Fingerprinting von Cardiolipin in Leukozyten mittels Massenspektrometrie zur schnellen Diagnose des Barth-Syndroms
Summary
Dieses Protokoll zeigt, wie man einen massenspektrometrischen “Fingerabdruck” von Leukozyten-Cardiolipin für die Diagnose des Barth-Syndroms erhält. Die Beurteilung des erhöhten Monolysocardiolipin-zu-Cardiolipin-Verhältnisses unterscheidet Patienten mit Barth-Syndrom von Patienten mit kontrollierter Herzinsuffizienz mit 100% Sensitivität und Spezifität.
Abstract
Cardiolipin (CL), ein dimeres Phospholipid, das vier Fettsäureketten in seiner Struktur trägt, ist der Lipidmarker der Mitochondrien, wobei es eine entscheidende Rolle bei der Funktion der inneren Membran spielt. Sein Metabolit Monolysocardiolipin (MLCL) fehlt physiologisch fast im Lipidextrakt tierischer Zellen und sein Aussehen ist das Kennzeichen des Barth-Syndroms (BTHS), einer seltenen und oft falsch diagnostizierten genetischen Erkrankung, die im Säuglingsalter eine schwere Kardiomyopathie verursacht. Die hier beschriebene Methode erzeugt einen “Cardiolipin-Fingerabdruck” und ermöglicht eine einfache Bestimmung der relativen Konzentrationen von CL- und MLCL-Spezies in zellulären Lipidprofilen. Im Falle von Leukozyten wird nur 1 ml Blut benötigt, um das MLCL/CL-Verhältnis mittels matrixgestützter Laserdesorptionsionisation – Flugzeit-/Massenspektrometrie (MALDI-TOF/MS) nur innerhalb von 2 h nach der Blutentnahme zu messen. Der Assay ist unkompliziert und kann leicht in die Routinearbeit eines klinisch-biochemischen Labors integriert werden, um auf BTHS zu screenen. Der Test zeigt eine 100% ige Sensitivität und Spezifität für BTHS und ist damit ein geeigneter diagnostischer Test.
Introduction
Das Barth-Syndrom (BTHS) ist eine seltene X-chromosomale Erkrankung, die durch früh einsetzende Kardiomyopathie, Skelettmuskelmyopathie, Wachstumsverzögerung, Neutropenie, variable mitochondriale Atmungskettendysfunktion und abnormale mitochondriale Strukturgekennzeichnet ist 1,2,3,4,5. BTHS hat eine Prävalenz von einem Fall pro Million Männer mit derzeit weniger als 250 bekannten Fällen weltweit, obwohl es allgemein anerkannt ist, dass die Krankheit unterdiagnostiziertist 2,6. BTHS resultiert aus Funktionsverlustmutationen des Tafazzin (TAFAZZIN) -Gens, die auf dem Chromosom Xq28.127,8 lokalisiert sind und eine mangelhafte Umgestaltung des mitochondrialen Phospholipids Cardiolipin (CL) verursachen, ein Prozess, der normalerweise zu einer hochsymmetrischen und ungesättigten Acylzusammensetzung führt 9,10. CL wurde als Signaturlipid der Mitochondrien angesehen, wo es ein wichtiger Bestandteil der inneren Membran ist, der für die oxidative Phosphorylierung (dh den mitochondrialen Energiestoffwechsel), die Bildung von Superkomplexen, den Proteinimport und die mitochondriale Dynamik, Mitophagie und Apoptose unerlässlich ist 11,12,13,14,15,16 . Bei Verlust der Funktion von TAFAZZIN schlägt der CL-Remodeling fehl und spezifische Phospholipidanomalien treten in den Mitochondrien von BTHS-Patienten auf: Der reife CL-Spiegel (CLm) ist erniedrigt, während erhöhte Spiegel von Monolysocardiolipin (MLCL) und veränderter CL-Acylzusammensetzung (dh unreife CL-Spezies, CLi) auftreten. Dies führt zu einem dramatischen Anstieg des MLCL/CL-Verhältnissesum 17.
Die Diagnose von BTHS ist oft schwierig, da die Erkrankung extrem unterschiedliche klinische und biochemische Merkmale aufweist und sich zwischen betroffenen Personen aus derselben Familie und innerhalb eines Patienten im Laufe der Zeit unterscheiden kann 3,5. Viele BTHS-Jungen zeigen eine sehr hohe Harnausscheidung von 3-Methylglutaconsäure (3-MGCA), aber der Urinspiegel kann bei Patienten im Laufe der Zeit normal oder nur leicht erhöhtsein 3. Ein erhöhter 3-MGCA ist jedoch ein Merkmal verschiedener anderer mitochondrialer und nicht-mitochondrialer Erkrankungen, wie 3-Methylglutaconyl-CoA-Hydratase-Mangel (AUH-Defekt), 3-Methylglutaconsäureurie, Dystonie-Taubheit, Enzephalopathie, Leigh-like (MEGDEL) -Syndrom, Costeff-Syndrom und dilatative Kardiomyopathie mit Ataxie (DCMA) -Syndrom18,19 . Daher machen die schlechte Spezifität von 3-MCGA als Marker für BTHS und die enorme Variabilität der Patienten die biochemische Diagnose mehrdeutig.
Darüber hinaus wurden über 120 verschiedene TAFAZZIN-Mutationen beschrieben, die die Störung5 verursachen, und daher kann eine genetische Diagnose kompliziert, langsam und teuer sein. Darüber hinaus kann die molekulare Analyse des TAFAZZIN-Gens zu falsch-negativen Ergebnissen führen, wenn Mutationen in nicht-kodierenden oder regulierenden Sequenzenvorliegen 3. BTHS kann durch Bestimmung der relativen Mengen und Verteilung von (monolyso-)CL-Arten eindeutig getestet und durch TAFAZZIN-Gensequenzierung bestätigt werden oder umgekehrt.
Ein praktischer Test für die Diagnose ist die Messung des MLCL/CL-Verhältnisses durch High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) und Electro Spray Ionization / Mass Spectrotry (ESI/MS) Analyse im Blutfleck20,21. Die Messung des CL-Spiegels allein ist für die Diagnose nicht ausreichend, da einige Patienten nahezu normale CL-Spiegel aufweisen, aber das MLCL/CL-Verhältnis verändert haben. Daher hat die Messung des MLCL/CL-Verhältnisses eine 100%ige Sensitivität und Spezifität für die BTHS-Diagnose21. Eine weitere validierte Methode, die auf HPLC- und ESI/MS-Analysen basiert, wurde auf Leukozyten22 eingerichtet, aber die komplexen chromatographischen Techniken zur Trennung von zuvor extrahierten Lipiden und die Kosten der Instrumente beschränken diese Analyse auf einige wenige klinische Laboratorien. All diese Faktoren, zusammen mit dem Fehlen eines einfachen diagnostischen Tests, haben zur Unterdiagnose der Erkrankung beigetragen.
MALDI-TOF/MS ist ein weiteres valides Werkzeug in der Lipidanalytik23,24. Diese Analysetechnik kann verwendet werden, um direkt Lipidprofile verschiedener biologischer Proben zu erhalten, wodurch die Extraktions- und Trennschritte 25,26,27,28,29, einschließlich in Gewebeabschnitten für MS Imaging-Anwendungen 30, übersprungen werden. Angesichts dieses Vorteils wurde eine einfache und schnelle Methode zur Diagnose von BTHS durch Profiling von mitochondrialer CL in intakten Leukozyten mit MALDI-TOF/MS entwickelt28. Die Leukozytenisolierung aus nur 1 ml Vollblut durch Erythrozytensedimentation und Lyse ist unkompliziert und erfordert keine spezielle Ausrüstung oder Reagenzien. Darüber hinaus wurde ein schnelles Lipid-“Mini-Extraktions”-Protokoll beschrieben, das auf winzige Mengen von Leukozyten anwendbar ist, um die erfolgreiche Aufnahme von Spektren mit saubereren MS-Signalen mit einem höheren Signal-Rausch-Verhältnis (S/N) als bei intakten Leukozyten28 zu rechtfertigen. Dieser weitere Schritt nimmt wenig Zeit in Anspruch und ermöglicht es, Analysen auch dann reproduzierbar zu machen, wenn sie an MS-Instrumenten mit geringer Empfindlichkeit durchgeführt werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die hier beschriebene analytische Methode eine minimale Probenvorbereitung erfordert, da eine zeit- und arbeitsintensive chromatographische Lipidtrennung übersprungen werden kann, wodurch der Test beschleunigt wird.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Barth-Syndrom ist ein angeborener Stoffwechselfehler und eine lebensverändernde Erkrankung, die wahrscheinlich unterdiagnostiziert wird 2,6. Wie bereits erwähnt, kann ein beitragender Faktor das Fehlen eines einfachen diagnostischen Tests sein. Hier wurde eine einfache und schnelle Methode zur Messung des MLCL/CL-Verhältnisses durch MALDI-TOF/MS in Leukozyten für das BTHS-Screening beschrieben. Darüber hinaus sind MALDI-TOF-Massenspektrometer in kli…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken den Personen mit BTHS und ihren Familien für die Teilnahme an unserer Forschung. Wir danken der Barth Syndrome Foundation US und dem Barth Syndrome UK Trust für ihre Unterstützung und für ihre Hilfe bei der Entnahme der Blutproben auf der Jahrestagung in Bristol. Diese Studie wurde von der Barth Syndrome Foundation US, Barth Italia Onlus und der Region Apulien finanziert.
Materials
| 1,1′,2,2′-tetratetradecanoyl cardiolipin | Avanti Polar Lipids | 750332 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
| 1,1′2,2′-tetra- (9Z-octadecenoyl) cardiolipin | Avanti Polar Lipids | 710335 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
| 1,2-di- (9Z-hexadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar Lipids | 878130 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
| 1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phosphate | Avanti Polar Lipids | 830845 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
| 1,2-ditetradecanoyl-snglycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol) | Avanti Polar Lipids | 840445 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
| 1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine | Avanti Polar Lipids | 840033 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
| 2-Propanol, ACS reagent, ≥99.5% | Merck Life Science S.r.l. | 190764 | |
| 9-Aminoacridine hemihydrate, 98% | Acros Organics | 134410010 | |
| Acetonitrile, ACS reagent, ≥99.5% | Merck Life Science S.r.l. | 360457 | |
| Chloroform, ACS reagent, ≥99.8% | Merck Life Science S.r.l. | 319988 | |
| Dextran from Leuconostoc spp. Mr 450,000-650,000 | Merck Life Science S.r.l. | 31392 | |
| Flex Analysis 3.3 | Bruker Daltonics | Software | |
| MALDI-TOF mass spectrometer Microflex LRF | Bruker Daltonics | ||
| Microsoft Excel | Microsoft Office | Software | |
| OmniPur 10X PBS Liquid Concentrate | Merck Life Science S.r.l. | 6505-OP | |
| Potassium chloride, ACS reagent, 99.0-100.5% | Merck Life Science S.r.l. | P3911 | |
| Sodium chloride, ACS reagent, ≥99.0% | Merck Life Science S.r.l. | S9888 |
Referências
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