화학감수성 검사를 위한 췌장암의 Zebrafish 환자 유래 이종이식편 구축
Summary
전임상 모델은 암 생물학에 대한 지식을 발전시키고 치료 효능을 예측하는 것을 목표로 합니다. 이 논문은 종양 조직 조각이 있는 제브라피쉬 기반 환자 유래 이종이식(zPDX)의 생성에 대해 설명합니다. zPDX는 화학 요법으로 치료되었으며, 이식 된 조직의 세포 사멸 측면에서 치료 효과를 평가했습니다.
Abstract
암은 전 세계적으로 주요 사망 원인 중 하나이며 많은 유형의 암 발병률이 계속 증가하고 있습니다. 선별, 예방 및 치료 측면에서 많은 진전이 이루어졌습니다. 그러나 암 환자의 화학감수성 프로파일을 예측하는 전임상 모델은 아직 부족하다. 이 격차를 메우기 위해 생체 내 환자 유래 이종이식 모델을 개발하고 검증했습니다. 이 모델은 수정 후 2일째의 제브라피쉬 (Danio rerio) 배아를 기반으로 했으며, 이는 환자의 수술 표본에서 채취한 종양 조직의 이종이식 단편의 수용자로 사용되었습니다.
또한 종양 거동 및 치료에 대한 반응 분석 측면에서 중요한 종양 미세 환경을 유지하기 위해 바이옵틱 샘플이 소화되거나 분해되지 않았다는 점도 주목할 가치가 있습니다. 이 프로토콜은 원발성 고형 종양 외과적 절제술에서 제브라피쉬 기반 환자 유래 이종이식(zPDX)을 확립하는 방법을 자세히 설명합니다. 해부병리학자가 스크리닝한 후 메스 칼날을 사용하여 표본을 해부합니다. 괴사 조직, 혈관 또는 지방 조직을 제거한 다음 0.3mm x 0.3mm x 0.3mm 조각으로 자릅니다.
그런 다음 조각은 형광으로 표지되고 제브라피쉬 배아의 perivitelline 공간에 이종 이식됩니다. 많은 수의 배아를 저렴한 비용으로 처리할 수 있어 여러 항암제에 대한 zPDX의 화학민감도에 대한 생체 내 고처리량 분석이 가능합니다. 공초점 이미지는 대조군과 비교하여 화학 요법 치료에 의해 유도된 세포사멸 수준을 감지하고 정량화하기 위해 일상적으로 획득됩니다. 이종이식 시술은 하루 만에 완료할 수 있어 공동 임상 시험을 위한 치료 스크리닝을 수행할 수 있는 합리적인 시간 창을 제공하기 때문에 상당한 시간 이점이 있습니다.
Introduction
임상암 연구의 문제점 중 하나는 암이 하나의 질병이 아니라 시간이 지남에 따라 진화할 수 있는 다양한 질병으로 종양 자체와 환자의 특성에 따라 구체적인 치료가 필요하다는 점이다1. 결과적으로, 암 치료 결과의 조기 예측을 위한 새로운 개인화된 전략을 식별하기 위해 환자 중심의 암 연구로 나아가는 것이 과제입니다2. 이것은 5년 생존율이 11%3로 치료하기 어려운 암으로 간주되기 때문에 췌관 선암종(PDAC)과 특히 관련이 있습니다.
늦은 진단, 빠른 진행 및 효과적인 치료법의 부족은 PDAC의 가장 시급한 임상 문제로 남아 있습니다. 따라서 주요 과제는 환자를 모델링하고 개인화 된 의학 4,5,6에 따라 가장 효과적인 치료법을 선택하기 위해 클리닉에 적용 할 수있는 바이오 마커를 식별하는 것입니다. 시간이 지남에 따라 암 질환을 모델링하기 위한 새로운 접근 방식이 제안되었습니다: 환자 유래 오가노이드(PDO) 및 마우스 환자 유래 이종이식(mPDX)은 인간 종양 조직의 출처에서 유래했습니다. 그들은 질병 재발뿐만 아니라 치료에 대한 반응과 저항성을 연구하기 위해 질병을 재현하는 데 사용되었습니다 7,8,9.
유사하게, 제브라피쉬 기반 환자 유래 이종이식(zPDX) 모델에 대한 관심은 독특하고 유망한 특성10 덕분에 증가했으며, 이는 암 연구를 위한 빠르고 저렴한 도구임을 나타냅니다11,12. zPDX 모델은 작은 종양 샘플 크기만 필요로 하므로 화학요법의 고처리량 스크리닝이 가능합니다13. zPDX 모델에 사용되는 가장 일반적인 기술은 종양을 부분적으로 재현하는 일차 세포 집단의 완전한 샘플 소화 및 이식을 기반으로 하지만, 종양 미세 환경이 부족하고 악성 세포와 건강한 세포 간의 누화라는 단점이 있다14.
이 연구는 zPDX가 췌장암 환자의 화학감수성 프로파일을 식별하기 위한 전임상 모델로 어떻게 사용될 수 있는지 보여줍니다. 귀중한 전략은 세포 확장이 필요 없기 때문에 이종 이식 과정을 용이하게하여 화학 요법 스크리닝을 가속화 할 수 있습니다. 이 모델의 강점은 모든 미세환경 성분이 환자의 암 조직 내에 있는 그대로 유지된다는 것인데, 그 이유는 잘 알려진 바와 같이, 종양의 거동이 이들의 상호작용에 의존하기 때문이다15,16. 이는 종양 이질성을 보존하고 환자별 방식으로 치료 결과 및 재발의 예측 가능성을 개선하는 데 기여할 수 있으므로 zPDX 모델을 공동 임상 시험에 사용할 수 있기 때문에 문헌의 대체 방법에 비해 매우 유리합니다. 이 원고는 환자의 종양 절제술로 시작하여 화학 요법에 대한 반응을 분석하기 위해 치료하는 zPDX 모델을 만드는 단계를 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
암 연구의 생체 내 모델은 암 생물학을 이해하고 암 치료 반응을 예측하는 데 매우 유용한 도구를 제공합니다. 현재, 상이한 생체내 모델, 예를 들어 유전자 변형 동물(형질전환 및 녹아웃 마우스) 또는 인간 일차 세포로부터의 환자 유래 이종이식(heterografts)을 이용할 수 있다. 많은 최적의 기능에도 불구하고 각 기능에는 다양한 제한 사항이 있습니다. 특히, 전술한 모델은 환자의 종?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 Fondazione Pisa(프로젝트 114/16)에서 자금을 지원했습니다. 저자는 환자 샘플 선택 및 병리학 지원에 대해 Azienda Ospedaliera Pisana의 조직 병리학 부서의 Raffaele Gaeta에게 감사드립니다. 또한 실험에 대한 기술 지원에 대해 Alessia Galante에게 감사드립니다. 이 기사는 COST(European Cooperation in Science and Technology)의 지원을 받는 COST Action TRANSPAN, CA21116의 작업을 기반으로 합니다.
Materials
| 5-fluorouracil | Teva Pharma AG | SMP 1532755 | |
| 48 multiwell plate | Sarstedt | 83 3923 | |
| 96 multiwell plate | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Acetone | Merck | 179124 | |
| Agarose powder | Merck | A9539 | |
| Amphotericin | Thermo Fisher Scientific | 15290018 | |
| Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1 | Merck | MAB1281 | 1:200 dilution |
| Aquarium net QN6 | Penn-plax | 0-30172-23006-6 | |
| BSA | Merck | A9418 | |
| CellTrace | Thermo Fisher Scientific | C34567 | |
| CellTracker CM-DiI | Thermo Fisher Scientific | C7001 | |
| CellTracker Deep Red | Thermo Fisher Scientific | C34565 | |
| Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 9661S | 1:250 dilution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | PanReac AppliChem ITW Reagents | A3672,0250 | |
| Dumont #5 forceps | World Precision Instruments | 501985 | |
| Folinic acid - Lederfolin | Pfizer | ||
| Glass capillaries, 3.5" | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | Outer diameter = 1.14 mm. Inner diameter = 0.53 mm. |
| Glass vials | VWR International | WHEAW224581 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A-21244 | 1:500 dilution |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | 31872 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Irinotecan | Hospira | ||
| Low Temperature Freezer Vials | VWR International | 479-1220 | |
| McIlwain Tissue Chopper | World Precision Instruments | ||
| Microplate Mixer | SCILOGEX | 822000049999 | |
| Oxaliplatin | Teva | ||
| Paraformaldehyde | Merck | P6148-500G | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri dish 100 mm | Sarstedt | 83 3902500 | |
| Petri dish 60 mm | Sarstedt | 83 3901 | |
| Plastic Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171.010 | |
| Poly-Mount | Tebu-bio | 18606-5 | |
| Propidium iodide | Merck | P4170 | |
| RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel | VWR International | SWAN3001 | |
| Scalpel handle #3 | World Precision Instruments | 500236 | |
| Tricaine | Merck | E10521 | |
| Triton X-100 | Merck | T8787 | |
| Tween 20 | Merck | P9416 | |
| Vertical Micropipette Puller | Shutter instrument | P-30 |
Referências
- Rubin, H. Understanding cancer. Science. 219 (4589), 1170-1172 (1983).
- Krzyszczyk, P., et al. The growing role of precision and personalized medicine for cancer treatment. Technology. 6 (3-4), 79-100 (2018).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. Cancer statistics, 2022. CA Cancer Journal for Clinicians. 72 (1), 7-33 (2022).
- Trunk, A., et al. Emerging treatment strategies in pancreatic cancer. Pancreas. 50 (6), 773-787 (2021).
- Moffat, G. T., Epstein, A. S., O’Reilly, E. M. Pancreatic cancer-A disease in need: Optimizing and integrating supportive care. Cancer. 125 (22), 3927-3935 (2019).
- Sarantis, P., Koustas, E., Papadimitropoulou, A., Papavassiliou, A. G., Karamouzis, M. V. Pancreatic ductal adenocarcinoma: Treatment hurdles, tumor microenvironment and immunotherapy. World Journal of Gastrointestinal Oncology. 12 (2), 173-181 (2020).
- Marshall, L. J., Triunfol, M., Seidle, T. Patient-derived xenograft vs. organoids: a preliminary analysis of cancer research output, funding and human health impact in 2014-2019. Animals. 10 (10), 1923 (2020).
- Li, Y., Tang, P., Cai, S., Peng, J., Hua, G. Organoid based personalized medicine: from bench to bedside. Cell Regeneration. 9 (1), 21 (2020).
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The generation and application of patient-derived xenograft model for cancer research. Cancer Research and Treatment. 50 (1), 1-10 (2018).
- Rizzo, G., Bertotti, A., Leto, S. M., Vetrano, S. Patient-derived tumor models: a more suitable tool for pre-clinical studies in colorectal cancer. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 40 (1), 178 (2021).
- Usai, A., et al. Zebrafish patient-derived xenografts identify chemo-response in pancreatic ductal adenocarcinoma patients. Cancers. 13 (16), 4131 (2021).
- Usai, A., et al. A model of a zebrafish avatar for co-clinical trials. Cancers. 12 (3), 677 (2020).
- Chen, X., Li, Y., Yao, T., Jia, R. Benefits of zebrafish xenograft models in cancer research. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 616551 (2021).
- Miserocchi, G., et al. Management and potentialities of primary cancer cultures in preclinical and translational studies. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 229 (2017).
- Baghban, R., et al. Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 59 (2020).
- Albini, A., et al. Cancer stem cells and the tumor microenvironment: interplay in tumor heterogeneity. Connective Tissue Research. 56 (5), 414-425 (2015).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Tavares Barroso, M., et al. Establishment of pancreatobiliary cancer zebrafish avatars for chemotherapy screening. Cells. 10 (8), 2077 (2021).
- Kopetz, S., Lemos, R., Powis, G. The promise of patient-derived xenografts: the best laid plans of mice and men. Clinical Cancer Research. 18 (19), 5160-5162 (2012).
- Xing, F., Saidou, J., Watabe, K. Cancer associated fibroblasts (CAFs) in tumor microenvironment. Frontiers in Bioscience. 15 (1), 166-179 (2010).
- Strähle, U., et al. Zebrafish embryos as an alternative to animal experiments-a commentary on the definition of the onset of protected life stages in animal welfare regulations. Reproductive Toxicology. 33 (2), 128-132 (2012).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
