Barth 증후군의 신속한 진단을 위해 질량 분광법에 의한 백혈구의 카디오리핀 지문 채취
Summary
이 프로토콜은 Barth 증후군의 진단을 위해 백혈구 카디오리핀의 질량 분광법 “지문”을 얻는 방법을 보여줍니다. 모노리소카디오리핀과 카디오리핀 비율의 상승된 평가는 바르트 증후군 환자를 100% 민감도와 특이성을 가진 대조군 심부전 환자와 구별합니다.
Abstract
카디오리핀 (CL)은 그 구조에서 네 개의 지방산 사슬을 운반하는 이량체 인지질로, 미토콘드리아의 지질 마커이며, 여기서 내막의 기능에 중요한 역할을합니다. 그것의 대사 산물 monolysocardiolipin (MLCL)는 생리 학적으로 동물 세포의 지질 추출물에 거의 존재하지 않으며 그 외관은 유아기에 심각한 심근 병증을 일으키는 희귀하고 종종 잘못 진단 된 유전 질환 인 Barth 증후군 (BTHS)의 특징입니다. 여기에 기술된 방법은 “카디오리핀 지문”을 생성하고, 세포 지질 프로파일에서 CL 및 MLCL 종의 상대적 수준에 대한 간단한 검정을 허용한다. 백혈구의 경우, 혈액 철수로부터 2 시간 이내에 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 (비행 시간 / 질량 분광법 (MALDI-TOF / MS) 를 통해 MLCL / CL 비율을 측정하기 위해 1 mL의 혈액 만 필요합니다. 이 분석은 간단하며 BTHS를 스크리닝하기 위해 임상 생화학 실험실의 일상적인 작업에 쉽게 통합 될 수 있습니다. 이 검사는 BTHS에 대한 100 % 민감도와 특이성을 보여 주므로 적합한 진단 테스트입니다.
Introduction
바르트 증후군 (BTHS)은 조기 발병 심근병증, 골격근 근병증, 성장 지연, 호중구 감소증, 가변 미토콘드리아 호흡 사슬 기능 장애 및 비정상적인 미토콘드리아 구조 1,2,3,4,5를 특징으로 하는 드문 X 연결 질환이다. BTHS는 현재 전 세계적으로 250 건 미만의 알려진 사례가있는 백만 명의 남성 당 한 건의 사례가 유병률을 보였지만 2,6 건의 과소 진단이 가능하다는 것은 널리 받아 들여지고 있습니다. BTHS는 염색체 Xq28.127,8에 국한된 타파진(TAFAZZIN) 유전자의 기능 상실 돌연변이로 인해 미토콘드리아 인지질 카디오리핀(CL)의 결핍된 리모델링을 야기하며, 이는 일반적으로 고도로 대칭적이고 불포화된 아실 조성물 9,10으로 이어지는 과정이다. CL은 미토콘드리아의 시그니처 지질로 간주되어 왔으며, 내막의 중요한 구성 요소이며 산화 인산화 (즉, 미토콘드리아 에너지 대사), 초복합체 형성, 단백질 수입 및 미토콘드리아 역학, 미토파지 및 아폽토시스에 관여합니다 11,12,13,14,15,16 . TAFAZZIN 기능 상실시, CL 리모델링이 실패하고 BTHS 환자의 미토콘드리아에서 특정 인지질 이상이 발생한다: 성숙한 CL 수준(CLm)은 감소하는 반면, 모노리소카디오리핀(MLCL) 및 변경된 CL 아실 조성물(즉, 미성숙 CL 종, CLi)의 증가된 수준이 발생한다. 이것은 MLCL / CL 비율17의 극적인 증가를 가져옵니다.
BTHS의 진단은 장애가 매우 다양한 임상 및 생화학 적 특징을 나타내며 동일한 가족의 영향을받는 개인과 시간 3,5에 따른 환자 내에서 다를 수 있기 때문에 종종 어렵습니다. 많은 BTHS 소년들은 3-메틸글루타콘산(3-MGCA)의 매우 높은 수준의 요로 배설을 보이지만, 소변 수치는 정상이거나 시간이 지남에 따라 환자에서 경미하게 증가할 수 있습니다3. 그러나, 증가된 3-MGCA는 다양한 다른 미토콘드리아 및 비-미토콘드리아 장애, 예컨대 3-메틸글루타코닐-CoA 히드라타제 결핍 (AUH 결함), 3-메틸글루타콘산뇨증, 근긴장 이상-난청, 뇌병증, 레이-유사 (MEGDEL) 증후군, 코스테프 증후군, 및 실조실조증 (DCMA) 증후군을 갖는 확장 심근병증18,19의 특징이다. . 따라서, BTHS에 대한 마커로서 3-MCGA의 불량한 특이성과 환자의 엄청난 가변성은 생화학적 진단을 모호하게 만든다.
더욱이, 120개 이상의 상이한 TAFAZZIN 돌연변이가 장애5 를 야기하는 것으로 기술되었으며, 따라서, 유전자 진단은 복잡하고, 느리고, 비용이 많이 들 수 있다. 더욱이, TAFAZZIN 유전자의 분자 분석은 비코딩 또는 조절 서열3에서 돌연변이의 존재하에 위음성 결과를 초래할 수 있다. BTHS는 (monolyso-)CL 종의 상대적 양 및 분포를 결정함으로써 명확하게 시험될 수 있고, TAFAZZIN 유전자 시퀀싱에 의해 확인되거나 또는 그 반대의 경우도 마찬가지이다.
진단을위한 실용적인 테스트는 혈액 반점20,21에서 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 및 전기 스프레이 이온화 / 질량 분광법 (ESI / MS) 분석에 의한 MLCL / CL 비율의 측정입니다. CL 수준만 측정하는 것은 일부 환자가 CL 수치가 거의 정상에 가깝지만 MLCL/CL 비율이 변경되었기 때문에 진단에 적합하지 않습니다. 따라서, MLCL/CL 비율의 측정은 BTHS 진단(21)에 대한 100% 민감도 및 특이성을 갖는다. HPLC 및 ESI/MS 분석에 기초한 또 다른 검증된 방법이 백혈구22에 설정되었지만, 이전에 추출된 지질을 분리하기 위한 복잡한 크로마토그래피 기술과 장비의 고가성으로 인해 이 분석이 몇몇 임상 실험실로 제한된다. 이러한 모든 요인은 간단한 진단 검사의 부족과 함께 상태의 과소 진단에 기여했습니다.
MALDI-TOF/MS는 지질 분석23,24에서 더 유효한 도구입니다. 이러한 분석 기술은 다양한 생물학적 샘플의 지질 프로파일을 직접 획득하는데 사용될 수 있으며, 따라서 MS 이미징 응용(30)을 위한 조직 절편을 포함하여 추출 및 분리 단계(25,26,27,28,29)를 건너뜁니다. 이러한 이점을 감안할 때, MALDI-TOF/MS를 사용하여 손상되지 않은 백혈구에서 미토콘드리아 CL을 프로파일링하여 BTHS를 진단하는 간단하고 빠른 방법이 개발되었습니다28. 적혈구 침강 및 용해에 의한 전혈 1mL의 백혈구로부터 백혈구 분리는 간단하며 특별한 장비나 시약이 필요하지 않습니다. 더욱이, 미량의 백혈구에 적용 가능한 빠른 지질 “미니-추출” 프로토콜이 무손상 백혈구(28)로부터 수득된 것보다 더 높은 신호-대-잡음비(S/N)를 갖는 더 깨끗한 MS 신호를 갖는 스펙트럼의 성공적인 획득을 보증하기 위해 기술되었다. 이 추가 단계는 시간이 거의 걸리지 않으며 감도가 낮은 MS 장비에서 수행 된 경우에도 분석을 재현 할 수 있습니다. 요약하면, 여기에 설명 된 분석 방법은 시간이 많이 걸리고 노동 집약적 인 크로마토그래피 지질 분리를 건너 뛸 수 있기 때문에 최소한의 샘플 준비가 필요하므로 테스트 속도가 빨라집니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
바르트 증후군은 신진 대사의 선천적 인 오류이며 과소 진단 될 가능성이있는 삶을 변화시키는 상태입니다 2,6. 앞서 언급했듯이, 기여 요인은 간단한 진단 테스트의 부족 일 수 있습니다. 여기에서는 BTHS 스크리닝을 위해 백혈구에서 MALDI-TOF/MS에 의한 MLCL/CL 비율을 측정하는 간단하고 빠른 방법이 설명되었다. 또한, MALDI-TOF 질량 분광계는 전 세계 임?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 우리의 연구에 참여한 BTHS와 그 가족들에게 감사드립니다. 우리는 Barth Syndrome Foundation U와 Barth Syndrome UK Trust가 브리스톨에서 열린 연례 회의에서 혈액 샘플 수집을 지원하고 도움을 주신 것에 감사드립니다. 이 연구는 Barth Syndrome Foundation US, Barth Italia Onlus 및 Apulia Region이 자금을 지원했습니다.
Materials
| 1,1′,2,2′-tetratetradecanoyl cardiolipin | Avanti Polar Lipids | 750332 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
| 1,1′2,2′-tetra- (9Z-octadecenoyl) cardiolipin | Avanti Polar Lipids | 710335 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
| 1,2-di- (9Z-hexadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar Lipids | 878130 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
| 1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phosphate | Avanti Polar Lipids | 830845 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
| 1,2-ditetradecanoyl-snglycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol) | Avanti Polar Lipids | 840445 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
| 1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine | Avanti Polar Lipids | 840033 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
| 2-Propanol, ACS reagent, ≥99.5% | Merck Life Science S.r.l. | 190764 | |
| 9-Aminoacridine hemihydrate, 98% | Acros Organics | 134410010 | |
| Acetonitrile, ACS reagent, ≥99.5% | Merck Life Science S.r.l. | 360457 | |
| Chloroform, ACS reagent, ≥99.8% | Merck Life Science S.r.l. | 319988 | |
| Dextran from Leuconostoc spp. Mr 450,000-650,000 | Merck Life Science S.r.l. | 31392 | |
| Flex Analysis 3.3 | Bruker Daltonics | Software | |
| MALDI-TOF mass spectrometer Microflex LRF | Bruker Daltonics | ||
| Microsoft Excel | Microsoft Office | Software | |
| OmniPur 10X PBS Liquid Concentrate | Merck Life Science S.r.l. | 6505-OP | |
| Potassium chloride, ACS reagent, 99.0-100.5% | Merck Life Science S.r.l. | P3911 | |
| Sodium chloride, ACS reagent, ≥99.0% | Merck Life Science S.r.l. | S9888 |
Referências
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