בידוד של עורקים תוך-ריאתיים ותאי שריר חלק כדי לחקור תגובות כלי דם
Summary
ניתן לחקור תגובות וסקולריות של זרימת הדם הריאתית העורקית באמצעות עורק תוך פולמונרי (IPA) ותאי שריר חלק וסקולריים (VSMCs). המחקר הנוכחי מתאר בפירוט את הבידוד של IPA ואת הפרוטוקולים המשמשים לחקר vasorelaxation בתגובה לגירויים פיזיולוגיים.
Abstract
ניתן להשתמש בעורק התוך-ריאתי (IPA) ובתאי השריר החלק של כלי הדם (VSMCs) שבודדו מריאות חולדות כדי לחקור את המנגנונים הבסיסיים של התפשטות כלי דם ו-vasorelax. לאחר בידוד ה- IPA וה- VSMCs, ניתן להעריך את המאפיינים של תגובות כלי הדם בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים בהעדר גורמים חיצוניים כגון אותות עצביים, הורמונים, ציטוקינים וכו ‘. לפיכך, ה- IPA וה- VSMCs משמשים מודלים מצוינים לחקר פיזיולוגיה / פתופיזיולוגיה של כלי הדם, יחד עם חקירות ניסיוניות שונות, כגון אפנון על ידי סוכנים פרמקולוגיים, ניתוח אלקטרופיזיולוגי של מהדק טלאי, הדמיית סידן וכו ‘. כאן, השתמשנו בטכניקה לבידוד ה-IPA כדי לחקור תגובות וסקולריות במערך אמבט איברים. מקטעי IPA הורכבו על תא אמבט האיברים באמצעות חוטים אינטראלומינליים ועוררו על ידי סוכנים פרמקולוגיים שונים. השינויים בטונוס כלי הדם של IPA (כלומר, vasoconstriction ו-vasorelax), תועדו באמצעות מתמר כוח איזומטרי ותוכנה לניתוח נתונים פיזיולוגיים. יישמנו מספר פרוטוקולים ניסיוניים, שניתן להתאים אותם כדי לחקור את המנגנונים של vasorelax/vasoconstriction לחקר הפעילות הפרמקולוגית של תרופות פיטוכימיות או סינתטיות. הפרוטוקולים יכולים לשמש גם להערכת תפקידן של תרופות בוויסות מחלות שונות, כולל יתר לחץ דם ריאתי עורקי. מודל IPA מאפשר לנו לחקור את עקומת תגובת הריכוז, שהיא חיונית בהערכת הפרמטרים הפרמקודינמיים של תרופות.
Introduction
כלי הדם הריאתיים הם מערכת כלי דם בלחץ נמוך שבה הפונקציה העיקרית היא לספק דם deoxygenated לאזור החלפת גז של הריאות. העורקים הריאתיים בריאות מסודרים בענפים מקבילים לעץ הסימפונות, ובסופו של דבר יוצרים רשת נרחבת של נימים שהיא רציפה על פני כמה נאדיות, ולבסוף, מתאחדת לתוך ורידים וורידים. הטון הווסקולרי של עורק הריאה נשלט על ידי מספר גורמים, המערבים את האינטראקציה בין האנדותל לבין תאי השריר החלק של כלי הדם (VSMCs)1.
במחקר זה אנו מתמקדים בכלי הדם התלויים-תלותיים והעצמאיים של העורק התוך-פולמונרי (IPA). בנוגע לווסורגנציה התלויה באנדותל, מנגנונים שונים המתרחשים על פני השטח של תאי האנדותל עשויים להגביר את ריכוז Ca2+ התוך-תאי (לדוגמה, קשירת אצטילכולין [ACh] עם קולטן מוסקריני [M3]), מה שמוביל להיווצרות תחמוצת החנקן (NO), פרוסטציקלין (PGl 2) וגורם היפרפולריזציה שמקורו באנדותל (EDHF) (איור 1 ). NO הוא הגורם המרגיע העיקרי שמקורו באנדותל, המסונתז מ-L-ארגינין על-ידי סינתאז תחמוצת החנקן של האנדותל (eNOS)2, אשר לאחר מכן מתנתק מתאי האנדותל ל-VSMCs (איור 1) וממריץ את האנזים המסיס גואניליל ציקלאז (sGC); האנזים הזה משנה את הגואנוזין טריפוספט (GTP) לגואנוזין מונופוספט מחזורי (cGMP), שמפעיל את החלבון קינאז G (PKG) ומפחית את רמות Ca2+ הציטוזוליקיות, ובכך גורם לדלקת כלי הדם (איור 1). PGl 2 מסונתז על ידי תאי אנדותל דרך מסלול ציקלו-אוקסיגנאז (COX) 3,4. הוא נקשר לקולטן הפרוסטציקלין (IP) ב-VSMCs וממריץ את האנזים אדניליל ציקלאז (AC), אשר לאחר מכן ממיר אדנוזין טריפוספט (ATP) לאדנוזין מונופוספט מחזורי (cAMP) (איור 1)3,4. cAMP מפעיל את החלבון קינאז A (PKA), מפחית את רמות Ca2+ הציטוזולי וגורם לווזורגנציה5 (איור 1). מסלול ה-EDHF משתתף גם בוויסורגנציה תלוית אנדותל באמצעות מתווכי אנדותל שונים ואירועים חשמליים. ההפעלה של מסלול EDHF מובילה להיפרפולריזציה של VSMCs, ובכך סוגרת ערוצי Ca2+ (VOCCs) המופעלים באמצעות מתח, מפחיתה את רמותCa 2+ התוך-תאיות, וגורמת לוויסורגנציה6. הוויסורגנציה הבלתי תלויה באנדותל מתרחשת ישירות על VSMCs באמצעות מספר מנגנונים, כגון הפחתת רמתCa 2+ תוך-תאית, עיכוב של קינאז שרשרת אור מיוזין (MLCK), הפעלת פוספטאז שרשרת אור מיוזין (MLCP), והפחתת רגישות Ca2+ למנגנון ההתכווצות של VSMCs. במחקר זה, אנו מתמקדים בווזורגנציה הנגרמת על ידי פתיחת ערוצי K+ שונים, חסימת תרכובות אורגניות נדיפות ועיכוב שחרור Ca 2+ מהרשתית הסרקופלסמית7, מה שמוביל לירידה ברמות Ca 2+ תוך-תאיות, ובכך מפחית את זרחון שרשרת האור VSMC מיוזין וקשירת מיוזין-אקטין או היווצרות גשר צולב, בהתאמה, ובסופו של דבר התוצאה היא vasorelaxation.
הטכניקה להערכת מדידות vasoconstriction ו vasorelaxation ב IPA מבודד מבוססת היטב עבור מכרסמים, אבל הנתונים השתנו בהתאם לפרוטוקולים הניסוי. המחקר הנוכחי מתאר את השיטה המשמשת להערכת תגובתיות כלי הדם של תכשירי IPA של חולדות במבחנה, שנעשו בהיעדר גורמים חיצוניים המווסתים את תגובת כלי הדם in vivo, כגון אותות עצביים, הורמונים, ציטוקינים, לחץ דם וכו ‘.
השתמשנו במספר פרוטוקולים ניסיוניים תוך שימוש בתמצית הצמח כדוגמה לחקר תגובתיות כלי הדם של IPA. חוסמים שונים (איור 1) שימשו כדי לזהות את המנגנונים של כלי דם תלויי אנדותל ובלתי תלויים המושרים על-ידי תמצית הצמח. עם זאת, ניתן להתאים את אותם פרוטוקולים כדי להעריך את תגובות כלי הדם של IPA לכל תרופות, תמציות או פיטוכימיקלים המשמשים לטיפול בפאתולוגיות ריאתיות שונות.
Protocol
Representative Results
Discussion
בכתב יד זה אנו מתארים את הטכניקה לבידוד של חולדות IPA ו- VSMCs. מספר פרוטוקולים ניסיוניים שימשו כדי לחקור את התגובה הווסקולרית של IPA במבחנה, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לאפיין את האפקט הפרמקולוגי ואת הבסיס המכניסטי של IPA vasorelaxation המושרה על ידי תמצית צמחים.
בנוגע לפעולת מרחיב כלי ה…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות למועצת המחקר הלאומית של תאילנד, למרכז המצוינות לחדשנות בכימיה (PERCH-CIC) ולרשת המחקר הבינלאומית (IRN61W0005) על מתן תמיכה כספית, ולמחלקה לפיזיולוגיה הפקולטה למדעי הרפואה, אוניברסיטת נארסואן, על תמיכה במתקני מחקר.
Materials
| 1,4-dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632 CAS NO. 348-12-3 |
|
| 4-aminopyridine (4-AP) | Aldrich Chemical | A78403 CAS NO. 504-24-5 |
|
| Acetylcholine | Sigma-Aldrich | A6625 CAS NO. 60-31-1 |
|
| Apamin | Sigma-Aldrich | A9459 CAS NO. 24345-16-2 |
|
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 CAS NO. 9048-46-8 |
|
| Calcium choride | Ajax Finechem | AJA960 CAS NO. 1707055184 |
|
| Charybdotoxin | Sigma-Aldrich | C7802 CAS NO. 95751-30-7 |
|
| Collagenase type 1A | Sigma-Aldrich | C9891 CAS NO. 9001-12-1 |
From Clostridium histolyticum |
| D(+)-Glucose monohydrate | Millipore Corporation | K50876942 924 CAS NO. 14431-43-7 |
|
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 CAS NO. 67-68-5 |
|
| Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 CAS NO. 67-42-5 |
|
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 CAS NO. 60-00-4 |
|
| Forceps 11 cm. | Rustless Dumoxel | – | |
| Forceps 14 cm. | Rustless Dumoxel | – | |
| Glibenclamide | Sigma-Aldrich | G6039 CAS NO. 16673-34-0 |
|
| GraphPad Prism program | Software version 5.0 (San Diego, CA, USA) | ||
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 CAS NO. 7365-45-9 |
|
| Iberiotoxin | Sigma-Aldrich | I5904 CAS NO. 1002546960 |
recombinant from Mesobuthus tamulus |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 CAS NO. 53-86-1 |
|
| Labchart Program | Software version 7.0 (A.D. Instrument, Castle Hill, Australia). | ||
| Magnesium chloride | Ajax Finechem | 296 CAS NO. 1506254995 |
|
| Male Wistar rats | Nomura Siam International Co. Ltd., Bangkok, Thailand | ||
| NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) | Sigma-Aldrich | N5751 CAS NO. 51298-62-5 |
|
| Nicardipine | Sigma-Aldrich | N7510 CAS NO. 54527-84-3 |
|
| Organ bath 15 mL. | – | – | Specific order by the researchers |
| Papain | Sigma-Aldrich | P4762 CAS NO. 9001-73-4 |
FromPapaya Latex |
| Phenal red | Sigma-Aldrich | P5530 CAS NO. 34487-61-1 |
|
| Phenylephrine | Sigma-Aldrich | P6126 CAS NO. 61-76-7 |
|
| Potassium chloride | Kemaus | KA383 CAS NO. 7447-40-7 |
|
| Potassium dihydrogenphosphate | Aldrich Chemical | EC231-913-4 CAS NO. 7778-77-0 |
|
| S+A2:E36odium chloride | Kemaus | KA465 CAS NO. 7647-14-5 |
|
| Scissors 11 cm. | Spall Stainless | – | |
| Scissors 14 cm. | Spall Stainless | – | |
| Sodium bicarbonate | Ajax Finechem | 475 CAS NO. 912466 |
|
| Sodium dihydrogenphosphate | Aldrich Chemical | 33,198-8 CAS NO. 7558-80-7 |
|
| Sodium hydroxide | Ajax Finechem | 482 CAS NO. 1506196602 |
|
| Sodium thiopental | Anesthal | JPN3010002 CAS NO. 1C 314/47 |
|
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 CAS NO. 107-35-7 |
|
| Waterbath WBU 45 | Memmert | 2766 CAS NO. – |
Referências
- Lyle, M. A., Davis, J. P., Brozovich, F. V. Regulation of pulmonary vascular smooth muscle contractility in pulmonary arterial hypertension: Implications for therapy. Frontiers in Physiology. 8, 614 (2017).
- Cyr, A. R., Huckaby, L. V., Shiva, S. S., Zuckerbraun, B. S. Nitric oxide and endothelial dysfunction. Critical Care Clinics. 36 (2), 307-321 (2020).
- Ruan, K. -. H. Advance in understanding the biosynthesis of prostacyclin and thromboxane A2 in the endoplasmic reticulum membrane via the cyclo-oxygenase pathway. Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 4 (6), 639-647 (2004).
- Del Pozo, R., Hernandez Gonzalez, I., Escribano-Subias, P. The prostacyclin pathway in pulmonary arterial hypertension: A clinical review. Expert Review of Respiratory Medicine. 11 (6), 491-503 (2017).
- Morgado, M., Cairrão, E., Santos-Silva, A. J., Verde, I. Cyclic nucleotide-dependent relaxation pathways in vascular smooth muscle. Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (2), 247-266 (2012).
- Schmidt, K., de Wit, C. Endothelium-derived hyperpolarizing factor and myoendothelial coupling: The in vivo perspective. Frontiers in Physiology. 11, (2020).
- Fan, G., Cui, Y., Gollasch, M., Kassmann, M. Elementary calcium signaling in arterial smooth muscle. Channels. 13 (1), 505-519 (2019).
- Wisutthathum, S., et al. Extract of Aquilaria crassna leaves and mangiferin are vasodilators while showing no cytotoxicity. Journal of Traditional and Complementary Medicine. 9 (4), 237-242 (2019).
- Kamkaew, N., Paracha, T. U., Ingkaninan, K., Waranuch, N., Chootip, K. Vasodilatory effects and mechanisms of action of Bacopa monnieri active compounds on rat mesenteric arteries. Molecules. 24 (12), 2243 (2019).
- Chootip, K., Kennedy, C., Gurney, A. Characterization of P2 receptors mediating contraction of the rat isolated pulmonary vasculature. British Journal of Pharmacology. 131, 167 (2000).
- Paracha, T. U., et al. Elucidation of vasodilation response and structure activity relationships of N2, N4-disubstituted quinazoline 2, 4-diamines in a rat pulmonary artery model. Molecules. 24 (2), 281 (2019).
- Chootip, K., Gurney, A. M., Kennedy, C. Multiple P2Y receptors couple to calcium-dependent, chloride channels in smooth muscle cells of the rat pulmonary artery. Respiratory Research. 6 (1), 1-10 (2005).
- Wisutthathum, S., et al. Eulophia macrobulbon extract relaxes rat isolated pulmonary artery and protects against monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension. Phytomedicine. 50, 157-165 (2018).
- Kruangtip, O., et al. Curcumin analogues inhibit phosphodiesterase-5 and dilate rat pulmonary arteries. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (1), 87-95 (2015).
