Outils microfluidiques pour sonder les interactions fongiques-microbiennes au niveau cellulaire

Summary

En raison de l’opacité du sol, les interactions entre ses microbes constitutifs ne peuvent pas être facilement visualisées avec une résolution cellulaire. Ici, deux outils microfluidiques sont présentés, qui offrent de nouvelles opportunités pour étudier les interactions fongiques-microbiennes. Les appareils sont polyvalents et simples à utiliser, permettant un contrôle spatio-temporel élevé et une imagerie haute résolution au niveau cellulaire.

Abstract

Les champignons filamenteux sont des habitants prospères du sol et jouent un rôle majeur dans les écosystèmes du sol, tels que la décomposition de la matière organique et inorganique, ainsi que la régulation des niveaux de nutriments. Ils y trouvent également de nombreuses occasions d’interagir avec une variété d’autres microbes tels que des bactéries ou d’autres champignons. L’étude des interactions fongiques au niveau cellulaire, cependant, peut être difficile en raison de la nature du sol ressemblant à une boîte noire. De nouveaux outils microfluidiques sont en cours de développement pour l’étude des interactions fongiques; deux plateformes conçues pour étudier les interactions bactérien-fongique et fongique-fongique sont mises en évidence. Au sein de ces microcanaux, les interactions fongiques-microbiennes peuvent être surveillées dans des environnements physico-chimiques contrôlés à une résolution temporelle et spatiale plus élevée qu’auparavant. L’application de ces outils a donné lieu à de nombreuses nouvelles connaissances biologiques, telles que l’observation de l’attachement polaire bactérien aux hyphes ou la révélation d’antagonismes fongiques-fongiques non caractérisés. Une caractéristique clé de ces méthodologies concerne la facilité d’utilisation de cet outil par des non-experts, produisant des technologies hautement traduisibles pour une utilisation dans les laboratoires de microbiologie.

Introduction

Le sol est un environnement exceptionnellement diversifié contenant une abondance de micro-organismes qui jouent un rôle déterminant dans les cycles^du carbone et du phosphore ^1,2. Les champignons filamenteux sont une composante majeure de nombreux écosystèmes en tant que décomposeurs de matière organique et inorganique et peuvent améliorer la nutrition des plantes grâce à la formation de relations symbiotiques ^3,4. Dans le sol, les champignons interagissent dynamiquement avec une multitude de microbes tels que d’autres champignons⁵, bactéries⁶, virus⁷ et nématodes⁸. Ces interactions ont des conséquences importantes sur la santé des sols et des plantes. Pourtant, en raison d’un manque de systèmes expérimentaux appropriés capables d’imager les micro-organismes en interaction avec une haute résolution, beaucoup restent indéfinis.

Les recherches concernant les interactions bactériens-fongiques (IFI) et les interactions fongiques-fongiques (IFF) ont des applications précieuses dans divers domaines, y compris les antimicrobiens en médecine et les agents de lutte biologique en agriculture. Par exemple, le champignon Coprinopsis cinerea produit le peptide copsine, dont il a été démontré qu’il présente une activité antibactérienne contre l’agent pathogène humain Listeria monocytogenes⁹. De même, le composé dérivé du champignon, la griséofulvine, est largement utilisé comme traitement des infections fongiques humaines et est en outre capable d’inhiber la croissance du champignon phytopathogène Alternaria solani^10,11. Il a également été démontré que plusieurs souches de la bactérie bacillus subtilis sont des agents de lutte biologique efficaces de l’agent pathogène fongique des plantes Rhizoctonia solani^12,13. Néanmoins, en raison des limites associées aux méthodologies traditionnelles, les IFI et les IFF sont mal compris au niveau des cellules individuelles.

Les études conventionnelles explorent généralement les IFI et les IFF à l’échelle macro en utilisant des plaques de gélose avec deux espèces ou plus en confrontation. Leur interaction est évaluée en mesurant les taux de croissance et la production de métabolites de l’espèce confrontante 14,15,16; cependant, cette méthodologie n’est résolue qu’au niveau de la colonie. Pour étudier les interactions au niveau cellulaire, les inoculants bactériens et fongiques peuvent être cultivés sur des lames de microscope en verre recouvertes d’agar qui sont ensuite imagées au microscope¹⁷. Néanmoins, il peut être difficile de suivre un seul hyphe à l’aide de lames de microscope en raison d’un manque de confinement, ce qui signifie que les images time-lapse sont plus difficiles à obtenir. En outre, la possibilité de confiner spatialement d’autres micro-organismes dans des régions définies du mycélium fongique ou de créer des environnements chimiques définis qui peuvent être perturbés, par exemple, n’est pas possible dans de telles configurations. La nature « boîte noire » du sol ajoute également à la complexité de l’étude des interactions fongiques-microbiennes au niveau des cellules individuelles¹⁸. En observant les espèces en interaction loin de l’incroyable diversité du microbiome du sol, la manière exacte dont les membres individuels interagissent peut être évaluée. Ainsi, il existe un besoin continu de plates-formes polyvalentes qui permettent l’imagerie unicellulaire à haute résolution des IFI et des IFF.

Les technologies microfluidiques, appelées systèmes de laboratoire sur puce, constituent une plate-forme idéale pour l’étude des BFI et des IFF au niveau des cellules individuelles. Le domaine de la microfluidique, issu des technologies développées pour l’analyse chimique et la microélectronique, a été adopté par les sciences biologiques¹⁹. Les technologies microfluidiques régulent de petits volumes de fluides au sein d’un réseau sur mesure de canaux miniaturisés, ayant au moins une dimension à l’échelle micrométrique, et leur utilisation dans la recherche biologique s’étend²⁰. En particulier, des dispositifs microfluidiques ont été développés pour examiner la croissance des champignons filamenteux 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30. L’un des avantages de l’utilisation de cette technologie est que le confinement des hyphes et la distribution des nutriments dans les microcanaux ressemblent davantage à la structure de l’environnement du sol que les méthodes conventionnelles d’agar³¹. Récemment, des plateformes microfluidiques ont été utilisées pour étudier les interactions entre les neutrophiles humains et les agents pathogènes fongiques³², les bactéries et les racines des plantes³³, ainsi que les champignons et les nématodes^34,35.

L’un des nombreux avantages de l’utilisation de la microfluidique pour étudier les interactions microbiennes comprend le contrôle spécifique de l’environnement des microcanaux. Par exemple, les régimes d’écoulement laminaire peuvent être exploités pour générer des gradients de concentration définis, ce qui est particulièrement utile lors de l’examen de la chimiotaxie bactérienne³⁶. Un autre avantage est que la nature transparente du poly(diméthylsiloxane) (PDMS), un polymère élastomère biocompatible peu coûteux couramment utilisé dans la fabrication de dispositifs microfluidiques, facilite l’imagerie à haute résolution de cellules individuelles à l’aide de la microscopie à fond clair et à fluorescence³⁷. De même, le confinement des microbes dans des microcanaux signifie que des expériences en accéléré de suivi de cellules individuelles peuvent être effectuées, permettant d’enregistrer et de quantifier les réponses cellulaires individuelles³⁷. Enfin, comme les dispositifs microfluidiques peuvent être conçus pour être conviviaux, ils peuvent être facilement utilisés par des non-experts³⁸.

Il est important de mieux connaître les interactions entre les micro-organismes vivant dans le sol pour améliorer les pratiques de gestion durable des écosystèmes qui maintiennent la biodiversité et atténuer l’impact des changements climatiques sur les environnements terrestres³⁹. Ainsi, le développement de nouveaux outils microfluidiques est fondamental pour élargir la compréhension des champignons et de leurs interactions au niveau cellulaire. Le protocole ici se concentrera sur deux dispositifs microfluidiques produits pour l’étude des BFI⁴⁰ et⁴¹ tels que représentés à la figure 1.

Figure 1 : Représentation visuelle et schématique des dispositifs d’interaction bactérienne-fongique (BFI) et d’interaction fongique (FFI). (A) Image du dispositif BFI. Un bouchon mycélien est placé à l’entrée d’une extrémité des microcanaux pour permettre la croissance hyphale dans l’appareil. L’entrée bactérienne se trouve à l’extrémité opposée. Barre d’échelle = 5 mm. (B) Vue d’ensemble schématique du dispositif BFI, décrivant le positionnement des entrées bactériennes et la direction de la croissance hyphale à travers les microcanaux d’interaction. Les canaux ont une profondeur de 10 μm, une largeur de 100 μm et une longueur de 7 mm, avec 28 canaux d’observation au total. (C) Essai de confrontation sur plaque de gélose entre Coprinopsis cinerea et Bacillus subtilis NCIB 3610, barre d’échelle = 20 mm (à gauche). Images microscopiques montrant l’interaction entre C. cinerea et B. subtilis NCIB 3610 dans le microcanal (milieu et droite), c’est-à-dire la fixation polaire des bactéries aux hyphes fongiques. Barre d’échelle = 25 μm (au milieu) et 10 μm (à droite). (D) Image du dispositif FFI collé à une boîte de Petri à fond de verre, double inoculée avec des bouchons mycéliens. Barre d’échelle = 1 cm. (E) Vue d’ensemble schématique du périphérique FFI. Deux bouchons d’inoculant fongiques sont introduits dans les entrées à chaque extrémité de l’appareil, permettant l’exploration hyphale des microcanaux. Les canaux de contrôle sont connectés à une seule entrée fongique et ont un canal sans issue, empêchant les interactions entre les champignons d’essai. Les canaux d’interaction relient les deux entrées fongiques et permettent des interactions hyphales entre les sujets testés au sein du microcanal. Chaque canal d’interaction se compose de 18 sections en forme de diamant, mesurant une longueur totale de 8,8 mm (490 x 430 μm par diamant), 10 μm de profondeur et ayant une région de connexion entre chaque diamant de 20 μm. Les types de canaux sont dupliqués, barres d’échelle = 1 mm. (F) Zone d’interaction entre deux fronts hyphales approchants, se développant à partir des extrémités opposées du canal d’interaction interconnecté. Image de microscopie à contraste de phase, barre d’échelle = 250 μm. Les panneaux de cette figure ont été modifiés à partir de Stanley et al., 2014 (A-C)⁴⁰ et Gimeno et al., 2021 (D-F)⁴¹. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Protocol

REMARQUE : Un résumé des procédures décrites dans ce protocole est illustré visuellement à la figure 2. Figure 2 : Représentation schématique de la méthodologie présentée, composée de cinq grandes sections détaillées dans le présent protocole. Les conceptions d’appareils sont…

Representative Results

Des résultats représentatifs sont présentés à partir des dispositifs exemplaires BFI40 et FFI41. Les mesures du taux de croissance de l’hyphalie peuvent facilement être obtenues à l’aide de ces dispositifs en combinaison avec des techniques de microscopie de base. La figure 3A-B illustre les interactions bactériens-fongiques entre C. cinerea hyphae et B. subtilis NCIB 3610. La pré…

Discussion

Cet article présente un protocole pour l’étude des interactions fongiques-microbiennes à l’aide de la microfluidique des canaux. Les auteurs visent à démontrer la polyvalence de ces dispositifs et à encourager l’adaptation en fonction des intérêts du chercheur. En utilisant les dispositifs BFI et FFI exemplaires, les interactions fongiques-microbiennes peuvent être étudiées plus en détail qu’auparavant. En supprimant la complexité et l’hétérogénéité du fond du sol, en modérant la croissance d…

Materials

Agar	Difco Laboratories	214010	Used to solidify culture medium for bacterial and fungal cultivation within Petri dishes
Aluminum foil	Fisher Scientific Ltd	11759408
AutoCAD 2021	Autodesk, USA
Autoclave (VX-75)	Systec
Centrifuge (5810R)	Eppendorf
Chlorotrimethysilane	Merck Life Sciences	386529	CAUTION: Chlorotrimethylsilane is a hazardous substance. Wear appropriate PPE and handle with care. Avoid contact with skin and eyes and prevent inhalation. Keep away from sources of ignition and use in a well-ventilated area.
Cork borer	SLS	COR1000
Developer solution (mr-Dev 600)	Microresist Technologies		CAUTION: mr-Dev 600 developer solution is flammable
Erlenmeyer flasks	VWR	214-1108	e.g. 200 mL; choose size to suit your exact needs
Ethanol (70% v/v)	Fisher Scientific Ltd	E/0650DF/15	Diluted from 99.8% (Analytical Reagent Grade)
Fiji	ImageJ		Exemplar software package for imaging processing
Filtered, compressed air			Available as standard in most labs. Altervatively, an oil-free compressor with air regulator can be used.
Flat-headed wafer tweezers	SLS	INS5026
Forceps	Fisher Scientific Ltd	10008051	Bent, sharp
Glass bottom petri dish	World Precision Instruments	FD35-100	35 mm
Glass bottom petri dish	World Precision Instruments	FD5040-100	50 mm
Glass crystallisation dishes	VWR	216-1865	Used for washing of PDMS slabs
Glass crystallisation dishes	VWR	216-1866	Used in the development of master moulds
Glass media bottles	Fisher Scientific Ltd	15456113	e.g. 250 mL; choose size to suit your exact needs
Glass syringe (Hamilton)	Fisher Scientific Ltd	10625251	Used for dispensing chlorotrimethylsilane
Hot plate (HP 160 III BM)	SAWATEC
Inoculation loop	VWR	COPA175CS01
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich	W292907
Laminar flow hood	Air Science (PCR)		Exemplar laminar flow hood used for device fabrication
LB medium	Fisher Scientific Ltd	BP9723-500	Exemplar nutrient broth for bacterial overnight culture
Light emitting diode light engine (LedHUB)	Omicron-Laserage Laserprodukte GmbH		Exemplar light source that can be used for imaging fungal-microbial interactions (fluorescence)
MA6 Ultraviolet mask aligner	Suss Microtec
Malt extract	VWR	84618	Used to make exemplar fungal culture medium (Malt extract agar)
Mask Writer	Applied Materials	4700DP	Example of a mask writer which can be used to print photo-mask for photolithography
Master mould plastic mount			3D-printed bespoke holder manufactured in-house
Microbiological safety cabinet  (BioMat2)	Contained Air Solutions		Exemplar MSC used for microbial culture and device inoculation
Milli-Q purified water			Available as standard in biology labs.
NaOH	Fisher Scientific Ltd	BP359-500
NIS-Elements Advanced Research imaging software	Nikon		Exemplar software package for image acquisition
NIS-Elements Free Viewer	Nikon		Exemplar software package for viewing acquired images
Oven (Binder BD115)	Fisher Scientific Ltd	15602126	Used for curing poly(dimethylsiloxane)(PDMS)
Oven (CLO-2AH-S)	KOYO		Used for preparing silicon wafers
Parafilm	Bemis	HS234526B	transparent film
Petri dishes, square sterile	Fisher Scientific Ltd	11708573	120.5 mm
Petri dishes, sterile	Fisher Scientific Ltd	15370366	90 mm
Photolithography mask	Micro Lithography Services Ltd. UK
Plasma cleaner (Zepto)	Diener Electronic	100012601
Plastic cup	Semadeni	8323
Plastic spatula	Semadeni	3340
Portable precision balance (OHAUS Scout)	Fisher Scientific Ltd	15519631	Used for weighing PDMS, media components etc.
Precision cutter	Syneo	HS1251135P1183	Cutting edge diameter: 3.18 mm
Precision cutter	Syneo	HS1871730P1183S	Cutting edge diameter: 4.75 mm
Profilometer	Bruker		Dektak XT-stylus
Razor blades	Häberle Labortechnik	9156110
Refridgerator	Haden		4-6 °C
Retiga R1 CCD camera	Qimaging		Exemplar camera that can be used for imaging fungal-microbial interactions
Scotch magic tape	Office Depot	3969954	19 mm invisible tape; clear tape
Shaking incubator (Cole-Parmer SI500)	Fisher Scientific Ltd	10257954
Silicon wafer	Inseto		100 mm
Soda lime glass plate	Inseto		125 mm x 125 mm x 2 mm. Used to hold photolithography mask in mask aligner
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Spincoater	SAWATEC	SM-180-BM
SU-8 2010 photoresist	MicroChem		CAUTION: SU-8 photoresist is hazardous, take care when handling and prevent inhalation and contact with skin. Flammable, potentially carcinogenic and toxic to the environment.
Sylgard 184 elastomer kit	VWR	634165S	Used for the preparation of poly(dimethylsiloxane)(PDMS) devices
Temperature controlled incubator	Okolab		Exemplar incubator that can be used for imaging fungal-microbial interactions
Ti2-E inverted epifluorescence microscope	Nikon	MEA54000	Exemplar microscope that can be used for imaging fungal-microbial interactions
Ultrasonic cleaner S-Line	Fisher Scientific Ltd	FB15050
Vacuum desiccator	Fisher Scientific Ltd	10528861	Silianisation and PDMS degassing should be conducted in separate desiccators
x10/0.3 NA CFI Plan Fluor DL objective lens	Nikon	MRH20105	Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions
x20/0.45 NA CFI Plan Fluor DL objective lens	Nikon	MRH48230	Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions