संवहनी प्रतिक्रियाओं की जांच के लिए इंट्रापल्मोनरी धमनी और चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं का अलगाव
Summary
धमनी फुफ्फुसीय परिसंचरण की संवहनी प्रतिक्रियाओं को इंट्रापल्मोनरी धमनी (आईपीए) और संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं (वीएसएमसी) का उपयोग करके खोजा जा सकता है। वर्तमान अध्ययन में आईपीए के अलगाव और शारीरिक उत्तेजनाओं के जवाब में वैसोरलैक्सेशन की जांच के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल का विस्तार से वर्णन किया गया है।
Abstract
चूहे के फेफड़ों से अलग इंट्रापल्मोनरी धमनी (आईपीए) और संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं (वीएसएमसी) का उपयोग वाहिकासंकीर्णन और वासोरेक्सेशन के अंतर्निहित तंत्र का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। आईपीए और वीएसएमसी को अलग करने के बाद, तंत्रिका संकेतों, हार्मोन, साइटोकिन्स आदि जैसे बाहरी कारकों की अनुपस्थिति में शारीरिक और रोग संबंधी स्थितियों में संवहनी प्रतिक्रियाओं की विशेषताओं का आकलन किया जा सकता है। इस प्रकार, आईपीए और वीएसएमसी विभिन्न प्रयोगात्मक जांचों के साथ-साथ संवहनी शरीर विज्ञान / पैथोफिज़ियोलॉजी का अध्ययन करने के लिए उत्कृष्ट मॉडल के रूप में काम करते हैं, जैसे कि फार्माकोलॉजिकल एजेंटों द्वारा मॉड्यूलेशन, पैच-क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विश्लेषण, कैल्शियम इमेजिंग, आदि। यहां, हमने अंग स्नान सेटअप में संवहनी प्रतिक्रियाओं की जांच के लिए आईपीए को अलग करने के लिए एक तकनीक का उपयोग किया है। आईपीए खंडों को इंट्राल्यूमिनल तारों के माध्यम से अंग स्नान कक्ष पर रखा गया था और विभिन्न औषधीय एजेंटों द्वारा उत्तेजित किया गया था। आईपीए संवहनी टोन (यानी, वाहिकासंकीर्णन और वासोरेक्सेशन) में परिवर्तन, एक आइसोमेट्रिक बल ट्रांसड्यूसर और शारीरिक डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्रोग्राम का उपयोग करके दर्ज किए गए थे। हमने कई प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल लागू किए, जिन्हें फाइटोकेमिकल या सिंथेटिक दवाओं की औषधीय गतिविधियों का अध्ययन करने के लिए वासोरेक्सेशन / वाहिकासंकीर्णन के तंत्र की जांच करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। प्रोटोकॉल का उपयोग फुफ्फुसीय धमनी उच्च रक्तचाप सहित विभिन्न बीमारियों को संशोधित करने में दवाओं की भूमिकाओं का मूल्यांकन करने के लिए भी किया जा सकता है। आईपीए मॉडल हमें एकाग्रता-प्रतिक्रिया वक्र की जांच करने की अनुमति देता है, जो दवाओं के फार्माकोडायनामिक मापदंडों का आकलन करने में महत्वपूर्ण है।
Introduction
फुफ्फुसीय वाहिका एक निम्न दबाव संवहनी प्रणाली है जिसमें मुख्य कार्य फेफड़ों के गैस विनिमय क्षेत्र में ऑक्सीजन रहित रक्त पहुंचाना है। फेफड़ों में फुफ्फुसीय धमनियों को ब्रोन्कियल पेड़ के समानांतर शाखाओं में व्यवस्थित किया जाता है, अंततः केशिकाओं का एक व्यापक नेटवर्क बनता है जो कई एल्वियोली पर निरंतर होता है और अंत में, वेन्यूल्स और नसों में एक साथ आता है। फुफ्फुसीय धमनी की संवहनी टोन को कई कारकों द्वारा नियंत्रित किया जाता है, जिसमें एंडोथेलियम और संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं (वीएसएमसी) 1 के बीच बातचीत शामिल होती है।
इस अध्ययन में, हम इंट्रापल्मोनरी धमनी (आईपीए) के एंडोथेलियम-निर्भर और -स्वतंत्र वासोरेक्सेशन पर ध्यान केंद्रित करते हैं। एंडोथेलियम-निर्भर वैसोरलैक्सेशन के संबंध में, एंडोथेलियल कोशिकाओं की सतह पर होने वाले विभिन्न तंत्र इंट्रासेल्युलर सीए2 + एकाग्रता (जैसे, एसिटाइलकोलाइन [एसीएच] मस्केरिनिक रिसेप्टर [एम 3] के साथ बांधता है) को बढ़ा सकता है, जिससे नाइट्रिक ऑक्साइड (एनओ), प्रोस्टासाइक्लिन (पीजीएल2) और एंडोथेलियम-व्युत्पन्न हाइपरपोलराइज़िंग फैक्टर (ईडीएचएफ) का गठन होता है (चित्रा 1)। ). एनओ एंडोथेलियल नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेस (ईएनओएस) 2 द्वारा एल-आर्जिनिन से संश्लेषित मुख्य एंडोथेलियम-व्युत्पन्न आराम कारक है, जो तब एंडोथेलियल कोशिकाओं से वीएसएमसी (चित्रा 1) में विघटित हो जाता है और घुलनशील गुआनिल साइक्लेज (एसजीसी) एंजाइम को उत्तेजित करता है; यह एंजाइम ग्वानोसिन ट्राइफॉस्फेट (जीटीपी) को चक्रीय गुआनोसिन मोनोफॉस्फेट (सीजीएमपी) में बदल देता है, जो प्रोटीन काइनेज जी (पीकेजी) को सक्रिय करता है और साइटोसोलिक सीए2 + स्तर को कम करता है, इस प्रकार वासोरेक्सेशन (चित्रा 1) का कारण बनता है। पीजीएल2 को साइक्लो-ऑक्सीजनेज (सीओएक्स) मार्ग 3,4 के माध्यम से एंडोथेलियल कोशिकाओं द्वारा संश्लेषित किया जाता है। यह वीएसएमसी पर प्रोस्टासाइक्लिन रिसेप्टर (आईपी) के साथ बांधता है और एडेनिल साइक्लेज (एसी) एंजाइम को उत्तेजित करता है, जो तब एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) को चक्रीय एडेनोसिन मोनोफॉस्फेट (सीएमपी) में परिवर्तित करता है (चित्रा 1)3,4)। सीएमपी प्रोटीन काइनेज ए (पीकेए) को सक्रिय करता है, साइटोसोलिक सीए2 + के स्तर को कम करता है और वासोरेक्सेशन5 (चित्रा 1) का कारण बनता है। ईडीएचएफ मार्ग विभिन्न एंडोथेलियल मध्यस्थों और विद्युत घटनाओं के माध्यम से एंडोथेलियम-निर्भर वैसोरेक्सेशन में भी भाग लेता है। ईडीएचएफ मार्ग की सक्रियता वीएसएमसी के हाइपरपोलराइजेशन की ओर ले जाती है, इस प्रकार वोल्टेज संचालित सीए2 + चैनल (वीओसी) को बंद कर देती है, इंट्रासेल्युलर सीए2 + स्तर को कम करती है, और वैसोरलैक्सेशन6 को प्रेरित करती है। एंडोथेलियम-स्वतंत्र वैसोरलैक्सेशन कई तंत्रों के माध्यम से सीधे वीएसएमसी पर होता है, जैसे कि इंट्रासेल्युलर सीए2 + स्तर में कमी, मायोसिन लाइट चेन किनेज (एमएलसीके) का निषेध, मायोसिन लाइट चेन फॉस्फेट (एमएलसीपी) की सक्रियता, और वीएसएमसी की सिकुड़ा हुआ मशीनरी के लिए सीए2 + संवेदनशीलता में कमी। इस अध्ययन में, हम विभिन्न के + चैनलों के खुलने, वीओसी की नाकाबंदी और सारकोप्लाज्मिक रेटिकुलम7 से सीए2 + रिलीज के निषेध के कारण वासोरेक्सेशन पर ध्यान केंद्रित करते हैं, जिससे इंट्रासेल्युलर सीए 2 + स्तरों में कमी आती है, इस प्रकारक्रमशः वीएसएमसी मायोसिन प्रकाश श्रृंखला फॉस्फोराइलेशन और मायोसिन-एक्टिन बाइंडिंग या क्रॉस-ब्रिज गठन कम हो जाता है। अंततः वासोरेक्सेशन के परिणामस्वरूप।
पृथक आईपीए में वाहिकासंकीर्णन और वासोरेलेक्सेशन माप का मूल्यांकन करने की तकनीक कृन्तकों के लिए अच्छी तरह से स्थापित है, लेकिन प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के आधार पर डेटा भिन्न होता है। वर्तमान अध्ययन में विट्रो में चूहे आईपीए तैयारी की संवहनी प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग की जाने वाली विधि का वर्णन किया गया है, जो विवो में संवहनी प्रतिक्रिया को संशोधित करने वाले बाहरी कारकों की अनुपस्थिति में बनाया गया था, जैसे तंत्रिका संकेत, हार्मोन, साइटोकिन्स, रक्तचाप, आदि।
हमने आईपीए की संवहनी प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक उदाहरण के रूप में पौधे के अर्क का उपयोग करके कई प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल को नियोजित किया। पौधे के अर्क द्वारा प्रेरित एंडोथेलियम-निर्भर और -स्वतंत्र वैसोरलैक्सेशन के तंत्र की पहचान करने के लिए विभिन्न ब्लॉकर्स (चित्रा 1) का उपयोग किया गया था। फिर भी, विभिन्न फुफ्फुसीय विकृति के उपचार के लिए उपयोग की जाने वाली किसी भी दवा, अर्क या फाइटोकेमिकल्स के लिए आईपीए की संवहनी प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करने के लिए एक ही प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस पांडुलिपि में, हम चूहे आईपीए और वीएसएमसी के अलगाव के लिए तकनीक का वर्णन करते हैं। विट्रो में आईपीए की संवहनी प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए कई प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल नियोजित किए गए हैं, जिसका उप?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक वित्तीय सहायता प्रदान करने के लिए थाईलैंड की राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद, रसायन विज्ञान में नवाचार के लिए उत्कृष्टता केंद्र (PERCH-CIC), और अंतर्राष्ट्रीय अनुसंधान नेटवर्क (IRN61W0005) और अनुसंधान सुविधा सहायता के लिए फिजियोलॉजी फैकल्टी ऑफ मेडिकल साइंस, नरेसुआन विश्वविद्यालय के विभाग को स्वीकार करना चाहते हैं।
Materials
| 1,4-dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632 CAS NO. 348-12-3 |
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| 4-aminopyridine (4-AP) | Aldrich Chemical | A78403 CAS NO. 504-24-5 |
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| Acetylcholine | Sigma-Aldrich | A6625 CAS NO. 60-31-1 |
|
| Apamin | Sigma-Aldrich | A9459 CAS NO. 24345-16-2 |
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| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 CAS NO. 9048-46-8 |
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| Calcium choride | Ajax Finechem | AJA960 CAS NO. 1707055184 |
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| Charybdotoxin | Sigma-Aldrich | C7802 CAS NO. 95751-30-7 |
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| Collagenase type 1A | Sigma-Aldrich | C9891 CAS NO. 9001-12-1 |
From Clostridium histolyticum |
| D(+)-Glucose monohydrate | Millipore Corporation | K50876942 924 CAS NO. 14431-43-7 |
|
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 CAS NO. 67-68-5 |
|
| Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 CAS NO. 67-42-5 |
|
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 CAS NO. 60-00-4 |
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| Forceps 11 cm. | Rustless Dumoxel | – | |
| Forceps 14 cm. | Rustless Dumoxel | – | |
| Glibenclamide | Sigma-Aldrich | G6039 CAS NO. 16673-34-0 |
|
| GraphPad Prism program | Software version 5.0 (San Diego, CA, USA) | ||
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 CAS NO. 7365-45-9 |
|
| Iberiotoxin | Sigma-Aldrich | I5904 CAS NO. 1002546960 |
recombinant from Mesobuthus tamulus |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 CAS NO. 53-86-1 |
|
| Labchart Program | Software version 7.0 (A.D. Instrument, Castle Hill, Australia). | ||
| Magnesium chloride | Ajax Finechem | 296 CAS NO. 1506254995 |
|
| Male Wistar rats | Nomura Siam International Co. Ltd., Bangkok, Thailand | ||
| NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) | Sigma-Aldrich | N5751 CAS NO. 51298-62-5 |
|
| Nicardipine | Sigma-Aldrich | N7510 CAS NO. 54527-84-3 |
|
| Organ bath 15 mL. | – | – | Specific order by the researchers |
| Papain | Sigma-Aldrich | P4762 CAS NO. 9001-73-4 |
FromPapaya Latex |
| Phenal red | Sigma-Aldrich | P5530 CAS NO. 34487-61-1 |
|
| Phenylephrine | Sigma-Aldrich | P6126 CAS NO. 61-76-7 |
|
| Potassium chloride | Kemaus | KA383 CAS NO. 7447-40-7 |
|
| Potassium dihydrogenphosphate | Aldrich Chemical | EC231-913-4 CAS NO. 7778-77-0 |
|
| S+A2:E36odium chloride | Kemaus | KA465 CAS NO. 7647-14-5 |
|
| Scissors 11 cm. | Spall Stainless | – | |
| Scissors 14 cm. | Spall Stainless | – | |
| Sodium bicarbonate | Ajax Finechem | 475 CAS NO. 912466 |
|
| Sodium dihydrogenphosphate | Aldrich Chemical | 33,198-8 CAS NO. 7558-80-7 |
|
| Sodium hydroxide | Ajax Finechem | 482 CAS NO. 1506196602 |
|
| Sodium thiopental | Anesthal | JPN3010002 CAS NO. 1C 314/47 |
|
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 CAS NO. 107-35-7 |
|
| Waterbath WBU 45 | Memmert | 2766 CAS NO. – |
References
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