Создание ксенотрансплантатов, полученных от пациентов с рыбками данио, из рака поджелудочной железы для тестирования на химиочувствительность
Summary
Доклинические модели направлены на расширение знаний о биологии рака и прогнозирование эффективности лечения. В этой статье описывается генерация ксенотрансплантатов пациента (zPDX) на основе рыбок данио-рерио с фрагментами опухолевой ткани. Лечение zPDX проводили химиотерапией, терапевтический эффект которой оценивали с точки зрения клеточного апоптоза трансплантированной ткани.
Abstract
Рак является одной из основных причин смерти во всем мире, и заболеваемость многими видами рака продолжает расти. Значительный прогресс был достигнут с точки зрения скрининга, профилактики и лечения; Тем не менее, доклинические модели, которые предсказывают профиль химиочувствительности онкологических больных, все еще отсутствуют. Чтобы восполнить этот пробел, была разработана и проверена модель ксенотрансплантата, полученная от пациента in vivo . Модель была основана на эмбрионах рыбок данио-рерио (Danio rerio) через 2 дня после оплодотворения, которые использовались в качестве реципиентов ксенотрансплантатных фрагментов опухолевой ткани, взятых из хирургического образца пациента.
Также стоит отметить, что биоптические образцы не были переварены или дезагрегированы, чтобы сохранить микроокружение опухоли, что имеет решающее значение с точки зрения анализа поведения опухоли и ответа на терапию. В протоколе подробно описан метод получения ксенотрансплантатов пациента (zPDX) на основе рыбок данио-рерио после хирургической резекции первичной солидной опухоли. После скрининга у анатомопатолога образец препарируют с помощью лезвия скальпеля. Некротизированная ткань, сосуды или жировая ткань удаляются, а затем измельчаются на кусочки размером 0,3 мм x 0,3 мм x 0,3 мм.
Затем кусочки флуоресцентно маркируют и ксенотрансплантируют в перивителлиновое пространство эмбрионов рыбок данио. Большое количество эмбрионов может быть обработано с низкими затратами, что позволяет проводить высокопроизводительный анализ in vivo химиочувствительности zPDX к нескольким противоопухолевым препаратам. Конфокальные изображения обычно получаются для обнаружения и количественной оценки уровней апоптоза, вызванных химиотерапией, по сравнению с контрольной группой. Процедура ксенотрансплантата имеет значительное преимущество во времени, поскольку она может быть завершена за один день, что обеспечивает разумное временное окно для проведения терапевтического скрининга для совместных клинических испытаний.
Introduction
Одна из проблем клинических исследований рака заключается в том, что рак – это не отдельное заболевание, а множество различных заболеваний, которые могут развиваться с течением времени, требуя специфических методов лечения в зависимости от особенностей самой опухолии пациента1. Следовательно, задача состоит в том, чтобы перейти к исследованиям рака, ориентированным на пациента, чтобы определить новые персонализированные стратегии для раннего прогнозирования результатов лечения рака2. Это особенно актуально для аденокарциномы протоков поджелудочной железы (PDAC), поскольку она считается трудно поддающимся лечению раком с 5-летней выживаемостью 11%3.
Поздняя диагностика, быстрое прогрессирование и отсутствие эффективных методов лечения остаются наиболее актуальными клиническими проблемами PDAC. Таким образом, основная задача состоит в том, чтобы смоделировать пациента и определить биомаркеры, которые могут быть применены в клинике, чтобы выбрать наиболее эффективную терапию в соответствии с персонализированной медициной 4,5,6. Со временем были предложены новые подходы к моделированию раковых заболеваний: органоиды, полученные от пациента (PDO), и ксенотрансплантаты, полученные от пациентов от мышей (mPDX), происходят из источника опухолевой ткани человека. Они были использованы для воспроизведения заболевания для изучения ответа и резистентности к терапии, а также рецидива заболевания 7,8,9.
Аналогичным образом, возрос интерес к моделям ксенотрансплантатов, полученных из пациентов (zPDX) на основе рыбок данио, благодаря их уникальным и многообещающим характеристикам10, представляющим собой быстрый и недорогой инструмент для исследования рака11,12. Модели zPDX требуют лишь небольшого размера выборки опухоли, что делает возможным высокопроизводительный скрининг химиотерапии13. Наиболее распространенный метод, используемый для моделей zPDX, основан на полном переваривании образца и имплантации первичных клеточных популяций, что частично воспроизводит опухоль, но имеет недостатки в виде отсутствия микроокружения опухоли и перекрестных помех между злокачественными и здоровыми клетками14.
Эта работа показывает, как zPDX могут быть использованы в качестве доклинической модели для определения профиля химиочувствительности пациентов с раком поджелудочной железы. Ценная стратегия облегчает процесс ксенотрансплантата, поскольку нет необходимости в расширении клеток, что позволяет ускорить химиотерапевтический скрининг. Сила модели заключается в том, что все компоненты микроокружения сохраняются в том виде, в каком они находятся в раковой ткани пациента, поскольку, как известно, поведение опухоли зависит от их взаимодействия15,16. Это очень выгодно по сравнению с альтернативными методами в литературе, поскольку можно сохранить гетерогенность опухоли и способствовать улучшению предсказуемости исхода лечения и рецидива в зависимости от конкретного пациента, что позволяет использовать модель zPDX в совместных клинических испытаниях. В этой рукописи описываются этапы, связанные с созданием модели zPDX, начиная с фрагмента резекции опухоли пациента и его лечения для анализа ответа на химиотерапию.
Protocol
Representative Results
Discussion
Модели in vivo в исследованиях рака предоставляют бесценные инструменты для понимания биологии рака и прогнозирования ответа на лечение рака. В настоящее время доступны различные модели in vivo , например, генетически модифицированные животные (трансгенные и нокаутные мыши) или кс…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась Фондом Пизы (проект 114/16). Авторы хотели бы поблагодарить Раффаэле Гаэту из отделения гистопатологии Azienda Ospedaliera Pisana за отбор образцов пациентов и поддержку патологии. Мы также благодарим Алессию Галанте за техническую поддержку в экспериментах. Эта статья основана на работе COST Action TRANSPAN, CA21116, при поддержке COST (Европейское сотрудничество в области науки и техники).
Materials
| 5-fluorouracil | Teva Pharma AG | SMP 1532755 | |
| 48 multiwell plate | Sarstedt | 83 3923 | |
| 96 multiwell plate | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Acetone | Merck | 179124 | |
| Agarose powder | Merck | A9539 | |
| Amphotericin | Thermo Fisher Scientific | 15290018 | |
| Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1 | Merck | MAB1281 | 1:200 dilution |
| Aquarium net QN6 | Penn-plax | 0-30172-23006-6 | |
| BSA | Merck | A9418 | |
| CellTrace | Thermo Fisher Scientific | C34567 | |
| CellTracker CM-DiI | Thermo Fisher Scientific | C7001 | |
| CellTracker Deep Red | Thermo Fisher Scientific | C34565 | |
| Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 9661S | 1:250 dilution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | PanReac AppliChem ITW Reagents | A3672,0250 | |
| Dumont #5 forceps | World Precision Instruments | 501985 | |
| Folinic acid - Lederfolin | Pfizer | ||
| Glass capillaries, 3.5" | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | Outer diameter = 1.14 mm. Inner diameter = 0.53 mm. |
| Glass vials | VWR International | WHEAW224581 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A-21244 | 1:500 dilution |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | 31872 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Irinotecan | Hospira | ||
| Low Temperature Freezer Vials | VWR International | 479-1220 | |
| McIlwain Tissue Chopper | World Precision Instruments | ||
| Microplate Mixer | SCILOGEX | 822000049999 | |
| Oxaliplatin | Teva | ||
| Paraformaldehyde | Merck | P6148-500G | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri dish 100 mm | Sarstedt | 83 3902500 | |
| Petri dish 60 mm | Sarstedt | 83 3901 | |
| Plastic Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171.010 | |
| Poly-Mount | Tebu-bio | 18606-5 | |
| Propidium iodide | Merck | P4170 | |
| RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel | VWR International | SWAN3001 | |
| Scalpel handle #3 | World Precision Instruments | 500236 | |
| Tricaine | Merck | E10521 | |
| Triton X-100 | Merck | T8787 | |
| Tween 20 | Merck | P9416 | |
| Vertical Micropipette Puller | Shutter instrument | P-30 |
Referências
- Rubin, H. Understanding cancer. Science. 219 (4589), 1170-1172 (1983).
- Krzyszczyk, P., et al. The growing role of precision and personalized medicine for cancer treatment. Technology. 6 (3-4), 79-100 (2018).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. Cancer statistics, 2022. CA Cancer Journal for Clinicians. 72 (1), 7-33 (2022).
- Trunk, A., et al. Emerging treatment strategies in pancreatic cancer. Pancreas. 50 (6), 773-787 (2021).
- Moffat, G. T., Epstein, A. S., O’Reilly, E. M. Pancreatic cancer-A disease in need: Optimizing and integrating supportive care. Cancer. 125 (22), 3927-3935 (2019).
- Sarantis, P., Koustas, E., Papadimitropoulou, A., Papavassiliou, A. G., Karamouzis, M. V. Pancreatic ductal adenocarcinoma: Treatment hurdles, tumor microenvironment and immunotherapy. World Journal of Gastrointestinal Oncology. 12 (2), 173-181 (2020).
- Marshall, L. J., Triunfol, M., Seidle, T. Patient-derived xenograft vs. organoids: a preliminary analysis of cancer research output, funding and human health impact in 2014-2019. Animals. 10 (10), 1923 (2020).
- Li, Y., Tang, P., Cai, S., Peng, J., Hua, G. Organoid based personalized medicine: from bench to bedside. Cell Regeneration. 9 (1), 21 (2020).
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The generation and application of patient-derived xenograft model for cancer research. Cancer Research and Treatment. 50 (1), 1-10 (2018).
- Rizzo, G., Bertotti, A., Leto, S. M., Vetrano, S. Patient-derived tumor models: a more suitable tool for pre-clinical studies in colorectal cancer. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 40 (1), 178 (2021).
- Usai, A., et al. Zebrafish patient-derived xenografts identify chemo-response in pancreatic ductal adenocarcinoma patients. Cancers. 13 (16), 4131 (2021).
- Usai, A., et al. A model of a zebrafish avatar for co-clinical trials. Cancers. 12 (3), 677 (2020).
- Chen, X., Li, Y., Yao, T., Jia, R. Benefits of zebrafish xenograft models in cancer research. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 616551 (2021).
- Miserocchi, G., et al. Management and potentialities of primary cancer cultures in preclinical and translational studies. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 229 (2017).
- Baghban, R., et al. Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 59 (2020).
- Albini, A., et al. Cancer stem cells and the tumor microenvironment: interplay in tumor heterogeneity. Connective Tissue Research. 56 (5), 414-425 (2015).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Tavares Barroso, M., et al. Establishment of pancreatobiliary cancer zebrafish avatars for chemotherapy screening. Cells. 10 (8), 2077 (2021).
- Kopetz, S., Lemos, R., Powis, G. The promise of patient-derived xenografts: the best laid plans of mice and men. Clinical Cancer Research. 18 (19), 5160-5162 (2012).
- Xing, F., Saidou, J., Watabe, K. Cancer associated fibroblasts (CAFs) in tumor microenvironment. Frontiers in Bioscience. 15 (1), 166-179 (2010).
- Strähle, U., et al. Zebrafish embryos as an alternative to animal experiments-a commentary on the definition of the onset of protected life stages in animal welfare regulations. Reproductive Toxicology. 33 (2), 128-132 (2012).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
