Kemosensitivite Testi için Pankreas Kanserinden Zebra Balığı Hasta Kaynaklı Ksenogreftlerin Kurulması
Summary
Preklinik modeller, kanser biyolojisi bilgisini ilerletmeyi ve tedavi etkinliğini öngörmeyi amaçlamaktadır. Bu yazıda, zebra balığı bazlı hasta kaynaklı ksenogreftlerin (zPDX’ler) tümör doku fragmanları ile üretilmesi açıklanmaktadır. zPDX’ler, terapötik etkisi nakledilen dokunun hücre apoptozu açısından değerlendirilen kemoterapi ile tedavi edildi.
Abstract
Kanser, dünya çapında başlıca ölüm nedenlerinden biridir ve birçok kanser türünün görülme sıklığı artmaya devam etmektedir. Tarama, önleme ve tedavi açısından çok ilerleme kaydedilmiştir; Bununla birlikte, kanser hastalarının kemosensitivite profilini öngören preklinik modeller hala eksiktir. Bu boşluğu doldurmak için, in vivo hasta kaynaklı bir ksenogreft modeli geliştirildi ve doğrulandı. Model, döllenmeden 2 gün sonra zebra balığı (Danio rerio) embriyolarına dayanıyordu ve bunlar bir hastanın cerrahi örneğinden alınan tümör dokusunun ksenogreft parçalarının alıcıları olarak kullanıldı.
Ayrıca, tümör davranışını ve tedaviye yanıtı analiz etmek açısından çok önemli olan tümör mikroçevresini korumak için bioptik örneklerin sindirilmediğini veya ayrıştırılmadığını da belirtmek gerekir. Protokol, primer solid tümör cerrahi rezeksiyonundan zebra balığı bazlı hasta kaynaklı ksenogreftler (zPDX’ler) oluşturmak için bir yöntemi detaylandırmaktadır. Bir anatomopatolog tarafından tarandıktan sonra, örnek bir neşter bıçağı kullanılarak diseke edilir. Nekrotik doku, damarlar veya yağ dokusu çıkarılır ve daha sonra 0,3 mm x 0,3 mm x 0,3 mm parçalar halinde doğranır.
Parçalar daha sonra floresan olarak etiketlenir ve zebra balığı embriyolarının perivitelin boşluğuna ksenotransplante edilir. Çok sayıda embriyo düşük maliyetle işlenebilir, bu da zPDX’lerin çoklu antikanser ilaçlarına karşı kemosensitivitesinin yüksek verimli in vivo analizlerini sağlar. Konfokal görüntüler, kontrol grubuna kıyasla kemoterapi tedavisinin neden olduğu apoptotik seviyeleri tespit etmek ve ölçmek için rutin olarak edinilir. Ksenograft prosedürü önemli bir zaman avantajına sahiptir, çünkü tek bir günde tamamlanabilir ve ortak klinik çalışmalar için terapötik bir tarama yapmak için makul bir zaman aralığı sağlar.
Introduction
Klinik kanser araştırmalarının sorunlarından biri, kanserin tek bir hastalık değil, zamanla gelişebilen, tümörün kendisinin ve hastanın özelliklerine bağlı olarak spesifik tedaviler gerektiren çeşitli farklı hastalıklar olmasıdır1. Sonuç olarak, zorluk, kanser tedavisi sonuçlarının erken tahmini için yeni kişiselleştirilmiş stratejiler belirlemek amacıyla hasta odaklı kanser araştırmalarına doğru ilerlemektir2. Bu özellikle pankreatik duktal adenokarsinom (PDAC) ile ilgilidir, çünkü 5 yıllık sağkalım oranı% 11 olan tedavisi zor bir kanser olarak kabul edilir3.
Geç tanı, hızlı ilerleme ve etkili tedavilerin eksikliği PDAK’nın en acil klinik sorunları olmaya devam etmektedir. Bu nedenle asıl zorluk, hastayı modellemek ve kişiselleştirilmiştıp 4,5,6 doğrultusunda en etkili tedaviyi seçmek için klinikte uygulanabilecek biyobelirteçleri tanımlamaktır. Zamanla, kanser hastalıklarını modellemek için yeni yaklaşımlar önerilmiştir: hasta kaynaklı organoidler (PDO’lar) ve fare hasta kaynaklı ksenogreftler (mPDX’ler) bir insan tümör dokusu kaynağından kaynaklanmaktadır. Hastalığın nüksünün yanı sıra tedaviye yanıtı ve direnci incelemek için hastalığı çoğaltmak için kullanılmıştır 7,8,9.
Benzer şekilde, zebra balığı bazlı hasta kaynaklı ksenogreft (zPDX) modellerine olan ilgi, kanser araştırmaları için hızlı ve düşük maliyetli bir aracı temsil eden benzersiz ve umut verici özelliklerisayesinde artmıştır10 11,12. zPDX modelleri sadece küçük bir tümör numune boyutu gerektirir, bu da kemoterapinin yüksek verimli taramasını mümkün kılar13. zPDX modelleri için kullanılan en yaygın teknik, tümörü kısmen yeniden üreten, ancak tümör mikroçevresi eksikliği ve malign ve sağlıklı hücreler arasındaki çapraz iletişimin dezavantajlarına sahip olan birincil hücre popülasyonlarının tam numune sindirimine ve implantasyonuna dayanır14.
Bu çalışma, zPDX’lerin pankreas kanseri hastalarının kemosensitivite profilini tanımlamak için klinik öncesi bir model olarak nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Değerli strateji, ksenograft işlemini kolaylaştırır, çünkü hücre genişlemesine gerek yoktur, bu da kemoterapi taramasının hızlanmasına izin verir. Modelin gücü, tüm mikro çevre bileşenlerinin hasta kanser dokusunda olduğu gibi korunmasıdır, çünkü iyi bilindiği gibi, tümörün davranışı etkileşimlerine bağlıdır15,16. Bu, literatürdeki alternatif yöntemlere göre oldukça elverişlidir, çünkü tümör heterojenliğini korumak ve tedavi sonucunun ve nüksün hastaya özgü bir şekilde öngörülebilirliğinin iyileştirilmesine katkıda bulunmak mümkündür, böylece zPDX modelinin koklinik çalışmalarda kullanılmasını sağlar. Bu makalede, bir parça hasta tümör rezeksiyonu ile başlayarak ve kemoterapiye yanıtı analiz etmek için tedavi edilerek zPDX modelinin yapımında yer alan adımlar açıklanmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kanser araştırmalarındaki in vivo modeller, kanser biyolojisini anlamak ve kanser tedavisi yanıtını tahmin etmek için paha biçilmez araçlar sağlar. Şu anda, farklı in vivo modeller mevcuttur, örneğin, genetiği değiştirilmiş hayvanlar (transgenik ve nakavt fareler) veya insan birincil hücrelerinden hasta kaynaklı ksenogreftler. Birçok optimum özelliğe rağmen, her birinin çeşitli sınırlamaları vardır. Özellikle, yukarıda belirtilen modeller, hastanın tümör dokusu mikroç…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Fondazione Pisa tarafından finanse edildi (proje 114/16). Yazarlar, hasta örneklem seçimi ve patoloji desteği için Azienda Ospedaliera Pisana Histopatoloji Birimi’nden Raffaele Gaeta’ya teşekkür eder. Ayrıca Alessia Galante’ye deneylerdeki teknik desteği için teşekkür ederiz. Bu makale, COST (European Cooperation in Science and Technology) tarafından desteklenen COST Action TRANSPAN, CA21116’in çalışmalarına dayanmaktadır.
Materials
| 5-fluorouracil | Teva Pharma AG | SMP 1532755 | |
| 48 multiwell plate | Sarstedt | 83 3923 | |
| 96 multiwell plate | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Acetone | Merck | 179124 | |
| Agarose powder | Merck | A9539 | |
| Amphotericin | Thermo Fisher Scientific | 15290018 | |
| Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1 | Merck | MAB1281 | 1:200 dilution |
| Aquarium net QN6 | Penn-plax | 0-30172-23006-6 | |
| BSA | Merck | A9418 | |
| CellTrace | Thermo Fisher Scientific | C34567 | |
| CellTracker CM-DiI | Thermo Fisher Scientific | C7001 | |
| CellTracker Deep Red | Thermo Fisher Scientific | C34565 | |
| Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 9661S | 1:250 dilution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | PanReac AppliChem ITW Reagents | A3672,0250 | |
| Dumont #5 forceps | World Precision Instruments | 501985 | |
| Folinic acid - Lederfolin | Pfizer | ||
| Glass capillaries, 3.5" | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | Outer diameter = 1.14 mm. Inner diameter = 0.53 mm. |
| Glass vials | VWR International | WHEAW224581 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A-21244 | 1:500 dilution |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | 31872 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Irinotecan | Hospira | ||
| Low Temperature Freezer Vials | VWR International | 479-1220 | |
| McIlwain Tissue Chopper | World Precision Instruments | ||
| Microplate Mixer | SCILOGEX | 822000049999 | |
| Oxaliplatin | Teva | ||
| Paraformaldehyde | Merck | P6148-500G | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri dish 100 mm | Sarstedt | 83 3902500 | |
| Petri dish 60 mm | Sarstedt | 83 3901 | |
| Plastic Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171.010 | |
| Poly-Mount | Tebu-bio | 18606-5 | |
| Propidium iodide | Merck | P4170 | |
| RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel | VWR International | SWAN3001 | |
| Scalpel handle #3 | World Precision Instruments | 500236 | |
| Tricaine | Merck | E10521 | |
| Triton X-100 | Merck | T8787 | |
| Tween 20 | Merck | P9416 | |
| Vertical Micropipette Puller | Shutter instrument | P-30 |
Referências
- Rubin, H. Understanding cancer. Science. 219 (4589), 1170-1172 (1983).
- Krzyszczyk, P., et al. The growing role of precision and personalized medicine for cancer treatment. Technology. 6 (3-4), 79-100 (2018).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. Cancer statistics, 2022. CA Cancer Journal for Clinicians. 72 (1), 7-33 (2022).
- Trunk, A., et al. Emerging treatment strategies in pancreatic cancer. Pancreas. 50 (6), 773-787 (2021).
- Moffat, G. T., Epstein, A. S., O’Reilly, E. M. Pancreatic cancer-A disease in need: Optimizing and integrating supportive care. Cancer. 125 (22), 3927-3935 (2019).
- Sarantis, P., Koustas, E., Papadimitropoulou, A., Papavassiliou, A. G., Karamouzis, M. V. Pancreatic ductal adenocarcinoma: Treatment hurdles, tumor microenvironment and immunotherapy. World Journal of Gastrointestinal Oncology. 12 (2), 173-181 (2020).
- Marshall, L. J., Triunfol, M., Seidle, T. Patient-derived xenograft vs. organoids: a preliminary analysis of cancer research output, funding and human health impact in 2014-2019. Animals. 10 (10), 1923 (2020).
- Li, Y., Tang, P., Cai, S., Peng, J., Hua, G. Organoid based personalized medicine: from bench to bedside. Cell Regeneration. 9 (1), 21 (2020).
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The generation and application of patient-derived xenograft model for cancer research. Cancer Research and Treatment. 50 (1), 1-10 (2018).
- Rizzo, G., Bertotti, A., Leto, S. M., Vetrano, S. Patient-derived tumor models: a more suitable tool for pre-clinical studies in colorectal cancer. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 40 (1), 178 (2021).
- Usai, A., et al. Zebrafish patient-derived xenografts identify chemo-response in pancreatic ductal adenocarcinoma patients. Cancers. 13 (16), 4131 (2021).
- Usai, A., et al. A model of a zebrafish avatar for co-clinical trials. Cancers. 12 (3), 677 (2020).
- Chen, X., Li, Y., Yao, T., Jia, R. Benefits of zebrafish xenograft models in cancer research. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 616551 (2021).
- Miserocchi, G., et al. Management and potentialities of primary cancer cultures in preclinical and translational studies. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 229 (2017).
- Baghban, R., et al. Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 59 (2020).
- Albini, A., et al. Cancer stem cells and the tumor microenvironment: interplay in tumor heterogeneity. Connective Tissue Research. 56 (5), 414-425 (2015).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Tavares Barroso, M., et al. Establishment of pancreatobiliary cancer zebrafish avatars for chemotherapy screening. Cells. 10 (8), 2077 (2021).
- Kopetz, S., Lemos, R., Powis, G. The promise of patient-derived xenografts: the best laid plans of mice and men. Clinical Cancer Research. 18 (19), 5160-5162 (2012).
- Xing, F., Saidou, J., Watabe, K. Cancer associated fibroblasts (CAFs) in tumor microenvironment. Frontiers in Bioscience. 15 (1), 166-179 (2010).
- Strähle, U., et al. Zebrafish embryos as an alternative to animal experiments-a commentary on the definition of the onset of protected life stages in animal welfare regulations. Reproductive Toxicology. 33 (2), 128-132 (2012).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
