Summary
동맥 폐 순환의 혈관 반응은 폐내 동맥 (IPA) 및 혈관 평활근 세포 (VSMC)를 사용하여 탐색 할 수 있습니다. 본 연구는 IPA의 분리와 생리적 자극에 대한 반응으로 혈관 이완을 조사하는 데 사용되는 프로토콜을 자세히 설명합니다.
Abstract
쥐 폐에서 분리 된 폐내 동맥 (IPA) 및 혈관 평활근 세포 (VSMC)는 혈관 수축 및 혈관 이완의 기본 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. IPA 및 VSMC를 분리 한 후 신경 신호, 호르몬, 사이토 카인 등과 같은 외인성 요인이없는 경우 생리 학적 및 병리학 적 조건에서 혈관 반응의 특성을 평가할 수 있습니다. 따라서 IPA 및 VSMC는 약리학 적 약제에 의한 조절, 패치 클램프 전기 생리 학적 분석, 칼슘 이미징 등과 같은 다양한 실험 조사와 함께 혈관 생리학 / 병태 생리학을 연구하기위한 우수한 모델 역할을합니다. 여기에서는 장기 목욕 설정에서 혈관 반응을 조사하기 위해 IPA를 분리하는 기술을 사용했습니다. IPA 세그먼트는 강내 와이어를 통해 장기 목욕 챔버에 장착되고 다양한 약리학 적 약제에 의해 자극되었습니다. IPA 혈관 색조의 변화(즉, 혈관 수축 및 혈관 이완)를 등척성 힘 변환기 및 생리학적 데이터 분석 소프트웨어 프로그램을 사용하여 기록하였다. 우리는 식물 화학 또는 합성 약물의 약리학 적 활성을 연구하기 위해 혈관 이완 / 혈관 수축 메커니즘을 조사하는 데 적용 할 수있는 몇 가지 실험 프로토콜을 구현했습니다. 이 프로토콜은 또한 폐동맥 고혈압을 포함한 다양한 질병을 조절하는 약물의 역할을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. IPA 모델을 통해 약물의 약력학 파라미터를 평가하는 데 중요한 농도-반응 곡선을 조사할 수 있습니다.
Introduction
폐 혈관 구조는 저압 혈관 시스템으로, 주요 기능은 산소가 제거 된 혈액을 폐의 가스 교환 영역으로 전달하는 것입니다. 폐의 폐동맥은 기관지 나무와 평행 한 가지로 배열되어 궁극적으로 여러 폐포에 걸쳐 연속적이고 마지막으로 정맥과 정맥으로 모이는 광범위한 모세 혈관 네트워크를 형성합니다. 폐동맥의 혈관 색조는 내피와 혈관 평활근 세포 (VSMC) 사이의 상호 작용을 포함하는 여러 요인에 의해 제어됩니다1.
이 연구에서 우리는 폐내 동맥 (IPA)의 내피 의존성 및 독립적 인 혈관 이완에 중점을 둡니다. 내피 의존성 혈관 이완과 관련하여 내피 세포 표면에서 발생하는 다양한 메커니즘은 세포 내Ca2+ 농도를 증가시킬 수 있으며(예: 아세틸콜린[ACh]는 무스카린 수용체[M3]와 결합), 산화질소(NO), 프로스타사이클린(PGl2) 및 내피 유래 과분극 인자(EDHF)의 형성을 유도할 수 있습니다(그림 1 ). NO는 내피 산화 질소 합성 효소 (eNOS)2에 의해 L- 아르기닌에서 합성 된 주요 내피 유래 이완 인자이며, 내피 세포에서 VSMC로 해리되고 (그림 1) 가용성 구아 닐릴 사이 클라 제 (sGC) 효소를 자극합니다. 이 효소는 구아노신 삼인산(GTP)을 고리형 구아노신 모노포스페이트(cGMP)로 변화시켜 단백질 키나아제 G(PKG)를 활성화하고 세포질Ca 2+ 수준을 감소시켜 혈관 이완을 유발합니다(그림 1). PGl2는 시클로옥시게나제(COX) 경로 3,4를 통해 내피 세포에 의해 합성된다. VSMC의 프로스타사이클린 수용체(IP)와 결합하여 아데닐릴 사이클라제(AC) 효소를 자극한 다음 아데노신 삼인산(ATP)을 고리형 아데노신 모노포스페이트(cAMP)로 전환합니다(그림 1)3,4. cAMP는 단백질 키나아제 A (PKA)를 활성화시켜 세포질Ca 2+ 수준을 감소시키고 혈관 이완5을 유발합니다 (그림 1). EDHF 경로는 또한 다양한 내피 매개체 및 전기적 사건을 통해 내피 의존성 혈관 이완에 참여합니다. EDHF 경로의 활성화는 VSMC의 과분극을 유도하여 전압 작동 Ca 2+ 채널 (VOCC)을 폐쇄하고 세포 내Ca 2+ 수준을 감소시키고 혈관 이완을 유도합니다6. 내피 비 의존성 혈관 이완은 세포 내Ca2+ 수준의 감소, 미오신 경쇄 키나아제 (MLCK)의 억제, 미오신 경쇄 포스파타제 (MLCP)의 활성화 및 VSMC의 수축 기계에 대한Ca 2+ 민감도의 감소와 같은 여러 메커니즘을 통해 VSMC에서 직접 발생합니다. 이 연구에서는 다양한 K+ 채널의 개방, VOCC의 봉쇄 및 근형질 세망7에서 Ca2+ 방출 억제로 인한 혈관 이완에 중점을 두어 세포 내Ca2+ 수준을 감소시켜 VSMC 미오신 경쇄 인산화 및 미오신 - 액틴 결합 또는 교차 다리 형성을 각각 감소시키고, 궁극적으로 혈관 이완을 초래합니다.
분리 된 IPA에서 혈관 수축 및 혈관 이완 측정을 평가하는 기술은 설치류에 대해 잘 확립되어 있지만 데이터는 실험 프로토콜에 따라 다릅니다. 본 연구는 신경 신호, 호르몬, 사이토 카인, 혈압 등과 같은 생체 내 혈관 반응을 조절하는 외부 요인이없는 상태에서 만들어진 시험관 내 래트 IPA 제제의 혈관 반응성을 평가하는 데 사용되는 방법을 설명합니다.
우리는 IPA의 혈관 반응성을 연구하기 위한 예로서 식물 추출물을 사용하는 여러 실험 프로토콜을 사용했습니다. 다양한 차단제 (그림 1)를 사용하여 식물 추출물에 의해 유도 된 내피 의존성 및 비 의존성 혈관 이완 메커니즘을 확인했습니다. 그럼에도 불구하고, 다양한 폐 병리의 치료에 사용되는 약물, 추출물 또는 식물 화학 물질에 대한 IPA의 혈관 반응을 평가하기 위해 동일한 프로토콜을 적용 할 수 있습니다.
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Protocol
이 연구에서 수행 된 실험은 Naresuan University 동물 관리 및 사용위원회 (NUACUC)의 윤리위원회, 프로토콜 번호 NU-AE620921, 과학적 목적을위한 동물의 관리 및 사용에 대한 승인을 받았습니다.
1. 생리적 용액의 조성
- 다음과 같이 최종 농도를 달성하기 위해 증류수에 화학물질을 용해시켜 크렙스 용액을 제형화한다: 122 mM NaCl, 10 mM HEPES, 5 mM KCl, 0.5 mM KH2PO4, 0.5mM NaHPO4, 1 mM MgCl2, 1.8 mM CaCl2, 및 11 mM 글루코스8. 사용하기 전에 용액의 pH를 1M NaOH로 7.3으로 조정하고 37°C로 예열합니다.
- 1.1단계에서 언급한 것과 유사하게 차가운 Krebs 용액을 준비합니다. 단계 2에 기재된 바와 같이 IPA의 격리 매체로서 사용하기 위해.
2. 폐내 동맥 분리 (IPA)
- 8주 된 수컷 Wistar 쥐를 티오펜탈 나트륨(100mg/kg)을 복강 주사하여 마취합니다9. 발에 고정 된 집게를 사용하여 깊은 수면에서 고통스러운 자극에 대한 쥐의 반응을 확인한 다음 2.2 단계에서 안락사시키기 전에 쥐가 발 풀백 반응이 없는지 확인하십시오.
- 쥐의 중간 흉부와 심장 단자를 가위 (크기 14cm)로 자릅니다. 그런 다음 가위 (크기 14cm)로 폐의 뿌리를 찾으십시오. 가위로 절단하여 폐 전체를 수확하고 차가운 Krebs 용액10,11에 담그십시오.
- 가위 (크기 11cm)로 폐의 단일 엽을 자르고 폐의 내측 / 뿌리가 위를 향하도록 페트리 접시 (크기 9cm)에 놓습니다 (그림 2A, B). 정맥, 기관지 및 동맥의 정렬을 위에서 아래로 관찰하고 식별합니다(그림 2B).
- 가위 (크기 11cm)로 기관지를 세로로 자릅니다. 그런 다음 집게(크기 11cm)를 사용하여 기관지 끝을 잡습니다. 부드럽게 해부하고 폐에서 기관지와 정맥을 제거하십시오. IPA는 항상 기관지 아래에 해부학 적으로 정렬되어 있습니다.
- 그 후 주요 IPA를 시각화 할 수 있습니다 (그림 2C). 집게(크기 11cm)를 사용하여 IPA의 끝을 잡고 가위(크기 11cm)로 폐 조직에서 조심스럽게 해부합니다.
- 분리된 IPA를 장기 수조 어셈블리가 설정될 때까지 차가운 크렙스 용액에 보관하십시오(pH 7.3 및 온도 4°C)1 1.
3. 혈관 평활근 세포 (VSMC)의 분리
- 앞서 2단계에서 설명한 대로 IPA를 분리합니다. 가위 (크기 11cm)로 IPA의 주요 가지를 세로로 자르고 작은 스트립 (2mm)으로 자릅니다 (그림 3A).
- IPA 스트립을 110 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.5 mM KH2PO4, 0.5 mMNaH2PO4, 10 mM NaHCO3, 10 mM Hepes,0.03 mM 페놀 레드, 10 mM 타우린, 0.5 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 11 mM 글루코스, 및 0.16 mMCaCl2를 함유하는 해리 매질 (DM)10,12에 침지시키고, 1 M NaOH로 pH를 7.0으로 조정한다. 스트립을 1 mg/mL 파파인, 0.04% 소 혈청 알부민(BSA) 및 0.4 mM 1,4-디티오트레이톨(DTT)을 함유하는 DM에서 4°C에서 1시간 동안 배양하고, 37°C에서 15분 동안 추가로 배양한다. DM에 1mg/mL 콜라게나제 유형 1A를 추가하고 37°C에서 5분 동안 추가로 배양합니다.
참고: DM은 세포 생존율을 보존하는 데 사용되는 솔루션입니다. 파파인과 콜라게나제 유형 1A는 세포 외 기질 단백질을 분해하여 단일 세포를 분리하는 효소입니다. BSA는 저장 및 효소 반응 동안 효소의 안정화에 사용되는 혈청 알부민 단백질입니다. DTT는 세포 분리 과정에서 효소의 활성을 안정화하고 촉진하는 데 사용되는 환원제입니다. 타우린은 세포막과 세포 완전성을 안정화시키는데 사용되는 아미노 황산이다. - 조직을 신선한 DM으로 옮기고 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 부드러운 분쇄로 분산시킵니다(그림 3B). 분리된 VSMC가 현미경으로 목욕 용액에서 보일 때까지 계속 분쇄합니다(그림 3C).
참고: 새로 분리된 VSMC는 약리학적 제제에 의한 조절, 패치 클램프 전기생리학적 분석, 칼슘 이미징 등과 같은 다양한 실험 조사와 함께 혈관 생리학/병태생리학을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나, 본 연구는 장기 목욕 기술을 이용한 분리 된 IPA의 혈관 이완에만 초점을 맞추고 있습니다.
4. 오르간 목욕 기술
- 앞서 2단계에서 설명한 대로 IPA를 분리합니다. IPA의 주요 가지를 ~2mm 길이의 고리로 자릅니다(그림 2D)13.
- IPA 링을 두 개의 직경 40μm 스테인리스 스틸 와이어(그림 2E)11,13,14에 끼워 오르간 수조 챔버(그림 4)에 부착합니다.
- IPA 링으로 장착된 스테인리스 스틸 와이어를 데이터 수집 장치 및 데이터 기록 및 분석에 적합한 생리학적 소프트웨어가 설치된 컴퓨터 시스템에 연결된 등척성 힘 변환기에 연결한 다음 IPA 링의 장력을 1g11로 부드럽게 올립니다.
- 용기 세그먼트가 45g의 휴지 장력에서 약 1분 동안 평형을 이루도록 합니다. 평형 기간 동안 Krebs 용액이 15분마다 정기적으로 교체되는지 확인하십시오. 이러한 평형 기간 후에, 47.4 mM NaCl, 80 mM KCl, 10 mM Hepes, 0.5 mMKH2PO4, 0.5 mM NaHPO4, 1.8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 및 11 mM 글루코스 10,11을 함유하는 높은 세포외 K+ (80 mM) 용액에 대한 혈관 수축을 측정함으로써 혈관의 생존력을 시험한다.
- 페닐에 프린 (PE, 1 x 10-5 M)으로 사전 계약 된 고리에서 아세틸 콜린 (1 x 10-5 M)에 대한 이완 반응을 계산하여 내피의 유무를 평가하십시오 (혈관 수축은 PE를 추가 한 후 1 시간 동안 안정적으로 유지됨). 고리가 70% 이상의 이완을 위해 정량화되는 경우 내피가 손상되지 않은 것으로 간주하십시오(그림 5A). 이완이 10% 미만인 경우 고리를 내피 탈질13으로 간주합니다(그림 5B). 작은 와이어로 혈관 내부를 부드럽게 문질러 내피를 기계적으로 제거하여 탈질을 유도합니다.
- 시험 실험의 시작 전에 30분 동안 동맥 고리를 다시 평형화시킨다.
5. 식물 추출물에 대한 혈관 이완제 반응
- PE (1 x 10-5 M)로 IPA 링을 사전 계약하여 식물 추출물의 이완 효과를 조사하십시오.
- 그런 다음 식물 추출물(1-1,000μg/mL)을 내피 원형 고리와 내피 탈질 고리에 누적하여 조심스럽게 추가하여 혈관 이완을 유도하고(그림 6A, B) 농도 의존적 반응 곡선을 얻습니다(그림 6C).
- 용매로 사용되는 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)의 효과도 음성 대조군으로 작용하도록 유사하게 평가되는지 확인하십시오 (그림 6C).
6. 식물 추출물이 내피를 통해 혈관이완을 유도하는 기전
- 내피 산화 질소 합성 효소 (eNOS), 시클로 옥시 게나 제 (COX) 13 및 내피 유래 과분극 인자 (EDHF) 경로를 통해 식물 추출물의 혈관 이완제 작용 메커니즘을 평가하여 내피 온전한 IPA 고리를 다음 억제제와 함께 30 분 동안 배양합니다 (그림 7A) : 1 x 10-4 M NG- 니트로 -L- 아르기닌 메틸 에스테르 (L-NAME, eNOS 억제제) 9, 1 x 10-5 M 인도 메타 신 (COX 억제제) 9, 또는 1 x 10-7 M AP로 IPA의 수축을 유도하기 전에 1 x 10-7 M 아파민 (작은 칼슘 활성화 칼륨 채널 차단제) 및 1 x 10-7 M charybdotoxin (중간 및 큰 전도도 칼슘 활성화 칼륨 채널 차단제)의 조합.
- 그런 다음 PE로 수축 안정화 된 후 식물 추출물의 누적 농도 (0.1-1,000 μg / mL)를 추가합니다.
- 억제제가 없는 IPA 고리의 반응과 비교하여 억제제가 있는 상태에서 IPA 고리의 이완 백분율로서 식물 추출물의 효과를 제시하고(그림 7B-D) 농도-반응 곡선을 구축합니다.
7. 혈관 평활근 K+ 채널을 통한 식물 추출물 유발 혈관 이완 메커니즘
- 전압 게이트 칼륨 채널(KV)의 차단제 인 1 x 10-3 M 4- 아미노 피리딘 (4-AP) (그림 8A), 1 x 10-5 M 글리 벤 클라 미드, ATP 민감성 칼륨 채널 (KATP) 차단제 또는 1 x 10-7 M 이베리오톡신, 큰 전도도Ca 2+ 활성화 K + 채널 (KCA)의 차단제, 1 x 10-5 M PE로 IPA의 수축을 유도하기 전에.
- 그런 다음 식물 추출물의 누적 농도를 추가합니다.
- 식물 추출물의 효과를 억제제가 없는 IPA 고리와 비교하여 억제제를 사용한 IPA 고리의 이완 백분율로 제시하고(그림 8B-D) 농도-반응 곡선을 구성합니다.
8. VSMCs에서 세포외 칼슘(Ca2+) 유입 억제를 통한 식물 추출물 유발 혈관 이완의 메커니즘
- 1mM 에틸렌 글리콜-비스(2-아미노에틸에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산(EGTA)을 포함하는 Ca2+-free Krebs 용액에서 30분 동안 내피 탈질 IPA 고리를 사전 배양합니다(그림 9A).
- 그런 다음 목욕 용액을Ca2 + free-80mM K+ 용액으로 10분 동안 교체하여 VSMC를 탈분극한 다음 VOCC를 엽니다(그림 9A).
- 누적 적으로CaCl2 (0.01-10 mM)를 추가하여 IPA의 혈관 수축을 유도하고 농도-반응 곡선을 구축합니다 (그림 9A).
- 동일한 IPA 고리에서이 프로토콜을 반복하되 식물 추출물 또는 1 μM 니카 디핀 (L 형Ca 2 + 채널 차단제)을Ca2+ 함유 80 mM K + 용액 중 10 분 동안 미리 배양 한 후 CaCl28을 누적 첨가합니다.
- 마지막으로, 수축 반응을 대조군CaCl2 챌린지에 의해 이전에 유도된 최대 수축과 비교한다(그림 9B).
9. 근형질 세망(SR)에서 세포내 칼슘(Ca2+) 방출 억제를 통한 식물 추출물 유도 혈관 이완 메커니즘
- 내피 탈질 IPA 링을 80mM K+ 용액에 약 5분 동안 노출시켜 VSMC를 탈분극하고 VOCC를 열고 궁극적으로 SR에Ca 2+ 로딩을 생성합니다(그림 10A).
- 10분 동안 목욕 용액을 1mM EGTA가 포함된 Ca2+가 없는 Krebs 용액으로 교체합니다(그림 10A).
- 그런 다음 포스포리파아제 C/IP3 경로를 활성화하여 궁극적으로 SR에서Ca2+를 방출하고 IPA의 일시적인 수축을 유발하는 1 x 10-5M PE로 IPA 링에 도전합니다(그림 10A).
- 동일한 프로토콜을 반복하여 PE에 대한 일시적인 수축을 확인합니다.
- 약 5분 동안 80mM K+ 용액으로 IPA 링에 다시 도전한 다음 목욕 용액을 식물 추출물이 있거나 없는 1mM EGTA를 포함하는 Ca2+ 프리 Krebs 용액으로 10분 동안 교체합니다.
- 다시 1 x 10-5 M PE로 IPA 링에 도전하십시오.
- PE에 의해 유도된 IPA 수축을 식물 추출물이 있는 상태와 없는 상태 사이에 비교합니다(그림 10B).
10. 통계 분석
- 결과를 평균± SEM으로 표현합니다. 스튜던트 t-검정을 사용하여 이러한 값을 비교하거나 분산 분석(ANOVA)으로 분석한 후 적절한 통계 소프트웨어를 사용하여 Tukey-Kramer 사후 검정을 수행합니다. p < 0.05에서의 차이가 통계적으로 유의하다고 생각하십시오. 여기서, n=6마리의 래트/실험 프로토콜이 있었다.
알림: 혈관 수축 및 혈관 이완의 기록은 컴퓨터에 설치된 적절한 소프트웨어로 평가할 수 있습니다. 예를 들어, 도 5A 는 혈관이 수축을 일으키는 PE에 의해 자극될 때, 이것은 원래 추적의 증가된 장력으로부터 관찰될 수 있음을 보여준다. 추적은 20-30 분 안에 안정화되며 이는 100 % 수축으로 간주됩니다. 그 후, ACh는 혈관을 자극하여 이완을 일으키며, 이는 원래 추적의 장력 감소에서 관찰 할 수 있습니다. 따라서, 감소된 장력은 100% 수축에 대한 백분율로 계산된다.
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Representative Results
본 연구의 프로토콜은 단리된 IPA 제제의 혈관 반응에서 관찰되는 생리적 현상을 측정하기 위한 최적의 실험 조건을 결정하기 위해 개발되었다. 파일럿 실험은 다음과 같이 식물 추출물의 혈관 효과 및 혈관 이완 작용의 기계론적 기초에 대한 이해를 돕기 위해 잠재적인 결과를 설명하기 위해 수행되었습니다.
식물 추출물의 혈관 이완 효과
그림 6A, B에서 볼 수 있듯이 내피 손상되지 않은 IPA (E +)에서 식물 추출물은 혈관 이완의 농도 의존적 반응을 유도했습니다 (EC50 = 66.88 μg / mL, 그림 6C). 내피 (E-)의 박멸은 EC 50의 2.2 배 증가에 반영된 바와 같이 식물 추출물에 의해 유도 된 혈관 이완 (p < 0.01)을 크게 감소 시켰습니다 (E-, EC50 = 150.60 μg / mL, 그림 6C). 차량 DMSO는 아무런 효과가 없었습니다. 따라서, 식물 추출물은 주로 내피 의존성 경로를 통해 그리고 부분적으로 내피 의존적 경로를 통해 혈관 이완을 생성했다.
내피 의존성 경로를 통한 식물 추출물의 혈관 이완 작용 메커니즘
그림 7에서 볼 수 있듯이 eNOS 억제를 위해 L-NAME을 활용하고(그림 7B) EDHF를 차단하기 위해 아파민과 차리브도톡신을 조합하면(그림 7D) 식물 추출물에 대한 혈관 이완제 반응이 분명히 감소했습니다. 이것은 농도-반응 곡선을 오른쪽으로 이동시키고Emax 값을 변경하지 않고EC50을 증가시켰습니다. 반대로, 인도메타신(COX 억제제)(도 7C)은 식물 추출물에 대한 혈관이완제 반응에 영향을 미치지 않았다.
식물 추출물의 혈관 이완 작용에서 K+ 채널의 역할 특성화
내피 탈질 IPA 고리에서KCA 채널 차단제 (이베리오톡신)는 식물 추출물에 대한 혈관 이완제 반응을 감소시킨 반면(그림 8C),Kv(4-AP) 또는 KATP(글리벤클라미드) 채널의 차단제는 식물 추출물에 의해 유도된 혈관 이완을 변형시키지 않았습니다(그림 8B, D).
세포외 Ca2+ 유입 억제를 통한 식물 추출물의 혈관이완 작용 기전
식물 추출물의 혈관 이완 작용 메커니즘이 세포 외 Ca2+ 유입 억제를 포함하는지 여부를 조사하기 위해, 내피 탈질 IPA 고리의 혈관 수축은 VOCC를 활성화하기 위해 80 mM K +와 결합 된Ca 2 + 유리 크렙스 용액에서 1 x 10-5-1 x 10-2 M CaCl 2에 의해 유발되었다 (그림 9A, B). 식물 추출물 (68 μg / mL,EC50 값)을 사용한 사전 배양은CaCl2 유도 수축을 억제했습니다 (p < 0.001 대 비히클).
SR로부터의 세포 내 Ca2+ 방출 억제를 통한 식물 추출물의 혈관 이완 작용 메커니즘
SR로부터의 세포 내Ca2+의 방출이 혈관 이완제 효과에 어떤 역할을하는지 여부를 조사하기 위해, 내피 - 탈질 IPA 고리를Ca 2 + - 프리 크렙스 용액으로 사전 배양 한 다음, PE (1 x 10-5 M)를 첨가하여 일시적인 수축을 일으켰다 (그림 10A). 이어서, 동일한 IPA 고리에서, 본 실험은 비히클 또는 식물 추출물의 존재하에 복제되었다. 비히클과 비교하여, 식물 추출물은 PE에 의해 유도된 수축을 유의하게 감소시켰다 (p < 0.001).
그림 1: 내피 의존성 및 비의존적 경로를 통한 혈관 색조 조절. AA = 아라키돈산, ACh = 아세틸콜린, AC = 아데닐릴시클라제, ATP = 아데노신 5'-삼인산, cAMP = 고리형 아데노신 모노포스페이트, cGMP = 고리형 구아노신 모노포스페이트, COX = 사이클로옥시게나제, DAG = 디아실글리세롤, EDHF = 내피 유래 과분극인자, eNOS = 내피 산화질소 합성효소,Gq = G-단백질 유형 q, GS = G-단백질 유형 s, GTP = 구아노신 삼인산, IP = 프로스타사이클린 수용체, IP3 = 이노시톨 1, 4, 5 트리포스페이트, IP3 R = IP3 수용체, IKCa = 중간 전도도 Ca2+-활성화된 K+ 채널, KV = 전압 게이트 칼륨 채널, K ATP =ATP에 민감한 칼륨 채널,KCA = 큰 전도도Ca2+-활성화된 K+ 채널, M3 = 무스카린 수용체, MEGJ = 근내피 gab 접합, NO = 산화질소, PE = 페닐에프린, PGI 2 = 프로스타사이클린, PGS= 프로스타글란딘, PIP2 = 포스파티딜이노시톨 4,5 비스포스페이트, PKA = 단백질 키나아제 A, PKG = 단백질 키나아제 G, PLA 2 = 포스 포 리파제 A 2, PLC = 포스 포 리파제 C, ROCC = 수용체 작동 Ca2+ 채널, RYR = 리아 노딘 수용체, sGC = 가용성 구아 닐릴 사이클라 제, SK Ca = 작은 전도도Ca 2 + 활성화 K + 채널, SR = 근관 세망, VOCC = 전압 작동Ca 2 + 채널. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 쥐 폐동맥(IPA) 분리의 주요 단계. (A) 사진은 IPA가 있는 쥐의 폐를 묘사합니다. (B) 폐의 내측 / 뿌리가 위를 향하도록 해부. (C) 정맥과 기관지를 제거한 후 시각화 된 주요 IPA. (d) 격리 된 IPA. (E) IPA 링은 장기 목욕 기술을 사용한 혈관 반응 연구를 위해 한 쌍의 스테인리스 스틸 와이어에 장착되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: IPA 혈관 평활근 세포(VSMC) 분리의 주요 단계. (A) 단리된 IPA를 작은 스트립으로 절단하고 해리 배지(DM)에 침지시켰다. (B) VSMC를 분리하기 위한 혈관 스트립의 분쇄. (C) 부드러운 분쇄 후 분리된 VSMCs. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 혈관 반응성을 테스트하는 데 사용된 장비의 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 10μM PE와 10μM 아세틸콜린(ACh)으로 사전 계약된 IPA 고리의 혈관 이완을 보여주는 대표적인 기록 . (A) 내피 손상 고리 (E +) 및 (B) 내피 탈질 (E-) 고리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 식물 추출물에 의한 IPA의 혈관 이완. (A) 내피 손상되지 않은 고리(E+) 및 (B) 내피 탈질(E-) 고리에서 10μM PE로 사전 계약된 식물 추출물(1-1,000μg/mL)에 의한 IPA 고리의 혈관 이완을 보여주는 대표적인 기록. (C) IPA 고리에서 식물 추출물에 의해 유도 된 혈관 이완의 농도-반응 곡선 (E +, n = 6 및 E-, n = 6). 혈관 이완은 PE에 의해 유도 된 수축의 백분율로 표시됩니다. 모든 데이터는 평균± SEM으로 표현된다. **차량과 비교하여 0.01, ***p < 0.001, ***p < 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7. 식물 추출물의 메커니즘은 내피 의존성 경로를 통한 IPA 혈관 이완을 유도한다. (A) L-NAME(eNOS 억제제)으로 사전 배양되고 10μM PE로 사전 계약된 내피 원형 IPA 고리(E+)의 식물 추출물(1-1,000μg/mL)에 의한 혈관 이완을 보여주는 대표적인 기록. (B-D) PE와 사전 계약되고 (B) 100 μM L-NAME, (C) 10 μM 인도메타신 또는 (D) 0.1 μM 아파민 플러스 0.1 μM 샤리브도톡신을 포함한 다양한 내피 신호 전달 경로의 억제제와 함께 사전 배양된 내피 온전한(E+) IPA 고리의 식물 추출물 유도 혈관 이완의 농도-반응 곡선. 값은 SEM± 평균입니다 (n = 6). **p < 0.01, ***p < 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8. 식물 추출물 유발 IPA 혈관 이완에 대한 K+ 채널 차단제의 효과. (A) 4-AP(KV 채널 차단제)와 함께 배양되고 10μM PE로 사전 계약 된 내피 탈질 (E-) IPA 고리의 식물 추출물 (1-1,000 μg / mL)에 의한 혈관 이완을 보여주는 대표적인 기록. (B-D) PE로 사전 계약되고 (B) 1mM 4-AP, (C) 10μM 글리벤클라미드 또는 (D) 30nM 이베리오톡신을 포함한 다양한 K+ 채널 차단제와 함께 사전 배양된 식물 추출물의 유도된 혈관 이완의 농도-반응 곡선. 값은 SEM± 평균입니다 (n = 6). p < 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9. 세포 외 Ca2+ 유입에 대한 식물 추출물의 효과. (a) 식물 추출물의 부재(대조군) 또는 존재 하에서의 IPA 고리의CaCl2 유도 수축을 나타내는 대표적인 기록. IPA 고리를 10mM EGTA를 함유하는Ca2+유리 높은 K+-용액(80mM)에 담가서CaCl2의 누적 농도에 의해 유발된 수축을 측정하였다. 이어서, 이 프로토콜을 단독으로(대조군, n=6) 또는 식물 추출물의 존재 하에서(n=6) 반복하였다. (B) 식물 추출물 또는 1 μM 니카르디핀(L형Ca2+ 채널 차단제)의 부재(대조군) 또는 존재 하에서의 IPA 고리의 CaCl2 유도 수축에 대한 농도-반응 곡선. CaCl2-유도된 수축은 제1CaCl2 적용으로부터 기록된 최대 수축의 백분율로서 계산되었고, 평균 ± SEM으로서 나타내었다. *
그림 10. 식물 추출물이 육종 세망 (SR)으로부터의Ca 2+ 방출에 미치는 영향. (A) DMSO (대조군) 및 10 μM의 식물 추출물의 존재하에 내피-탈질된 IPA 고리의 SR로부터의Ca2+ 방출에 의한 페닐에프린 (PE) 유도된 IPA 고리의 수축을 보여주는 대표적인 기록. 상기 데이터는 식물 추출물 없이 초기 프로토콜에 의해 생성된 수축과 비교하여 10 μM PE 유도 수축에 대한 백분율 수축이다. 값은 SEM± 평균입니다. **차량과 비교하여 p < 0.01. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 11: 내피 의존성 및 비의존적 경로를 통한 쥐의 폐동맥에 대한 식물 추출물의 혈관 확장 작용의 제안된 메커니즘 AA = 아라키돈산, ACh = 아세틸콜린, AC = 아데닐릴 사이클라제, ATP = 아데노신 5'-삼인산, cAMP = 고리형 아데노신 모노포스페이트, cGMP = 고리형 구아노신 모노포스페이트, COX = 사이클로옥시게나제, DAG = 디아실글리세롤, EDHF = 엔도텔륨 유래 과분극 인자, eNOS = 내피 산화질소 합성효소, Gq = G- 단백질 유형 q, GS = G- 단백질 유형 s, GTP = 구아노 신 트리 포스페이트, IP = 프로 스타 사이클린 수용체, IP 3 = 이노시톨 1, 4, 5 트리스 포스페이트, IP 3 R = IP 3수용체, IK Ca = 중간 전도도 Ca 2+ 활성화 K + 채널, KV = 전압 게이트 칼륨 채널, K ATP =ATP 민감성 칼륨 채널, KC = 큰 전도도Ca 2+-활성화 K+ 채널, M3 = 무스카린 수용체, MEGJ = 근내피 gab 접합, NO = 산화질소, PE = 페닐에프린, PGI2 = 프로스타사이클린, PGS = 프로스타글란딘, PIP2 = 포스파티딜이노시톨 4,5 비스포스페이트, PKA = 단백질 키나아제 A, PKG = 단백질 키나아제 G, PLA2 = 포스포리파아제 A2, PLC = 포스포리파아제 C, ROCCs = 수용체 작동형 Ca2+ 채널, RYR = 리아노딘 수용체, sGC = 가용성 구아닐릴사이클라제, SK Ca= 작은 전도도Ca 2+-활성화된 K+ 채널, SR = 사르코플라즘 세망, VOCC = 전압 작동식 Ca2+ 채널. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 원고에서는 쥐 IPA와 VSMC를 분리하는 기술을 설명합니다. 시험관 내에서 IPA의 혈관 반응을 조사하기 위해 여러 실험 프로토콜이 사용되었으며, 이는 식물 추출물에 의해 유도된 IPA 혈관 이완의 약리학적 효과 및 기계론적 기초를 특성화하는 데 사용될 수 있습니다.
식물 추출물의 내피 의존성 혈관 확장 작용과 관련하여 L-NAME (eNOS), 인도 메타 신 (COX) 및 아파민 + 차리 브도 톡신 (EDHF)과 같은 다양한 차단제가 사용되었습니다. 대표적인 데이터는 양성 결과(즉, eNOS 또는 EDHF 억제제의 존재 하에서 혈관 확장제 반응의 현저한 감소)와 음성 결과(즉, COX 억제제의 존재 하에 혈관 확장제 반응의 변화 없음)를 모두 보여주었으며, 이는 식물 추출물이 eNOS 및 EDHF 내피 경로를 통해 작용함을 시사합니다. 식물 추출물에 의해 유도 된 내피 비 혈관 이완제 효과는 K + 채널, 세포 외Ca2 + 유입 및 SR로부터의 Ca 2 + 방출의 관여를 통해 평가되었다. 결과는 식물 추출물에 대한 반응의 혈관 이완이 KCA 채널의 차단제 (이베리오톡신)에 의해 감소되었지만KV 채널의 차단제 (4-AP) 또는 KATP 채널의 차단제 (글리벤클라미드)에 의해 감소되지 않았음을 보여주었으며, 이는 추출물이KCA 채널의 개방을 통해 작용한다는 것을 시사한다. 더욱이,CaCl2-유도된 혈관수축은 식물 추출물에 의해 감소되었고, 이는 그 메커니즘이 VSMC에 대한 VOCC의 억제 또는Ca2+와 수축 기계의 상호작용에 대한 간섭을 수반함을 시사한다. 상세한 기계 론적 작용을 더 분석하기 위해 보완 연구가 수행되어야한다. 또한,Ca 2+-free Krebs에서 PE로의 일시적인 수축이 감소하였고, 이는 식물 추출물이 SR로부터Ca2+의 방출을 억제하여 혈관 수축의 감소를 유도한다는 것을 나타낸다. 식물 추출물의 혈관 이완 작용의 해석 메커니즘의 요약이 그림 11에 설명되어 있습니다.
본 연구에서 제안 된 실험 프로토콜은 기술적으로 실현 가능하며 우수한 재현성을 보여줍니다. 그럼에도 불구하고 성공을 보장하기 위해서는 몇 가지 중요한 단계가 필수적입니다. 첫째, 생리 학적 용액의 조성은 절차가 제대로 작동하는지 확인하기 위해 준비 중에 정확하게 유지되어야합니다. 또한 준비하는 동안 폐동맥을 만지거나 늘리거나 손상시키지 않는 것이 중요합니다. 폐동맥이 장기 목욕 챔버에 부착되면 검사 및 평가를 안정화하기 위해 15분(3회)마다 배지를 지속적으로 교체해야 합니다. 용기의 사전 장력은 필요한 수준보다 약간 높게 증가한 다음 최적이 달성 될 때까지 점차적으로 감소해야합니다 (즉, 1g).
혈관의 생존력, 내피 세포의 존재 및 혈관 이완에 대한 식물 추출물의 효과와 같은 여러 실험 프로토콜이이 기술에 의해 평가됩니다. 래트 IPA의 단리를 위한 해명된 절차는 다른 종(예를 들어, 마우스, 토끼 및 인간)에 조율될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 장기 목욕의 조립에 필요한 최적 조건은 다양한 동물 모델마다 다를 수 있으며 그에 따라 적응될 수 있습니다. 중요한 것은 실험 조건이 생리적 조건의 정확한 복제가 아니며 결과를 생체 내 현상으로 직접 외삽 할 수 없다는 것입니다.
이 IPA 분리 방법 및 혈관 반응 측정은 혈관 생리학, 병리학 및 약리학을 평가하는 실용적인 접근 방식입니다. 이를 통해 연구자들은 고립되었지만 잘 통제 된 환경에서 혈관 수축 및 혈관 이완을 연구 할 수 있습니다. 또한 폐동맥 고혈압과 같은 폐 혈관 병리학에 사용되는 약물의 치료 작용을 연구하는 데 적합 할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 태국 국립 연구위원회, 화학 혁신 우수 센터 (PERCH-CIC), 국제 연구 네트워크 (IRN61W0005)가 재정 지원을 제공하고 Naresuan University의 생리학 학부 의학과가 연구 시설 지원을 제공했음을 인정하고자합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632 CAS NO. 348-12-3 |
|
| 4-aminopyridine (4-AP) | Aldrich Chemical | A78403 CAS NO. 504-24-5 |
|
| Acetylcholine | Sigma-Aldrich | A6625 CAS NO. 60-31-1 |
|
| Apamin | Sigma-Aldrich | A9459 CAS NO. 24345-16-2 |
|
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 CAS NO. 9048-46-8 |
|
| Calcium choride | Ajax Finechem | AJA960 CAS NO. 1707055184 |
|
| Charybdotoxin | Sigma-Aldrich | C7802 CAS NO. 95751-30-7 |
|
| Collagenase type 1A | Sigma-Aldrich | C9891 CAS NO. 9001-12-1 |
From Clostridium histolyticum |
| D(+)-Glucose monohydrate | Millipore Corporation | K50876942 924 CAS NO. 14431-43-7 |
|
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 CAS NO. 67-68-5 |
|
| Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 CAS NO. 67-42-5 |
|
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 CAS NO. 60-00-4 |
|
| Forceps 11 cm. | Rustless Dumoxel | - | |
| Forceps 14 cm. | Rustless Dumoxel | - | |
| Glibenclamide | Sigma-Aldrich | G6039 CAS NO. 16673-34-0 |
|
| GraphPad Prism program | Software version 5.0 (San Diego, CA, USA) | ||
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 CAS NO. 7365-45-9 |
|
| Iberiotoxin | Sigma-Aldrich | I5904 CAS NO. 1002546960 |
recombinant from Mesobuthus tamulus |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 CAS NO. 53-86-1 |
|
| Labchart Program | Software version 7.0 (A.D. Instrument, Castle Hill, Australia). | ||
| Magnesium chloride | Ajax Finechem | 296 CAS NO. 1506254995 |
|
| Male Wistar rats | Nomura Siam International Co. Ltd., Bangkok, Thailand | ||
| NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) | Sigma-Aldrich | N5751 CAS NO. 51298-62-5 |
|
| Nicardipine | Sigma-Aldrich | N7510 CAS NO. 54527-84-3 |
|
| Organ bath 15 mL. | - | - | Specific order by the researchers |
| Papain | Sigma-Aldrich | P4762 CAS NO. 9001-73-4 |
FromPapaya Latex |
| Phenal red | Sigma-Aldrich | P5530 CAS NO. 34487-61-1 |
|
| Phenylephrine | Sigma-Aldrich | P6126 CAS NO. 61-76-7 |
|
| Potassium chloride | Kemaus | KA383 CAS NO. 7447-40-7 |
|
| Potassium dihydrogenphosphate | Aldrich Chemical | EC231-913-4 CAS NO. 7778-77-0 |
|
| S+A2:E36odium chloride | Kemaus | KA465 CAS NO. 7647-14-5 |
|
| Scissors 11 cm. | Spall Stainless | - | |
| Scissors 14 cm. | Spall Stainless | - | |
| Sodium bicarbonate | Ajax Finechem | 475 CAS NO. 912466 |
|
| Sodium dihydrogenphosphate | Aldrich Chemical | 33,198-8 CAS NO. 7558-80-7 |
|
| Sodium hydroxide | Ajax Finechem | 482 CAS NO. 1506196602 |
|
| Sodium thiopental | Anesthal | JPN3010002 CAS NO. 1C 314/47 |
|
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 CAS NO. 107-35-7 |
|
| Waterbath WBU 45 | Memmert | 2766 CAS NO. - |
References
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