عزل الشريان الرئوي وخلايا العضلات الملساء للتحقيق في استجابات الأوعية الدموية
Summary
يمكن استكشاف الاستجابات الوعائية للدورة الدموية الرئوية الشريانية باستخدام الشريان الرئوي (IPA) وخلايا العضلات الملساء الوعائية (VSMCs). تصف هذه الدراسة عزل IPA بالتفصيل والبروتوكولات المستخدمة للتحقيق في استرخاء الأوعية استجابة للمحفزات الفسيولوجية.
Abstract
يمكن استخدام الشريان الرئوي (IPA) وخلايا العضلات الملساء الوعائية (VSMCs) المعزولة من رئتي الفئران لدراسة الآليات الأساسية لتضيق الأوعية واسترخاء الأوعية. بعد عزل IPA و VSMCs ، يمكن تقييم خصائص الاستجابات الوعائية في الحالات الفسيولوجية والمرضية في غياب العوامل الخارجية مثل الإشارات العصبية والهرمونات والسيتوكينات ، إلخ. وبالتالي ، فإن IPA و VSMCs بمثابة نماذج ممتازة لدراسة فسيولوجيا الأوعية الدموية / الفيزيولوجيا المرضية ، إلى جانب العديد من التحقيقات التجريبية ، مثل التعديل بواسطة العوامل الدوائية ، والتحليل الكهروفسيولوجي المشبك الرقعة ، وتصوير الكالسيوم ، وما إلى ذلك. هنا ، استخدمنا تقنية لعزل IPA للتحقيق في استجابات الأوعية الدموية في إعداد حمام الأعضاء. تم تركيب أجزاء IPA على غرفة حمام الأعضاء عبر أسلاك داخل اللمعان وتحفيزها بواسطة عوامل دوائية مختلفة. تم تسجيل التغيرات في نغمة الأوعية الدموية IPA (أي تضيق الأوعية واسترخاء الأوعية) ، باستخدام محول طاقة متساوي القياس وبرنامج تحليل البيانات الفسيولوجية. قمنا بتنفيذ العديد من البروتوكولات التجريبية ، والتي يمكن تكييفها للتحقيق في آليات استرخاء الأوعية / تضيق الأوعية لدراسة الأنشطة الدوائية للعقاقير الكيميائية النباتية أو الاصطناعية. ويمكن أيضا استخدام البروتوكولات لتقييم أدوار الأدوية في تعديل الأمراض المختلفة، بما في ذلك ارتفاع ضغط الدم الشرياني الرئوي. يسمح لنا نموذج IPA بالتحقيق في منحنى التركيز والاستجابة ، وهو أمر بالغ الأهمية في تقييم المعلمات الدوائية الديناميكية للأدوية.
Introduction
الأوعية الدموية الرئوية هي نظام وعائي منخفض الضغط تتمثل وظيفته الرئيسية في توصيل الدم غير المؤكسج إلى منطقة تبادل الغاز في الرئتين. يتم ترتيب الشرايين الرئوية في الرئتين في فروع موازية لشجرة الشعب الهوائية ، مما يشكل في النهاية شبكة واسعة من الشعيرات الدموية المستمرة على عدة حويصلات هوائية ، وأخيرا ، تجتمع معا في الأوردة والأوردة. يتم التحكم في نغمة الأوعية الدموية للشريان الرئوي من خلال عدة عوامل، بما في ذلك التفاعل بين البطانة وخلايا العضلات الملساء الوعائية (VSMCs)1.
في هذه الدراسة ، نركز على الاسترخاء الوعائي المعتمد على البطانة والمستقلة للشريان داخل الرئة (IPA). فيما يتعلق باسترخاء الأوعية المعتمد على البطانة، يمكن للآليات المختلفة التي تحدث على سطح الخلايا البطانية أن تزيد من تركيز Ca2+ داخل الخلايا (على سبيل المثال، يرتبط الأسيتيل كولين [ACh] بمستقبلات المسكارينية [M3])، مما يؤدي إلى تكوين أكسيد النيتريك (NO) والبروستاسيكلين (PGl2) وعامل فرط الاستقطاب المشتق من البطانة (EDHF) (الشكل 1) ). NO هو عامل الاسترخاء الرئيسي المشتق من البطانة والذي يتم تصنيعه من L-arginine بواسطة سينثاز أكسيد النيتريك البطاني (eNOS)2 ، والذي ينفصل بعد ذلك عن الخلايا البطانية إلى VSMCs (الشكل 1) ويحفز إنزيم guanylyl cyclase (sGC) القابل للذوبان ؛ يغير هذا الإنزيم الجوانوزين ثلاثي الفوسفات (GTP) إلى أحادي فوسفات غوانوزين دوري (cGMP) ، مما ينشط بروتين كيناز G (PKG) ويقلل من مستويات Ca2+ الخلوية ، مما يسبب استرخاء الأوعية (الشكل 1). يتم تصنيع PGl2 بواسطة الخلايا البطانية عبر مسار سيكلو-أوكسيجيناز (COX) 3,4. يرتبط بمستقبلات البروستاسيكلين (IP) على VSMCs ويحفز إنزيم أدينيل سيكلاز (AC) ، الذي يحول بعد ذلك الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) إلى أحادي فوسفات الأدينوسين الدوري (cAMP) (الشكل 1) 3,4. ينشط cAMP بروتين كيناز A (PKA) ، مما يقلل من مستويات Ca2+ الخلوية ويسبب استرخاء الأوعية5 (الشكل 1). يشارك مسار EDHF أيضا في استرخاء الأوعية المعتمد على البطانة من خلال العديد من الوسطاء البطانيين والأحداث الكهربائية. يؤدي تنشيط مسار EDHF إلى فرط استقطاب VSMCs ، وبالتالي إغلاق قنوات Ca 2 + التي تعمل بالجهد (VOCCs) ، وتقليل مستويات Ca2 + داخل الخلايا ، وتحفيز استرخاء الأوعية6. يحدث استرخاء الأوعية المستقل عن البطانة مباشرة على VSMCs عبر عدة آليات ، مثل تقليل مستوى Ca 2 + داخل الخلايا ، وتثبيط كيناز سلسلة ضوء الميوسين (MLCK) ، وتنشيط فوسفاتيز سلسلة ضوء الميوسين (MLCP) ، والحد من حساسية Ca2 + للآلات الانقباضية ل VSMCs. في هذه الدراسة ، نركز على استرخاء الأوعية الناجم عن فتح قنوات K + المختلفة ، وحصار المركبات العضوية المتطايرة ، وتثبيط إطلاق Ca 2 + من الشبكة الساركوبلازمية7 ، مما يؤدي إلى تقليل مستويات Ca 2 + داخل الخلايا ، وبالتالي تقليل فسفرة سلسلة ضوء VSMC myosin وربط الميوسين أكتين أو تكوين عبر الجسور ، على التوالي ، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى استرخاء الأوعية.
إن تقنية تقييم قياسات تضيق الأوعية واسترخاء الأوعية في IPA المعزولة راسخة جيدا للقوارض ، لكن البيانات تختلف اعتمادا على البروتوكولات التجريبية. تصف هذه الدراسة الطريقة المستخدمة لتقييم التفاعلات الوعائية لمستحضرات IPA للفئران في المختبر ، والتي تم إجراؤها في غياب عوامل خارجية تعدل استجابة الأوعية الدموية في الجسم الحي ، مثل الإشارات العصبية والهرمونات والسيتوكينات وضغط الدم ، إلخ.
استخدمنا العديد من البروتوكولات التجريبية باستخدام المستخلص النباتي كمثال لدراسة التفاعلات الوعائية ل IPA. تم استخدام حاصرات مختلفة (الشكل 1) لتحديد آليات استرخاء الأوعية المعتمد على البطانة والمستقلة التي يسببها المستخلص النباتي. ومع ذلك ، يمكن تكييف نفس البروتوكولات لتقييم استجابات الأوعية الدموية ل IPA لأي أدوية أو مستخلصات أو مواد كيميائية نباتية تستخدم لعلاج الأمراض الرئوية المختلفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه المخطوطة ، نصف تقنية عزل IPA و VSMCs الفئران. تم استخدام العديد من البروتوكولات التجريبية للتحقيق في الاستجابة الوعائية ل IPA في المختبر ، والتي يمكن استخدامها لتوصيف التأثير الدوائي والأساس الميكانيكي ل IPA للأوعية الدموية الناجم عن المستخلصات النباتية.
فيما يتعلق ب?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن ينحبوا بالمجلس الوطني للبحوث في تايلاند ، ومركز التميز للابتكار في الكيمياء (PERCH-CIC) ، وشبكة البحوث الدولية (IRN61W0005) لتقديمهم الدعم المالي ، وقسم علم وظائف الأعضاء كلية العلوم الطبية ، جامعة ناريسوان ، لدعم مرفق البحوث.
Materials
| 1,4-dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632 CAS NO. 348-12-3 |
|
| 4-aminopyridine (4-AP) | Aldrich Chemical | A78403 CAS NO. 504-24-5 |
|
| Acetylcholine | Sigma-Aldrich | A6625 CAS NO. 60-31-1 |
|
| Apamin | Sigma-Aldrich | A9459 CAS NO. 24345-16-2 |
|
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 CAS NO. 9048-46-8 |
|
| Calcium choride | Ajax Finechem | AJA960 CAS NO. 1707055184 |
|
| Charybdotoxin | Sigma-Aldrich | C7802 CAS NO. 95751-30-7 |
|
| Collagenase type 1A | Sigma-Aldrich | C9891 CAS NO. 9001-12-1 |
From Clostridium histolyticum |
| D(+)-Glucose monohydrate | Millipore Corporation | K50876942 924 CAS NO. 14431-43-7 |
|
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 CAS NO. 67-68-5 |
|
| Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 CAS NO. 67-42-5 |
|
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 CAS NO. 60-00-4 |
|
| Forceps 11 cm. | Rustless Dumoxel | – | |
| Forceps 14 cm. | Rustless Dumoxel | – | |
| Glibenclamide | Sigma-Aldrich | G6039 CAS NO. 16673-34-0 |
|
| GraphPad Prism program | Software version 5.0 (San Diego, CA, USA) | ||
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 CAS NO. 7365-45-9 |
|
| Iberiotoxin | Sigma-Aldrich | I5904 CAS NO. 1002546960 |
recombinant from Mesobuthus tamulus |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 CAS NO. 53-86-1 |
|
| Labchart Program | Software version 7.0 (A.D. Instrument, Castle Hill, Australia). | ||
| Magnesium chloride | Ajax Finechem | 296 CAS NO. 1506254995 |
|
| Male Wistar rats | Nomura Siam International Co. Ltd., Bangkok, Thailand | ||
| NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) | Sigma-Aldrich | N5751 CAS NO. 51298-62-5 |
|
| Nicardipine | Sigma-Aldrich | N7510 CAS NO. 54527-84-3 |
|
| Organ bath 15 mL. | – | – | Specific order by the researchers |
| Papain | Sigma-Aldrich | P4762 CAS NO. 9001-73-4 |
FromPapaya Latex |
| Phenal red | Sigma-Aldrich | P5530 CAS NO. 34487-61-1 |
|
| Phenylephrine | Sigma-Aldrich | P6126 CAS NO. 61-76-7 |
|
| Potassium chloride | Kemaus | KA383 CAS NO. 7447-40-7 |
|
| Potassium dihydrogenphosphate | Aldrich Chemical | EC231-913-4 CAS NO. 7778-77-0 |
|
| S+A2:E36odium chloride | Kemaus | KA465 CAS NO. 7647-14-5 |
|
| Scissors 11 cm. | Spall Stainless | – | |
| Scissors 14 cm. | Spall Stainless | – | |
| Sodium bicarbonate | Ajax Finechem | 475 CAS NO. 912466 |
|
| Sodium dihydrogenphosphate | Aldrich Chemical | 33,198-8 CAS NO. 7558-80-7 |
|
| Sodium hydroxide | Ajax Finechem | 482 CAS NO. 1506196602 |
|
| Sodium thiopental | Anesthal | JPN3010002 CAS NO. 1C 314/47 |
|
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 CAS NO. 107-35-7 |
|
| Waterbath WBU 45 | Memmert | 2766 CAS NO. – |
References
- Lyle, M. A., Davis, J. P., Brozovich, F. V. Regulation of pulmonary vascular smooth muscle contractility in pulmonary arterial hypertension: Implications for therapy. Frontiers in Physiology. 8, 614 (2017).
- Cyr, A. R., Huckaby, L. V., Shiva, S. S., Zuckerbraun, B. S. Nitric oxide and endothelial dysfunction. Critical Care Clinics. 36 (2), 307-321 (2020).
- Ruan, K. -. H. Advance in understanding the biosynthesis of prostacyclin and thromboxane A2 in the endoplasmic reticulum membrane via the cyclo-oxygenase pathway. Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 4 (6), 639-647 (2004).
- Del Pozo, R., Hernandez Gonzalez, I., Escribano-Subias, P. The prostacyclin pathway in pulmonary arterial hypertension: A clinical review. Expert Review of Respiratory Medicine. 11 (6), 491-503 (2017).
- Morgado, M., Cairrão, E., Santos-Silva, A. J., Verde, I. Cyclic nucleotide-dependent relaxation pathways in vascular smooth muscle. Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (2), 247-266 (2012).
- Schmidt, K., de Wit, C. Endothelium-derived hyperpolarizing factor and myoendothelial coupling: The in vivo perspective. Frontiers in Physiology. 11, (2020).
- Fan, G., Cui, Y., Gollasch, M., Kassmann, M. Elementary calcium signaling in arterial smooth muscle. Channels. 13 (1), 505-519 (2019).
- Wisutthathum, S., et al. Extract of Aquilaria crassna leaves and mangiferin are vasodilators while showing no cytotoxicity. Journal of Traditional and Complementary Medicine. 9 (4), 237-242 (2019).
- Kamkaew, N., Paracha, T. U., Ingkaninan, K., Waranuch, N., Chootip, K. Vasodilatory effects and mechanisms of action of Bacopa monnieri active compounds on rat mesenteric arteries. Molecules. 24 (12), 2243 (2019).
- Chootip, K., Kennedy, C., Gurney, A. Characterization of P2 receptors mediating contraction of the rat isolated pulmonary vasculature. British Journal of Pharmacology. 131, 167 (2000).
- Paracha, T. U., et al. Elucidation of vasodilation response and structure activity relationships of N2, N4-disubstituted quinazoline 2, 4-diamines in a rat pulmonary artery model. Molecules. 24 (2), 281 (2019).
- Chootip, K., Gurney, A. M., Kennedy, C. Multiple P2Y receptors couple to calcium-dependent, chloride channels in smooth muscle cells of the rat pulmonary artery. Respiratory Research. 6 (1), 1-10 (2005).
- Wisutthathum, S., et al. Eulophia macrobulbon extract relaxes rat isolated pulmonary artery and protects against monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension. Phytomedicine. 50, 157-165 (2018).
- Kruangtip, O., et al. Curcumin analogues inhibit phosphodiesterase-5 and dilate rat pulmonary arteries. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (1), 87-95 (2015).
