Flex Analysis 3.3 | Bruker Daltonics | Software | |
| MALDI-TOF mass spectrometer Microflex LRF | Bruker Daltonics | ||
| Microsoft Excel | Microsoft Office | Software | |
| OmniPur 10X PBS Liquid Concentrate | Merck Life Science S.r.l. | 6505-OP | |
| Potassium chloride, ACS reagent, 99.0-100.5% | Merck Life Science S.r.l. | P3911 | |
| Sodium chloride, ACS reagent, ≥99.0% | Merck Life Science S.r.l. | S9888 |
Referências
- Barth, P. G., et al. X-linked cardioskeletal myopathy and neutropenia (Barth syndrome): respiratory-chain abnormalities in cultured fibroblasts. Journal of Inherited Metabolic Disease. 19 (2), 157-160 (1996).
- Steward, C. G., et al. syndrome (X linked cardiac and skeletal myopathy, neutropenia, and organic aciduria): rarely recognised, frequently fatal [abstract]. Archives of Disease in Childhood. 89, 48 (2004).
- Clarke, S. L. N., et al. Barth syndrome. Orphanet Journal of Rare Diseases. 8, 23 (2013).
- Zegallai, H. M., Hatch, G. M. Barth syndrome: cardiolipin, cellular pathophysiology, management, and novel therapeutic targets. Molecular and Cellular Biochemistry. 476 (3), 1605-1629 (2021).
- Taylor, C., et al. Clinical presentation and natural history of Barth Syndrome: An overview. Journal of Inherited Metabolic Disease. 45 (1), 7-16 (2022).
- Miller, P. C., Ren, M., Schlame, M., Toth, M. J., Phoon, C. A. Bayesian analysis to determine the prevalence of Barth syndrome in the pediatric population. The Journal of Pediatrics. 217, 139-144 (2020).
- Bione, S., et al. A novel X-linked gene, G4.5. is responsible for Barth syndrome. Nature Genetics. 12 (4), 385-389 (1996).
- Whited, K., Baile, M. G., Currier, P., Claypool, S. M. Seven functional classes of Barth Syndrome mutation. Human Molecular Genetics. 22 (3), 483-492 (2013).
- Schlame, M., Ren, M., Xu, Y., Greenberg, M. L., Haller, I. Molecular symmetry in mitochondrial cardiolipins. Chemistry and Physics of Lipids. 138 (1-2), 38-49 (2005).
- Schlame, M., Xu, Y. The function of Tafazzin, a mitochondrial phospholipid-lysophospholipid acyltransferase. Journal of Molecular Biology. 432 (18), 5043-5051 (2020).
- Schlame, M., Rua, D., Greenberg, M. L. The biosynthesis and functional role of cardiolipin. Progress in Lipid Research. 39 (3), 257-288 (2000).
- Mileykovskaya, E., Dowhan, W. Cardiolipin membrane domains in prokaryotes and eukaryotes. Biochimica et Biophysica Acta. 1788 (10), 2084-2091 (2009).
- Claypool, S. M., Koehler, C. M. The complexity of cardiolipin in health and disease. Trends in Biochemical Sciences. 37 (1), 32-41 (2011).
- Ren, M., Phoon, C. K., Schlame, M. Metabolism and function of mitochondrial cardiolipin. Progress in Lipid Research. 55, 1-16 (2014).
- Paradies, G., Paradies, V., Ruggiero, F. M., Petrosillo, G. Role of cardiolipin in mitochondrial function and dynamics in health and disease: Molecular and pharmacological aspects. Cells. 8 (7), 728 (2019).
- Acoba, M. G., Senoo, N., Claypool, S. M. Phospholipid ebb and flow makes mitochondria go. The Journal of Cell Biology. 219 (8), 03131 (2020).
- Schlame, M., et al. Phospholipid abnormalities in children with Barth syndrome. Journal of the American College of Cardiology. 42 (11), 1994-1999 (2003).
- Wortmann, S. B., et al. Inborn errors of metabolism with 3-methylglutaconic aciduria as discriminative feature: proper classification and nomenclature. Journal of Inherited Metabolic Disease. 36 (6), 923-928 (2013).
- Ikon, N., Ryan, R. O. On the origin of 3-methylglutaconic acid in disorders of mitochondrial energy metabolism. Journal of Inherited Metabolic Disease. 39 (5), 749-756 (2016).
- Kulik, W., et al. Bloodspot assay using HPLC-tandem mass spectrometry for detection of Barth syndrome. Clinical Chemistry. 54 (2), 371-378 (2008).
- Vaz, F. M., et al. An improved functional assay in blood spot to diagnose Barth syndrome using the monolysocardiolipin/cardiolipin ratio. Journal of Inherited Metabolic Disease. 45 (1), 29-37 (2022).
- Bowron, A., et al. Diagnosis of Barth syndrome using a novel LC-MS/MS method for leukocyte cardiolipin analysis. Journal of Inherited Metabolic Disease. 36 (5), 741-746 (2013).
- Sun, G., et al. Matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometric analysis of cellular glycerophospholipids enabled by multiplexed solvent dependent analyte-matrix interactions. Analytical Chemistry. 80 (19), 7576-7585 (2008).
- Leopold, J., Popkova, Y., Engel, K. M., Schiller, J. Recent developments of useful MALDI matrices for the mass spectrometric characterization of lipids. Biomolecules. 8 (4), 173 (2018).
- Angelini, R., Babudri, F., Lobasso, S., Corcelli, A. MALDI-TOF/MS analysis of archaebacterial lipids in lyophilized membranes dry-mixed with 9-aminoacridine. The Journal of Lipid Research. 51 (9), 2818-2825 (2010).
- Angelini, R., et al. Lipidomics of intact mitochondria by MALDI-TOF MS. The Journal of Lipid Research. 53 (7), 1417-1425 (2012).
- Angelini, R., Vormieter, G., Corcelli, A., Fuchs, B. A fast method for the determination of PC/LPC ratio in intact horse serum by MALDI-TOF-MS: an easy-to-follow lipid biomarker of inflammation. Chemistry and Physics of Lipids. 183, 169-175 (2014).
- Angelini, R., et al. Cardiolipin fingerprinting of leukocytes by MALDI-TOF/MS as a screening tool for Barth syndrome. The Journal of Lipid Research. 56 (9), 1787-1794 (2015).
- Lobasso, S., et al. A lipidomic approach to identify potential biomarkers in exosomes from melanoma cells with different metastatic potential. Frontiers in Physiology. 12, 748895 (2021).
- Angelini, R., et al. Visualizing cholesterol in the brain by on-tissue derivatization and quantitative mass spectrometry imaging. Analytical Chemistry. 93 (11), 4932-4949 (2021).
- Greco, V., et al. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical proteomics. Expert Review of Proteomics. 15 (8), 683-696 (2018).
- Duncan, M., DeMarco, M. L. MALDI-MS: Emerging roles in pathology and laboratory medicine. Clinical Mass Spectrometry (Del Mar, Calif). 13, 1-4 (2019).
