혈관 반응을 조사하기 위한 폐동맥 및 평활근 세포의 분리
Summary
동맥 폐 순환의 혈관 반응은 폐내 동맥 (IPA) 및 혈관 평활근 세포 (VSMC)를 사용하여 탐색 할 수 있습니다. 본 연구는 IPA의 분리와 생리적 자극에 대한 반응으로 혈관 이완을 조사하는 데 사용되는 프로토콜을 자세히 설명합니다.
Abstract
쥐 폐에서 분리 된 폐내 동맥 (IPA) 및 혈관 평활근 세포 (VSMC)는 혈관 수축 및 혈관 이완의 기본 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. IPA 및 VSMC를 분리 한 후 신경 신호, 호르몬, 사이토 카인 등과 같은 외인성 요인이없는 경우 생리 학적 및 병리학 적 조건에서 혈관 반응의 특성을 평가할 수 있습니다. 따라서 IPA 및 VSMC는 약리학 적 약제에 의한 조절, 패치 클램프 전기 생리 학적 분석, 칼슘 이미징 등과 같은 다양한 실험 조사와 함께 혈관 생리학 / 병태 생리학을 연구하기위한 우수한 모델 역할을합니다. 여기에서는 장기 목욕 설정에서 혈관 반응을 조사하기 위해 IPA를 분리하는 기술을 사용했습니다. IPA 세그먼트는 강내 와이어를 통해 장기 목욕 챔버에 장착되고 다양한 약리학 적 약제에 의해 자극되었습니다. IPA 혈관 색조의 변화(즉, 혈관 수축 및 혈관 이완)를 등척성 힘 변환기 및 생리학적 데이터 분석 소프트웨어 프로그램을 사용하여 기록하였다. 우리는 식물 화학 또는 합성 약물의 약리학 적 활성을 연구하기 위해 혈관 이완 / 혈관 수축 메커니즘을 조사하는 데 적용 할 수있는 몇 가지 실험 프로토콜을 구현했습니다. 이 프로토콜은 또한 폐동맥 고혈압을 포함한 다양한 질병을 조절하는 약물의 역할을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. IPA 모델을 통해 약물의 약력학 파라미터를 평가하는 데 중요한 농도-반응 곡선을 조사할 수 있습니다.
Introduction
폐 혈관 구조는 저압 혈관 시스템으로, 주요 기능은 산소가 제거 된 혈액을 폐의 가스 교환 영역으로 전달하는 것입니다. 폐의 폐동맥은 기관지 나무와 평행 한 가지로 배열되어 궁극적으로 여러 폐포에 걸쳐 연속적이고 마지막으로 정맥과 정맥으로 모이는 광범위한 모세 혈관 네트워크를 형성합니다. 폐동맥의 혈관 색조는 내피와 혈관 평활근 세포 (VSMC) 사이의 상호 작용을 포함하는 여러 요인에 의해 제어됩니다1.
이 연구에서 우리는 폐내 동맥 (IPA)의 내피 의존성 및 독립적 인 혈관 이완에 중점을 둡니다. 내피 의존성 혈관 이완과 관련하여 내피 세포 표면에서 발생하는 다양한 메커니즘은 세포 내Ca2+ 농도를 증가시킬 수 있으며(예: 아세틸콜린[ACh]는 무스카린 수용체[M3]와 결합), 산화질소(NO), 프로스타사이클린(PGl2) 및 내피 유래 과분극 인자(EDHF)의 형성을 유도할 수 있습니다(그림 1 ). NO는 내피 산화 질소 합성 효소 (eNOS)2에 의해 L- 아르기닌에서 합성 된 주요 내피 유래 이완 인자이며, 내피 세포에서 VSMC로 해리되고 (그림 1) 가용성 구아 닐릴 사이 클라 제 (sGC) 효소를 자극합니다. 이 효소는 구아노신 삼인산(GTP)을 고리형 구아노신 모노포스페이트(cGMP)로 변화시켜 단백질 키나아제 G(PKG)를 활성화하고 세포질Ca 2+ 수준을 감소시켜 혈관 이완을 유발합니다(그림 1). PGl2는 시클로옥시게나제(COX) 경로 3,4를 통해 내피 세포에 의해 합성된다. VSMC의 프로스타사이클린 수용체(IP)와 결합하여 아데닐릴 사이클라제(AC) 효소를 자극한 다음 아데노신 삼인산(ATP)을 고리형 아데노신 모노포스페이트(cAMP)로 전환합니다(그림 1)3,4. cAMP는 단백질 키나아제 A (PKA)를 활성화시켜 세포질Ca 2+ 수준을 감소시키고 혈관 이완5을 유발합니다 (그림 1). EDHF 경로는 또한 다양한 내피 매개체 및 전기적 사건을 통해 내피 의존성 혈관 이완에 참여합니다. EDHF 경로의 활성화는 VSMC의 과분극을 유도하여 전압 작동 Ca 2+ 채널 (VOCC)을 폐쇄하고 세포 내Ca 2+ 수준을 감소시키고 혈관 이완을 유도합니다6. 내피 비 의존성 혈관 이완은 세포 내Ca2+ 수준의 감소, 미오신 경쇄 키나아제 (MLCK)의 억제, 미오신 경쇄 포스파타제 (MLCP)의 활성화 및 VSMC의 수축 기계에 대한Ca 2+ 민감도의 감소와 같은 여러 메커니즘을 통해 VSMC에서 직접 발생합니다. 이 연구에서는 다양한 K+ 채널의 개방, VOCC의 봉쇄 및 근형질 세망7에서 Ca2+ 방출 억제로 인한 혈관 이완에 중점을 두어 세포 내Ca2+ 수준을 감소시켜 VSMC 미오신 경쇄 인산화 및 미오신 – 액틴 결합 또는 교차 다리 형성을 각각 감소시키고, 궁극적으로 혈관 이완을 초래합니다.
분리 된 IPA에서 혈관 수축 및 혈관 이완 측정을 평가하는 기술은 설치류에 대해 잘 확립되어 있지만 데이터는 실험 프로토콜에 따라 다릅니다. 본 연구는 신경 신호, 호르몬, 사이토 카인, 혈압 등과 같은 생체 내 혈관 반응을 조절하는 외부 요인이없는 상태에서 만들어진 시험관 내 래트 IPA 제제의 혈관 반응성을 평가하는 데 사용되는 방법을 설명합니다.
우리는 IPA의 혈관 반응성을 연구하기 위한 예로서 식물 추출물을 사용하는 여러 실험 프로토콜을 사용했습니다. 다양한 차단제 (그림 1)를 사용하여 식물 추출물에 의해 유도 된 내피 의존성 및 비 의존성 혈관 이완 메커니즘을 확인했습니다. 그럼에도 불구하고, 다양한 폐 병리의 치료에 사용되는 약물, 추출물 또는 식물 화학 물질에 대한 IPA의 혈관 반응을 평가하기 위해 동일한 프로토콜을 적용 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 원고에서는 쥐 IPA와 VSMC를 분리하는 기술을 설명합니다. 시험관 내에서 IPA의 혈관 반응을 조사하기 위해 여러 실험 프로토콜이 사용되었으며, 이는 식물 추출물에 의해 유도된 IPA 혈관 이완의 약리학적 효과 및 기계론적 기초를 특성화하는 데 사용될 수 있습니다.
식물 추출물의 내피 의존성 혈관 확장 작용과 관련하여 L-NAME (eNOS), 인도 메타 신 (COX) 및 아파민 + 차리 …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 태국 국립 연구위원회, 화학 혁신 우수 센터 (PERCH-CIC), 국제 연구 네트워크 (IRN61W0005)가 재정 지원을 제공하고 Naresuan University의 생리학 학부 의학과가 연구 시설 지원을 제공했음을 인정하고자합니다.
Materials
| 1,4-dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632 CAS NO. 348-12-3 |
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| 4-aminopyridine (4-AP) | Aldrich Chemical | A78403 CAS NO. 504-24-5 |
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| Acetylcholine | Sigma-Aldrich | A6625 CAS NO. 60-31-1 |
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| Apamin | Sigma-Aldrich | A9459 CAS NO. 24345-16-2 |
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| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 CAS NO. 9048-46-8 |
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| Calcium choride | Ajax Finechem | AJA960 CAS NO. 1707055184 |
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| Charybdotoxin | Sigma-Aldrich | C7802 CAS NO. 95751-30-7 |
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| Collagenase type 1A | Sigma-Aldrich | C9891 CAS NO. 9001-12-1 |
From Clostridium histolyticum |
| D(+)-Glucose monohydrate | Millipore Corporation | K50876942 924 CAS NO. 14431-43-7 |
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| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 CAS NO. 67-68-5 |
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| Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 CAS NO. 67-42-5 |
|
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 CAS NO. 60-00-4 |
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| Forceps 11 cm. | Rustless Dumoxel | – | |
| Forceps 14 cm. | Rustless Dumoxel | – | |
| Glibenclamide | Sigma-Aldrich | G6039 CAS NO. 16673-34-0 |
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| GraphPad Prism program | Software version 5.0 (San Diego, CA, USA) | ||
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 CAS NO. 7365-45-9 |
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| Iberiotoxin | Sigma-Aldrich | I5904 CAS NO. 1002546960 |
recombinant from Mesobuthus tamulus |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 CAS NO. 53-86-1 |
|
| Labchart Program | Software version 7.0 (A.D. Instrument, Castle Hill, Australia). | ||
| Magnesium chloride | Ajax Finechem | 296 CAS NO. 1506254995 |
|
| Male Wistar rats | Nomura Siam International Co. Ltd., Bangkok, Thailand | ||
| NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) | Sigma-Aldrich | N5751 CAS NO. 51298-62-5 |
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| Nicardipine | Sigma-Aldrich | N7510 CAS NO. 54527-84-3 |
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| Organ bath 15 mL. | – | – | Specific order by the researchers |
| Papain | Sigma-Aldrich | P4762 CAS NO. 9001-73-4 |
FromPapaya Latex |
| Phenal red | Sigma-Aldrich | P5530 CAS NO. 34487-61-1 |
|
| Phenylephrine | Sigma-Aldrich | P6126 CAS NO. 61-76-7 |
|
| Potassium chloride | Kemaus | KA383 CAS NO. 7447-40-7 |
|
| Potassium dihydrogenphosphate | Aldrich Chemical | EC231-913-4 CAS NO. 7778-77-0 |
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| S+A2:E36odium chloride | Kemaus | KA465 CAS NO. 7647-14-5 |
|
| Scissors 11 cm. | Spall Stainless | – | |
| Scissors 14 cm. | Spall Stainless | – | |
| Sodium bicarbonate | Ajax Finechem | 475 CAS NO. 912466 |
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| Sodium dihydrogenphosphate | Aldrich Chemical | 33,198-8 CAS NO. 7558-80-7 |
|
| Sodium hydroxide | Ajax Finechem | 482 CAS NO. 1506196602 |
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| Sodium thiopental | Anesthal | JPN3010002 CAS NO. 1C 314/47 |
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| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 CAS NO. 107-35-7 |
|
| Waterbath WBU 45 | Memmert | 2766 CAS NO. – |
Referências
- Lyle, M. A., Davis, J. P., Brozovich, F. V. Regulation of pulmonary vascular smooth muscle contractility in pulmonary arterial hypertension: Implications for therapy. Frontiers in Physiology. 8, 614 (2017).
- Cyr, A. R., Huckaby, L. V., Shiva, S. S., Zuckerbraun, B. S. Nitric oxide and endothelial dysfunction. Critical Care Clinics. 36 (2), 307-321 (2020).
- Ruan, K. -. H. Advance in understanding the biosynthesis of prostacyclin and thromboxane A2 in the endoplasmic reticulum membrane via the cyclo-oxygenase pathway. Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 4 (6), 639-647 (2004).
- Del Pozo, R., Hernandez Gonzalez, I., Escribano-Subias, P. The prostacyclin pathway in pulmonary arterial hypertension: A clinical review. Expert Review of Respiratory Medicine. 11 (6), 491-503 (2017).
- Morgado, M., Cairrão, E., Santos-Silva, A. J., Verde, I. Cyclic nucleotide-dependent relaxation pathways in vascular smooth muscle. Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (2), 247-266 (2012).
- Schmidt, K., de Wit, C. Endothelium-derived hyperpolarizing factor and myoendothelial coupling: The in vivo perspective. Frontiers in Physiology. 11, (2020).
- Fan, G., Cui, Y., Gollasch, M., Kassmann, M. Elementary calcium signaling in arterial smooth muscle. Channels. 13 (1), 505-519 (2019).
- Wisutthathum, S., et al. Extract of Aquilaria crassna leaves and mangiferin are vasodilators while showing no cytotoxicity. Journal of Traditional and Complementary Medicine. 9 (4), 237-242 (2019).
- Kamkaew, N., Paracha, T. U., Ingkaninan, K., Waranuch, N., Chootip, K. Vasodilatory effects and mechanisms of action of Bacopa monnieri active compounds on rat mesenteric arteries. Molecules. 24 (12), 2243 (2019).
- Chootip, K., Kennedy, C., Gurney, A. Characterization of P2 receptors mediating contraction of the rat isolated pulmonary vasculature. British Journal of Pharmacology. 131, 167 (2000).
- Paracha, T. U., et al. Elucidation of vasodilation response and structure activity relationships of N2, N4-disubstituted quinazoline 2, 4-diamines in a rat pulmonary artery model. Molecules. 24 (2), 281 (2019).
- Chootip, K., Gurney, A. M., Kennedy, C. Multiple P2Y receptors couple to calcium-dependent, chloride channels in smooth muscle cells of the rat pulmonary artery. Respiratory Research. 6 (1), 1-10 (2005).
- Wisutthathum, S., et al. Eulophia macrobulbon extract relaxes rat isolated pulmonary artery and protects against monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension. Phytomedicine. 50, 157-165 (2018).
- Kruangtip, O., et al. Curcumin analogues inhibit phosphodiesterase-5 and dilate rat pulmonary arteries. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (1), 87-95 (2015).
