Isolatie van intrapulmonale slagader en gladde spiercellen om vasculaire reacties te onderzoeken
Summary
Vasculaire reacties van arteriële pulmonale circulatie kunnen worden onderzocht met behulp van intrapulmonale slagader (IPA) en vasculaire gladde spiercellen (VSMC’s). De huidige studie beschrijft de isolatie van IPA in detail en de protocollen die worden gebruikt voor het onderzoeken van vasorelaxatie als reactie op fysiologische stimuli.
Abstract
De intrapulmonale slagader (IPA) en vasculaire gladde spiercellen (VSMC’s) geïsoleerd uit rattenlongen kunnen worden gebruikt om de onderliggende mechanismen van vasoconstrictie en vasorelaxatie te bestuderen. Na het isoleren van de IPA en VSMC’s kunnen de kenmerken van vasculaire reacties in fysiologische en pathologische omstandigheden worden beoordeeld in afwezigheid van extrinsieke factoren zoals zenuwsignalen, hormonen, cytokines, enz. De IPA en VSMC’s dienen dus als uitstekende modellen voor het bestuderen van vasculaire fysiologie / pathofysiologie, samen met verschillende experimentele onderzoeken, zoals modulatie door farmacologische middelen, patch-clamp elektrofysiologische analyse, calciumbeeldvorming, enz. Hier hebben we een techniek gebruikt voor het isoleren van de IPA om vasculaire reacties in een orgaanbadopstelling te onderzoeken. IPA-segmenten werden via intraluminale draden op de orgelbadkamer gemonteerd en gestimuleerd door verschillende farmacologische middelen. De veranderingen in de IPA vasculaire tonus (d.w.z. vasoconstrictie en vasorelaxatie) werden geregistreerd met behulp van een isometrische krachttransducer en fysiologische data-analysesoftwareprogramma. We hebben verschillende experimentele protocollen geïmplementeerd, die kunnen worden aangepast om de mechanismen van vasorelaxatie / vasoconstrictie te onderzoeken voor het bestuderen van de farmacologische activiteiten van fytochemische of synthetische geneesmiddelen. De protocollen kunnen ook worden gebruikt om de rol van geneesmiddelen bij het moduleren van verschillende ziekten, waaronder pulmonale arteriële hypertensie, te evalueren. Het IPA-model stelt ons in staat om de concentratie-responscurve te onderzoeken, die cruciaal is bij het beoordelen van de farmacodynamische parameters van geneesmiddelen.
Introduction
De pulmonale vasculatuur is een vasculair systeem onder lage druk waarbij de belangrijkste functie is om zuurstofarm bloed af te leveren aan het gasuitwisselingsgebied van de longen. De longslagaders in de longen zijn gerangschikt in takken parallel aan de bronchiale boom, waardoor uiteindelijk een uitgebreid netwerk van haarvaten wordt gevormd dat continu is over verschillende longblaasjes en uiteindelijk samenkomt in venules en aderen. De vasculaire tonus van de longslagader wordt gecontroleerd door verschillende factoren, waarbij de interactie tussen het endotheel en vasculaire gladde spiercellen (VSMC’s)1 betrokken is.
In deze studie richten we ons op de endotheelafhankelijke en -onafhankelijke vasorelaxatie van de intrapulmonale slagader (IPA). Met betrekking tot de endotheelafhankelijke vasorelaxatie kunnen verschillende mechanismen die optreden op het oppervlak van endotheelcellen de intracellulaire Ca2+ concentratie verhogen (bijv. acetylcholine [ACh] bindt met muscarinereceptor [M3]), wat leidt tot de vorming van stikstofmonoxide (NO), prostacycline (PGl2) en van endotheel afgeleide hyperpolarisatiefactor (EDHF) (figuur 1 ). NO is de belangrijkste van endotheel afgeleide ontspannende factor gesynthetiseerd uit L-arginine door endotheel stikstofmonoxidesynthase (eNOS)2, die vervolgens uit de endotheelcellen dissocieert naar VSMC’s (figuur 1) en het oplosbare guanylcyclase (sGC) enzym stimuleert; dit enzym verandert guanosinetrifosfaat (GTP) in cyclisch guanosinemonofosfaat (cGMP), dat eiwitkinase G (PKG) activeert en cytosolische Ca2+ niveaus verlaagt, waardoor vasorelaxatie ontstaat (figuur 1). PGl2 wordt gesynthetiseerd door endotheelcellen via de cyclo-oxygenase (COX) route 3,4. Het bindt met de prostacyclinereceptor (IP) op VSMC’s en stimuleert het adenylcyclase (AC) enzym, dat vervolgens adenosinetrifosfaat (ATP) omzet in cyclisch adenosinemonofosfaat (cAMP) (figuur 1)3,4. cAMP activeert eiwitkinase A (PKA), waardoor cytosolische Ca2+ niveaus worden verlaagd en vasorelaxatie5 wordt veroorzaakt (figuur 1). De EDHF-route neemt ook deel aan endotheelafhankelijke vasorelaxatie via verschillende endotheelmediatoren en elektrische gebeurtenissen. De activering van de EDHF-route leidt tot de hyperpolarisatie van VSMC’s, waardoor spanningsgestuurde Ca2+ kanalen (VOCCs) worden gesloten, intracellulaire Ca2+ niveaus worden verlaagd en vasorelaxatie6 wordt geïnduceerd. De endotheelonafhankelijke vasorelaxatie vindt direct op VSMC’s plaats via verschillende mechanismen, zoals de verlaging van het intracellulaire Ca2+ niveau, de remming van myosine light chain kinase (MLCK), de activering van myosine light chain phosphatase (MLCP) en de vermindering van Ca2+ gevoeligheid voor de contractiele machinerie van VSMC’s. In deze studie richten we ons op de vasorelaxatie veroorzaakt door het openen van verschillende K + -kanalen, de blokkade van VOCC’s en de remming van Ca2 + -afgifte van het sarcoplasmatisch reticulum7, wat leidt tot de vermindering van intracellulaire Ca2 + -niveaus, waardoor VSMC-myosine lichte ketenfosforylering en myosine-actinebinding of dwarsbrugvorming respectievelijk afnemen, uiteindelijk resulterend in vasorelaxatie.
De techniek voor het evalueren van vasoconstrictie- en vasorelaxatiemetingen in geïsoleerde IPA is goed ingeburgerd voor knaagdieren, maar de gegevens varieerden afhankelijk van de experimentele protocollen. De huidige studie beschrijft de methode die wordt gebruikt om de vasculaire reactiviteit van IPA-preparaten van ratten in vitro te evalueren, die werden gemaakt in afwezigheid van externe factoren die de vasculaire respons in vivo moduleren, zoals zenuwsignalen, hormonen, cytokines, bloeddruk, enz.
We gebruikten verschillende experimentele protocollen met het plantenextract als voorbeeld voor het bestuderen van de vasculaire reactiviteit van IPA. Verschillende blokkers (figuur 1) werden gebruikt om de mechanismen van endotheelafhankelijke en -onafhankelijke vasorelaxatie geïnduceerd door het plantenextract te identificeren. Niettemin kunnen dezelfde protocollen worden aangepast om de vasculaire reacties van IPA op geneesmiddelen, extracten of fytochemicaliën te evalueren die worden gebruikt voor de behandeling van verschillende pulmonale pathologieën.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit manuscript beschrijven we de techniek voor de isolatie van ratten IPA en VSMC’s. Verschillende experimentele protocollen zijn gebruikt om de vasculaire respons van IPA in vitro te onderzoeken, die kan worden gebruikt om het farmacologische effect en de mechanistische basis van IPA-vasorelaxatie geïnduceerd door plantenextract te karakteriseren.
Met betrekking tot de endotheelafhankelijke vaatverwijdende werking van het plantenextract werden verschillende blokkers zoals L-NAME …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag de National Research Council of Thailand, het Center of Excellence for Innovation in Chemistry (PERCH-CIC) en het International Research Network (IRN61W0005) erkennen voor het verlenen van financiële steun, en de afdeling Fysiologie Faculteit medische Wetenschappen, Naresuan University, voor ondersteuning van onderzoeksfaciliteiten.
Materials
| 1,4-dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632 CAS NO. 348-12-3 |
|
| 4-aminopyridine (4-AP) | Aldrich Chemical | A78403 CAS NO. 504-24-5 |
|
| Acetylcholine | Sigma-Aldrich | A6625 CAS NO. 60-31-1 |
|
| Apamin | Sigma-Aldrich | A9459 CAS NO. 24345-16-2 |
|
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 CAS NO. 9048-46-8 |
|
| Calcium choride | Ajax Finechem | AJA960 CAS NO. 1707055184 |
|
| Charybdotoxin | Sigma-Aldrich | C7802 CAS NO. 95751-30-7 |
|
| Collagenase type 1A | Sigma-Aldrich | C9891 CAS NO. 9001-12-1 |
From Clostridium histolyticum |
| D(+)-Glucose monohydrate | Millipore Corporation | K50876942 924 CAS NO. 14431-43-7 |
|
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 CAS NO. 67-68-5 |
|
| Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 CAS NO. 67-42-5 |
|
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 CAS NO. 60-00-4 |
|
| Forceps 11 cm. | Rustless Dumoxel | – | |
| Forceps 14 cm. | Rustless Dumoxel | – | |
| Glibenclamide | Sigma-Aldrich | G6039 CAS NO. 16673-34-0 |
|
| GraphPad Prism program | Software version 5.0 (San Diego, CA, USA) | ||
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 CAS NO. 7365-45-9 |
|
| Iberiotoxin | Sigma-Aldrich | I5904 CAS NO. 1002546960 |
recombinant from Mesobuthus tamulus |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 CAS NO. 53-86-1 |
|
| Labchart Program | Software version 7.0 (A.D. Instrument, Castle Hill, Australia). | ||
| Magnesium chloride | Ajax Finechem | 296 CAS NO. 1506254995 |
|
| Male Wistar rats | Nomura Siam International Co. Ltd., Bangkok, Thailand | ||
| NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) | Sigma-Aldrich | N5751 CAS NO. 51298-62-5 |
|
| Nicardipine | Sigma-Aldrich | N7510 CAS NO. 54527-84-3 |
|
| Organ bath 15 mL. | – | – | Specific order by the researchers |
| Papain | Sigma-Aldrich | P4762 CAS NO. 9001-73-4 |
FromPapaya Latex |
| Phenal red | Sigma-Aldrich | P5530 CAS NO. 34487-61-1 |
|
| Phenylephrine | Sigma-Aldrich | P6126 CAS NO. 61-76-7 |
|
| Potassium chloride | Kemaus | KA383 CAS NO. 7447-40-7 |
|
| Potassium dihydrogenphosphate | Aldrich Chemical | EC231-913-4 CAS NO. 7778-77-0 |
|
| S+A2:E36odium chloride | Kemaus | KA465 CAS NO. 7647-14-5 |
|
| Scissors 11 cm. | Spall Stainless | – | |
| Scissors 14 cm. | Spall Stainless | – | |
| Sodium bicarbonate | Ajax Finechem | 475 CAS NO. 912466 |
|
| Sodium dihydrogenphosphate | Aldrich Chemical | 33,198-8 CAS NO. 7558-80-7 |
|
| Sodium hydroxide | Ajax Finechem | 482 CAS NO. 1506196602 |
|
| Sodium thiopental | Anesthal | JPN3010002 CAS NO. 1C 314/47 |
|
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 CAS NO. 107-35-7 |
|
| Waterbath WBU 45 | Memmert | 2766 CAS NO. – |
References
- Lyle, M. A., Davis, J. P., Brozovich, F. V. Regulation of pulmonary vascular smooth muscle contractility in pulmonary arterial hypertension: Implications for therapy. Frontiers in Physiology. 8, 614 (2017).
- Cyr, A. R., Huckaby, L. V., Shiva, S. S., Zuckerbraun, B. S. Nitric oxide and endothelial dysfunction. Critical Care Clinics. 36 (2), 307-321 (2020).
- Ruan, K. -. H. Advance in understanding the biosynthesis of prostacyclin and thromboxane A2 in the endoplasmic reticulum membrane via the cyclo-oxygenase pathway. Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 4 (6), 639-647 (2004).
- Del Pozo, R., Hernandez Gonzalez, I., Escribano-Subias, P. The prostacyclin pathway in pulmonary arterial hypertension: A clinical review. Expert Review of Respiratory Medicine. 11 (6), 491-503 (2017).
- Morgado, M., Cairrão, E., Santos-Silva, A. J., Verde, I. Cyclic nucleotide-dependent relaxation pathways in vascular smooth muscle. Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (2), 247-266 (2012).
- Schmidt, K., de Wit, C. Endothelium-derived hyperpolarizing factor and myoendothelial coupling: The in vivo perspective. Frontiers in Physiology. 11, (2020).
- Fan, G., Cui, Y., Gollasch, M., Kassmann, M. Elementary calcium signaling in arterial smooth muscle. Channels. 13 (1), 505-519 (2019).
- Wisutthathum, S., et al. Extract of Aquilaria crassna leaves and mangiferin are vasodilators while showing no cytotoxicity. Journal of Traditional and Complementary Medicine. 9 (4), 237-242 (2019).
- Kamkaew, N., Paracha, T. U., Ingkaninan, K., Waranuch, N., Chootip, K. Vasodilatory effects and mechanisms of action of Bacopa monnieri active compounds on rat mesenteric arteries. Molecules. 24 (12), 2243 (2019).
- Chootip, K., Kennedy, C., Gurney, A. Characterization of P2 receptors mediating contraction of the rat isolated pulmonary vasculature. British Journal of Pharmacology. 131, 167 (2000).
- Paracha, T. U., et al. Elucidation of vasodilation response and structure activity relationships of N2, N4-disubstituted quinazoline 2, 4-diamines in a rat pulmonary artery model. Molecules. 24 (2), 281 (2019).
- Chootip, K., Gurney, A. M., Kennedy, C. Multiple P2Y receptors couple to calcium-dependent, chloride channels in smooth muscle cells of the rat pulmonary artery. Respiratory Research. 6 (1), 1-10 (2005).
- Wisutthathum, S., et al. Eulophia macrobulbon extract relaxes rat isolated pulmonary artery and protects against monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension. Phytomedicine. 50, 157-165 (2018).
- Kruangtip, O., et al. Curcumin analogues inhibit phosphodiesterase-5 and dilate rat pulmonary arteries. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (1), 87-95 (2015).
