血管応答を調べるための肺内動脈および平滑筋細胞の分離
Summary
動脈肺循環の血管応答は、肺内動脈(IPA)および血管平滑筋細胞(VSMC)を使用して探索できます。本研究では、IPAの分離と、生理学的刺激に応答した血管弛緩の調査に使用されるプロトコルについて詳しく説明します。
Abstract
ラットの肺から単離された肺内動脈(IPA)および血管平滑筋細胞(VSMC)を使用して、血管収縮および血管弛緩の根底にあるメカニズムを研究することができます。IPAおよびVSMCを単離した後、生理学的および病理学的状態における血管応答の特徴は、神経信号、ホルモン、サイトカインなどの外因性因子がない場合に評価することができる。このように、IPAとVSMCは、薬理学的薬剤による調節、パッチクランプ電気生理学的解析、カルシウムイメージングなどのさまざまな実験的研究とともに、血管生理学/病態生理学を研究するための優れたモデルとして機能します。ここでは、IPAを単離する技術を用いて、臓器浴装置における血管応答を調べました。IPAセグメントは、管腔内ワイヤーを介して臓器浴室に取り付けられ、さまざまな薬理学的物質によって刺激されました。IPA血管緊張の変化(すなわち、血管収縮および血管弛緩)を、等尺性力トランスデューサおよび生理学的データ解析ソフトウェアプログラムを用いて記録した。私たちは、植物化学物質または合成薬の薬理学的活性を研究するための血管弛緩/血管収縮のメカニズムを調査するために適応できるいくつかの実験プロトコルを実装しました。プロトコルは、肺動脈性肺高血圧症を含むさまざまな疾患の調節における薬物の役割を評価するためにも使用できます。IPAモデルにより、薬物の薬力学的パラメータを評価する上で重要な濃度反応曲線を調べることができます。
Introduction
肺血管系は低圧血管系であり、その主な機能は脱酸素化された血液を肺のガス交換領域に送達することである。肺の肺動脈は気管支樹に平行な枝に配置され、最終的にはいくつかの肺胞にわたって連続し、最終的に細静脈と静脈に集まる毛細血管の広範なネットワークを形成します。肺動脈の血管緊張は、内皮と血管平滑筋細胞(VSMC)の間の相互作用を含むいくつかの要因によって制御されています1。
本研究では、肺内動脈(IPA)の内皮依存性および非依存性血管弛緩に焦点を当てます。内皮依存性血管弛緩に関しては、内皮細胞の表面で起こる様々なメカニズムが細胞内Ca2+濃度を増加させ(例えば、アセチルコリン[ACh]がムスカリン受容体[M3]と結合する)、一酸化窒素(NO)、プロスタサイクリン(PGl2)、および内皮由来過分極因子(EDHF)の形成につながる可能性があります(図1).NOは、内皮一酸化窒素合成酵素(eNOS)2によってL-アルギニンから合成される主要な内皮由来弛緩因子であり、内皮細胞からVSMCに解離し(図1)、可溶性グアニリルシクラーゼ(sGC)酵素を刺激します。この酵素は、グアノシン三リン酸(GTP)を環状グアノシン一リン酸(cGMP)に変え、プロテインキナーゼG(PKG)を活性化し、細胞質Ca2+レベルを低下させ、血管弛緩を引き起こします(図1)。PGl2は、シクロオキシゲナーゼ(COX)経路3,4を介して内皮細胞によって合成される。VSMC上のプロスタサイクリン受容体(IP)と結合し、アデニリルシクラーゼ(AC)酵素を刺激し、アデノシン三リン酸(ATP)を環状アデノシン一リン酸(cAMP)に変換します(図1)3,4。cAMPはプロテインキナーゼA(PKA)を活性化し、細胞質Ca2+レベルを低下させ、血管弛緩を引き起こします5(図1)。EDHF経路は、さまざまな内皮メディエーターおよび電気的イベントを介して内皮依存性血管弛緩にも関与しています。EDHF経路の活性化はVSMCの過分極をもたらし、電圧作動Ca2+チャネル(VOCC)を閉じ、細胞内Ca2+レベルを低下させ、血管弛緩を誘導します6。内皮非依存性血管弛緩は、細胞内Ca2+レベルの低下、ミオシン軽鎖キナーゼ(MLCK)の阻害、ミオシン軽鎖ホスファターゼ(MLCP)の活性化、およびVSMCの収縮機構に対するCa2+感受性の低下など、いくつかのメカニズムを介してVSMC上で直接起こる。本研究では、様々なK+チャネルの開口、VOCCの遮断、筋小胞体7からのCa2+放出の阻害による血管弛緩に焦点を当て、細胞内Ca2+レベルを低下させ、VSMCミオシン軽鎖リン酸化とミオシン-アクチン結合またはクロスブリッジ形成をそれぞれ減少させます。 最終的に血管弛緩をもたらす。
単離されたIPAにおける血管収縮および血管弛緩測定を評価する技術は、げっ歯類に対して十分に確立されていますが、データは実験プロトコルによって異なりました。本研究では、神経信号、ホルモン、サイトカイン、血圧などのin vivoでの血管反応を調節する外的要因がない場合に行われたラットIPA製剤の血管反応性をin vitroで評価するために使用された方法について説明します。
IPAの血管反応性を研究するための例として、植物抽出物を使用したいくつかの実験プロトコルを採用しました。さまざまな遮断薬(図1)を利用して、植物抽出物によって誘導される内皮依存性および非依存性の血管弛緩のメカニズムを特定しました。それにもかかわらず、同じプロトコルを、様々な肺病変の治療に使用される任意の薬物、抽出物または植物化学物質に対するIPAの血管応答を評価するために適合させることができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
本稿では、ラットIPAおよびVSMCの単離技術について述べる。イン ビトロでのIPAの血管応答を調査するためにいくつかの実験プロトコルが採用されており、植物抽出物によって誘導されるIPA血管弛緩の薬理学的効果と機構的基礎を特徴付けるために使用できます。
植物抽出物の内皮依存性血管拡張作用に関しては、L-NAME(eNOS)、インドメタシン(COX)、およびアパミン+カ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
タイ国立研究評議会、化学イノベーションセンター(PERCH-CIC)、国際研究ネットワーク(IRN61W0005)が財政支援を提供し、ナレースワン大学医科学部生理学部が研究施設を支援したことに感謝の意を表します。
Materials
| 1,4-dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632 CAS NO. 348-12-3 |
|
| 4-aminopyridine (4-AP) | Aldrich Chemical | A78403 CAS NO. 504-24-5 |
|
| Acetylcholine | Sigma-Aldrich | A6625 CAS NO. 60-31-1 |
|
| Apamin | Sigma-Aldrich | A9459 CAS NO. 24345-16-2 |
|
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 CAS NO. 9048-46-8 |
|
| Calcium choride | Ajax Finechem | AJA960 CAS NO. 1707055184 |
|
| Charybdotoxin | Sigma-Aldrich | C7802 CAS NO. 95751-30-7 |
|
| Collagenase type 1A | Sigma-Aldrich | C9891 CAS NO. 9001-12-1 |
From Clostridium histolyticum |
| D(+)-Glucose monohydrate | Millipore Corporation | K50876942 924 CAS NO. 14431-43-7 |
|
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 CAS NO. 67-68-5 |
|
| Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 CAS NO. 67-42-5 |
|
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 CAS NO. 60-00-4 |
|
| Forceps 11 cm. | Rustless Dumoxel | – | |
| Forceps 14 cm. | Rustless Dumoxel | – | |
| Glibenclamide | Sigma-Aldrich | G6039 CAS NO. 16673-34-0 |
|
| GraphPad Prism program | Software version 5.0 (San Diego, CA, USA) | ||
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 CAS NO. 7365-45-9 |
|
| Iberiotoxin | Sigma-Aldrich | I5904 CAS NO. 1002546960 |
recombinant from Mesobuthus tamulus |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 CAS NO. 53-86-1 |
|
| Labchart Program | Software version 7.0 (A.D. Instrument, Castle Hill, Australia). | ||
| Magnesium chloride | Ajax Finechem | 296 CAS NO. 1506254995 |
|
| Male Wistar rats | Nomura Siam International Co. Ltd., Bangkok, Thailand | ||
| NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) | Sigma-Aldrich | N5751 CAS NO. 51298-62-5 |
|
| Nicardipine | Sigma-Aldrich | N7510 CAS NO. 54527-84-3 |
|
| Organ bath 15 mL. | – | – | Specific order by the researchers |
| Papain | Sigma-Aldrich | P4762 CAS NO. 9001-73-4 |
FromPapaya Latex |
| Phenal red | Sigma-Aldrich | P5530 CAS NO. 34487-61-1 |
|
| Phenylephrine | Sigma-Aldrich | P6126 CAS NO. 61-76-7 |
|
| Potassium chloride | Kemaus | KA383 CAS NO. 7447-40-7 |
|
| Potassium dihydrogenphosphate | Aldrich Chemical | EC231-913-4 CAS NO. 7778-77-0 |
|
| S+A2:E36odium chloride | Kemaus | KA465 CAS NO. 7647-14-5 |
|
| Scissors 11 cm. | Spall Stainless | – | |
| Scissors 14 cm. | Spall Stainless | – | |
| Sodium bicarbonate | Ajax Finechem | 475 CAS NO. 912466 |
|
| Sodium dihydrogenphosphate | Aldrich Chemical | 33,198-8 CAS NO. 7558-80-7 |
|
| Sodium hydroxide | Ajax Finechem | 482 CAS NO. 1506196602 |
|
| Sodium thiopental | Anesthal | JPN3010002 CAS NO. 1C 314/47 |
|
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 CAS NO. 107-35-7 |
|
| Waterbath WBU 45 | Memmert | 2766 CAS NO. – |
Referências
- Lyle, M. A., Davis, J. P., Brozovich, F. V. Regulation of pulmonary vascular smooth muscle contractility in pulmonary arterial hypertension: Implications for therapy. Frontiers in Physiology. 8, 614 (2017).
- Cyr, A. R., Huckaby, L. V., Shiva, S. S., Zuckerbraun, B. S. Nitric oxide and endothelial dysfunction. Critical Care Clinics. 36 (2), 307-321 (2020).
- Ruan, K. -. H. Advance in understanding the biosynthesis of prostacyclin and thromboxane A2 in the endoplasmic reticulum membrane via the cyclo-oxygenase pathway. Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 4 (6), 639-647 (2004).
- Del Pozo, R., Hernandez Gonzalez, I., Escribano-Subias, P. The prostacyclin pathway in pulmonary arterial hypertension: A clinical review. Expert Review of Respiratory Medicine. 11 (6), 491-503 (2017).
- Morgado, M., Cairrão, E., Santos-Silva, A. J., Verde, I. Cyclic nucleotide-dependent relaxation pathways in vascular smooth muscle. Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (2), 247-266 (2012).
- Schmidt, K., de Wit, C. Endothelium-derived hyperpolarizing factor and myoendothelial coupling: The in vivo perspective. Frontiers in Physiology. 11, (2020).
- Fan, G., Cui, Y., Gollasch, M., Kassmann, M. Elementary calcium signaling in arterial smooth muscle. Channels. 13 (1), 505-519 (2019).
- Wisutthathum, S., et al. Extract of Aquilaria crassna leaves and mangiferin are vasodilators while showing no cytotoxicity. Journal of Traditional and Complementary Medicine. 9 (4), 237-242 (2019).
- Kamkaew, N., Paracha, T. U., Ingkaninan, K., Waranuch, N., Chootip, K. Vasodilatory effects and mechanisms of action of Bacopa monnieri active compounds on rat mesenteric arteries. Molecules. 24 (12), 2243 (2019).
- Chootip, K., Kennedy, C., Gurney, A. Characterization of P2 receptors mediating contraction of the rat isolated pulmonary vasculature. British Journal of Pharmacology. 131, 167 (2000).
- Paracha, T. U., et al. Elucidation of vasodilation response and structure activity relationships of N2, N4-disubstituted quinazoline 2, 4-diamines in a rat pulmonary artery model. Molecules. 24 (2), 281 (2019).
- Chootip, K., Gurney, A. M., Kennedy, C. Multiple P2Y receptors couple to calcium-dependent, chloride channels in smooth muscle cells of the rat pulmonary artery. Respiratory Research. 6 (1), 1-10 (2005).
- Wisutthathum, S., et al. Eulophia macrobulbon extract relaxes rat isolated pulmonary artery and protects against monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension. Phytomedicine. 50, 157-165 (2018).
- Kruangtip, O., et al. Curcumin analogues inhibit phosphodiesterase-5 and dilate rat pulmonary arteries. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (1), 87-95 (2015).
