Vasküler Yanıtları Araştırmak için İntrapulmoner Arter ve Düz Kas Hücrelerinin İzolasyonu
Summary
Arteriyel pulmoner dolaşımın vasküler yanıtları intrapulmoner arter (IPA) ve vasküler düz kas hücreleri (VSMC’ler) kullanılarak araştırılabilir. Bu çalışmada IPA’nın izolasyonu ayrıntılı olarak ve fizyolojik uyaranlara yanıt olarak vazogevşemenin araştırılmasında kullanılan protokoller açıklanmaktadır.
Abstract
Sıçan akciğerlerinden izole edilen intrapulmoner arter (IPA) ve vasküler düz kas hücreleri (VSMC’ler), vazokonstriksiyon ve vazogevşemenin altında yatan mekanizmaları incelemek için kullanılabilir. IPA ve VSMC’ler izole edildikten sonra, fizyolojik ve patolojik durumlarda vasküler yanıtların özellikleri, sinir sinyalleri, hormonlar, sitokinler vb. gibi dışsal faktörlerin yokluğunda değerlendirilebilir. Bu nedenle, IPA ve VSMC’ler, farmakolojik ajanlarla modülasyon, yama-kelepçeli elektrofizyolojik analiz, kalsiyum görüntüleme gibi çeşitli deneysel araştırmalarla birlikte vasküler fizyoloji / patofizyolojiyi incelemek için mükemmel modeller olarak hizmet eder. Burada, bir organ banyosu kurulumunda vasküler yanıtları araştırmak için IPA’yı izole etmek için bir teknik kullandık. IPA segmentleri intraluminal teller vasıtasıyla organ banyosu odasına monte edildi ve çeşitli farmakolojik ajanlarla uyarıldı. IPA vasküler tonusundaki değişiklikler (yani vazokonstriksiyon ve vazogevşeme), izometrik kuvvet dönüştürücü ve fizyolojik veri analizi yazılım programı kullanılarak kaydedildi. Fitokimyasal veya sentetik ilaçların farmakolojik aktivitelerini incelemek için vazogevşeme / vazokonstriksiyon mekanizmalarını araştırmak için uyarlanabilen birkaç deneysel protokol uyguladık. Protokoller, pulmoner arteriyel hipertansiyon da dahil olmak üzere çeşitli hastalıkların modülasyonunda ilaçların rollerini değerlendirmek için de kullanılabilir. IPA modeli, ilaçların farmakodinamik parametrelerinin değerlendirilmesinde çok önemli olan konsantrasyon-yanıt eğrisini araştırmamıza izin verir.
Introduction
Pulmoner vaskülatür, ana fonksiyonun akciğerlerin gaz değişim alanına oksijensiz kan vermek olduğu düşük basınçlı bir vasküler sistemdir. Akciğerlerdeki pulmoner arterler, bronşiyal ağaca paralel dallar halinde düzenlenir, sonuçta birkaç alveol üzerinde sürekli olan ve son olarak venüller ve damarlar halinde bir araya gelen geniş bir kılcal damar ağı oluşturur. Pulmoner arterin vasküler tonusu, endotel ve vasküler düz kas hücreleri (VSMC’ler) arasındaki etkileşimi içeren çeşitli faktörler tarafından kontrol edilir1.
Bu çalışmada, intrapulmoner arterin (IPA) endotele bağımlı ve bağımsız vazogevşemesi üzerinde durulmuştur. Endotel bağımlı vazogevşeme ile ilgili olarak, endotel hücrelerinin yüzeyinde meydana gelen çeşitli mekanizmalar, hücre içi Ca 2+ konsantrasyonunu artırabilir (örneğin, muskarinik reseptör [M3] ile asetilkolin [ACh] bağlanır), nitrik oksit (NO), prostasiklin (PGl2) ve endotel kaynaklı hiperpolarize edici faktör (EDHF) oluşumuna yol açabilir (Şekil 1 ). NO, endotel nitrik oksit sentaz (eNOS)2 tarafından L-arginin’den sentezlenen ana endotel kaynaklı gevşetici faktördür, daha sonra endotel hücrelerinden VSMC’lere ayrışır (Şekil 1) ve çözünür guanilil siklaz (sGC) enzimini uyarır; Bu enzim guanosin trifosfatı (GTP) protein kinaz G’yi (PKG) aktive eden ve sitozolik Ca2+ seviyelerini azaltan ve böylece vazogevşemeye neden olan siklik guanozin monofosfata (cGMP) dönüştürür (Şekil 1). PGl2, endotel hücreleri tarafından siklo-oksijenaz (COX) yolu 3,4 üzerinden sentezlenir. VSMC’ler üzerindeki prostasiklin reseptörü (IP) ile bağlanır ve adenozin trifosfatı (ATP) siklik adenozin monofosfata (cAMP) dönüştüren adenilil siklaz (AC) enzimini uyarır (Şekil 1)3,4. cAMP, protein kinaz A’yı (PKA) aktive eder, sitozolik Ca2+ seviyelerini azaltır ve vazogevşemeye neden olur5 (Şekil 1). EDHF yolu ayrıca çeşitli endotel mediatörleri ve elektriksel olaylar yoluyla endotele bağımlı vazogevşemeye katılır. EDHF yolunun aktivasyonu, VSMC’lerin hiperpolarizasyonuna yol açar, böylece voltajla çalışan Ca 2 + kanallarını (VOCC’ler) kapatır, hücre içi Ca2 + seviyelerini azaltır ve vazogevşeme6’yı indükler. Endotelden bağımsız vazogevşeme, hücre içi Ca 2+ seviyesinin düşürülmesi, miyozin hafif zincir kinazının (MLCK) inhibisyonu, miyozin hafif zincirli fosfatazın (MLCP) aktivasyonu ve VSMC’lerin kontraktil makinelerine Ca2+ duyarlılığının azaltılması gibi çeşitli mekanizmalar yoluyla doğrudan VSMC’lerde meydana gelir. Bu çalışmada, çeşitli K+ kanallarının açılmasının neden olduğu vazogevşeme, VOCC’lerin blokajı ve sarkoplazmik retikulum7’den Ca 2+ salınımının inhibisyonuna odaklanıyoruz, bu da hücre içi Ca 2+ seviyelerinin azalmasına yol açan, böylece VSMC miyozin hafif zincir fosforilasyonunu ve miyoz-aktin bağlanmasını veya çapraz köprü oluşumunu azaltan, sonuçta vazogevşeme ile sonuçlanır.
İzole IPA’da vazokonstriksiyon ve vazogevşeme ölçümlerini değerlendirme tekniği kemirgenler için iyi kurulmuştur, ancak veriler deneysel protokollere bağlı olarak değişmiştir. Bu çalışmada, sinir sinyalleri, hormonlar, sitokinler, kan basıncı gibi in vivo vasküler yanıtı modüle eden dış faktörlerin yokluğunda yapılan sıçan IPA preparatlarının in vitro vasküler reaktivitelerini değerlendirmek için kullanılan yöntem açıklanmaktadır.
IPA’nın vasküler reaktivitelerini incelemek için bitki ekstraktını örnek olarak kullanan birkaç deneysel protokol kullandık. Bitki ekstresi tarafından indüklenen endotele bağımlı ve bağımsız vazogevşeme mekanizmalarını tanımlamak için çeşitli blokerler (Şekil 1) kullanılmıştır. Bununla birlikte, aynı protokoller, IPA’nın çeşitli pulmoner patolojilerin tedavisinde kullanılan herhangi bir ilaca, ekstrakta veya fitokimyasallara vasküler yanıtlarını değerlendirmek için uyarlanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazıda, sıçan IPA ve VSMC’lerinin izolasyon tekniğini açıklayacağız. IPA’nın in vitro vasküler yanıtını araştırmak için, bitki ekstresi tarafından indüklenen IPA vazogevşemesinin farmakolojik etkisini ve mekanik temelini karakterize etmek için kullanılabilecek çeşitli deneysel protokoller kullanılmıştır.
Bitki ekstraktının endotele bağımlı vazodilatör etkisi ile ilgili olarak, L-NAME (eNOS), indometazin (COX) ve apamin + charybdotoxin (EDHF) gibi ç…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Tayland Ulusal Araştırma Konseyi’ne, Kimyada İnovasyon Mükemmeliyet Merkezi’ne (PERCH-CIC) ve Uluslararası Araştırma Ağı’na (IRN61W0005) finansal destek sağladıkları için ve Naresuan Üniversitesi Tıp Bilimleri Fakültesi Fizyoloji Bölümü’ne araştırma tesisi desteği için teşekkür etmek isterler.
Materials
| 1,4-dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632 CAS NO. 348-12-3 |
|
| 4-aminopyridine (4-AP) | Aldrich Chemical | A78403 CAS NO. 504-24-5 |
|
| Acetylcholine | Sigma-Aldrich | A6625 CAS NO. 60-31-1 |
|
| Apamin | Sigma-Aldrich | A9459 CAS NO. 24345-16-2 |
|
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 CAS NO. 9048-46-8 |
|
| Calcium choride | Ajax Finechem | AJA960 CAS NO. 1707055184 |
|
| Charybdotoxin | Sigma-Aldrich | C7802 CAS NO. 95751-30-7 |
|
| Collagenase type 1A | Sigma-Aldrich | C9891 CAS NO. 9001-12-1 |
From Clostridium histolyticum |
| D(+)-Glucose monohydrate | Millipore Corporation | K50876942 924 CAS NO. 14431-43-7 |
|
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 CAS NO. 67-68-5 |
|
| Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 CAS NO. 67-42-5 |
|
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 CAS NO. 60-00-4 |
|
| Forceps 11 cm. | Rustless Dumoxel | – | |
| Forceps 14 cm. | Rustless Dumoxel | – | |
| Glibenclamide | Sigma-Aldrich | G6039 CAS NO. 16673-34-0 |
|
| GraphPad Prism program | Software version 5.0 (San Diego, CA, USA) | ||
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 CAS NO. 7365-45-9 |
|
| Iberiotoxin | Sigma-Aldrich | I5904 CAS NO. 1002546960 |
recombinant from Mesobuthus tamulus |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 CAS NO. 53-86-1 |
|
| Labchart Program | Software version 7.0 (A.D. Instrument, Castle Hill, Australia). | ||
| Magnesium chloride | Ajax Finechem | 296 CAS NO. 1506254995 |
|
| Male Wistar rats | Nomura Siam International Co. Ltd., Bangkok, Thailand | ||
| NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) | Sigma-Aldrich | N5751 CAS NO. 51298-62-5 |
|
| Nicardipine | Sigma-Aldrich | N7510 CAS NO. 54527-84-3 |
|
| Organ bath 15 mL. | – | – | Specific order by the researchers |
| Papain | Sigma-Aldrich | P4762 CAS NO. 9001-73-4 |
FromPapaya Latex |
| Phenal red | Sigma-Aldrich | P5530 CAS NO. 34487-61-1 |
|
| Phenylephrine | Sigma-Aldrich | P6126 CAS NO. 61-76-7 |
|
| Potassium chloride | Kemaus | KA383 CAS NO. 7447-40-7 |
|
| Potassium dihydrogenphosphate | Aldrich Chemical | EC231-913-4 CAS NO. 7778-77-0 |
|
| S+A2:E36odium chloride | Kemaus | KA465 CAS NO. 7647-14-5 |
|
| Scissors 11 cm. | Spall Stainless | – | |
| Scissors 14 cm. | Spall Stainless | – | |
| Sodium bicarbonate | Ajax Finechem | 475 CAS NO. 912466 |
|
| Sodium dihydrogenphosphate | Aldrich Chemical | 33,198-8 CAS NO. 7558-80-7 |
|
| Sodium hydroxide | Ajax Finechem | 482 CAS NO. 1506196602 |
|
| Sodium thiopental | Anesthal | JPN3010002 CAS NO. 1C 314/47 |
|
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 CAS NO. 107-35-7 |
|
| Waterbath WBU 45 | Memmert | 2766 CAS NO. – |
References
- Lyle, M. A., Davis, J. P., Brozovich, F. V. Regulation of pulmonary vascular smooth muscle contractility in pulmonary arterial hypertension: Implications for therapy. Frontiers in Physiology. 8, 614 (2017).
- Cyr, A. R., Huckaby, L. V., Shiva, S. S., Zuckerbraun, B. S. Nitric oxide and endothelial dysfunction. Critical Care Clinics. 36 (2), 307-321 (2020).
- Ruan, K. -. H. Advance in understanding the biosynthesis of prostacyclin and thromboxane A2 in the endoplasmic reticulum membrane via the cyclo-oxygenase pathway. Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 4 (6), 639-647 (2004).
- Del Pozo, R., Hernandez Gonzalez, I., Escribano-Subias, P. The prostacyclin pathway in pulmonary arterial hypertension: A clinical review. Expert Review of Respiratory Medicine. 11 (6), 491-503 (2017).
- Morgado, M., Cairrão, E., Santos-Silva, A. J., Verde, I. Cyclic nucleotide-dependent relaxation pathways in vascular smooth muscle. Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (2), 247-266 (2012).
- Schmidt, K., de Wit, C. Endothelium-derived hyperpolarizing factor and myoendothelial coupling: The in vivo perspective. Frontiers in Physiology. 11, (2020).
- Fan, G., Cui, Y., Gollasch, M., Kassmann, M. Elementary calcium signaling in arterial smooth muscle. Channels. 13 (1), 505-519 (2019).
- Wisutthathum, S., et al. Extract of Aquilaria crassna leaves and mangiferin are vasodilators while showing no cytotoxicity. Journal of Traditional and Complementary Medicine. 9 (4), 237-242 (2019).
- Kamkaew, N., Paracha, T. U., Ingkaninan, K., Waranuch, N., Chootip, K. Vasodilatory effects and mechanisms of action of Bacopa monnieri active compounds on rat mesenteric arteries. Molecules. 24 (12), 2243 (2019).
- Chootip, K., Kennedy, C., Gurney, A. Characterization of P2 receptors mediating contraction of the rat isolated pulmonary vasculature. British Journal of Pharmacology. 131, 167 (2000).
- Paracha, T. U., et al. Elucidation of vasodilation response and structure activity relationships of N2, N4-disubstituted quinazoline 2, 4-diamines in a rat pulmonary artery model. Molecules. 24 (2), 281 (2019).
- Chootip, K., Gurney, A. M., Kennedy, C. Multiple P2Y receptors couple to calcium-dependent, chloride channels in smooth muscle cells of the rat pulmonary artery. Respiratory Research. 6 (1), 1-10 (2005).
- Wisutthathum, S., et al. Eulophia macrobulbon extract relaxes rat isolated pulmonary artery and protects against monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension. Phytomedicine. 50, 157-165 (2018).
- Kruangtip, O., et al. Curcumin analogues inhibit phosphodiesterase-5 and dilate rat pulmonary arteries. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (1), 87-95 (2015).
