Mikrofluidische Werkzeuge zur Untersuchung pilzlich-mikrobieller Interaktionen auf zellulärer Ebene

Summary

Aufgrund der Opazität des Bodens können Wechselwirkungen zwischen seinen konstituierenden Mikroben nicht leicht mit zellulärer Auflösung sichtbar gemacht werden. Hier werden zwei mikrofluidische Werkzeuge vorgestellt, die neue Möglichkeiten bieten, pilzlich-mikrobielle Wechselwirkungen zu untersuchen. Die Geräte sind vielseitig und einfach zu bedienen und ermöglichen eine hohe räumlich-zeitliche Kontrolle und hochauflösende Bildgebung auf zellulärer Ebene.

Abstract

Filamentöse Pilze sind erfolgreiche Bewohner des Bodens und spielen eine wichtige Rolle in Bodenökosystemen, etwa beim Abbau organischer und anorganischer Stoffe, sowie bei der Regulierung des Nährstoffgehalts. Dort finden sie auch zahlreiche Möglichkeiten, mit einer Vielzahl anderer Mikroben wie Bakterien oder anderen Pilzen zu interagieren. Die Untersuchung von Pilzinteraktionen auf zellulärer Ebene kann jedoch aufgrund der Black-Box-ähnlichen Natur des Bodens eine Herausforderung darstellen. Neue mikrofluidische Werkzeuge werden für die Untersuchung von Pilzinteraktionen entwickelt; Zwei Plattformen zur Untersuchung von bakteriell-pilzlichen und Pilz-Pilz-Interaktionen werden hervorgehoben. Innerhalb dieser Mikrokanäle können pilzlich-mikrobielle Wechselwirkungen in kontrollierten physikalisch-chemischen Umgebungen mit höherer zeitlicher und räumlicher Auflösung als bisher beobachtet werden. Die Anwendung dieser Werkzeuge hat zahlreiche neue biologische Erkenntnisse hervorgebracht, wie z.B. die Beobachtung der bakteriellen polaren Bindung an Hyphen oder die Aufdeckung uncharakterisierter Pilz-Pilz-Antagonismen. Ein Schlüsselmerkmal dieser Methoden ist die einfache Verwendung dieses Tools durch Nicht-Experten, was zu hochgradig übersetzbaren Technologien für den Einsatz in mikrobiologischen Labors führt.

Introduction

Der Boden ist eine außergewöhnlich vielfältige Umgebung, die eine Fülle von Mikroorganismen enthält, die für Kohlenstoff- und Phosphorzyklen von entscheidender Bedeutung sind ^1,2. Filamentöse Pilze sind ein wichtiger Bestandteil zahlreicher Ökosysteme als Zersetzer von organischer und anorganischer Substanz und können die Ernährung von Pflanzen durch die Bildung symbiotischer Beziehungen^{verbessern 3,4}. Im Boden interagieren Pilze dynamisch mit einer Vielzahl von Mikroben wie anderen Pilzen⁵, Bakterien 6^, Viren⁷ und Nematoden⁸. Diese Wechselwirkungen haben erhebliche Folgen für die Boden- und Pflanzengesundheit. Aufgrund des Mangels an geeigneten experimentellen Systemen, die in der Lage sind, interagierende Mikroorganismen mit hoher Auflösung abzubilden, bleiben viele jedoch undefiniert.

Untersuchungen zu bakteriell-pilzlichen Interaktionen (BFIs) und Pilz-Pilz-Interaktionen (FFIs) haben wertvolle Anwendungen in einer Reihe von Bereichen, darunter antimikrobielle Mittel in der Medizin und biologische Bekämpfungsmittel in der Landwirtschaft. Zum Beispiel produziert der Pilz Coprinopsis cinerea das Peptid Copsin, das nachweislich eine antibakterielle Aktivität gegen den menschlichen Erreger Listeria monocytogenes⁹ aufweist. Ebenso wird die pilzliche Verbindung Griseofulvin häufig zur Behandlung von menschlichen Pilzinfektionen eingesetzt und ist zusätzlich in der Lage, das Wachstum des pflanzenpathogenen Pilzes Alternaria solani^10,11 zu hemmen. Mehrere Stämme des bodenbewohnenden Bakteriums Bacillus subtilis haben sich ebenfalls als wirksame Biokontrollmittel des pilzlichen Pflanzenpathogens Rhizoctonia solani^12,13 erwiesen. Aufgrund von Einschränkungen, die mit traditionellen Methoden verbunden sind, werden BFIs und FFIs auf der Ebene einzelner Zellen jedoch nur unzureichend verstanden.

Konventionelle Studien untersuchen typischerweise BFIs und FFIs auf der Makroskala unter Verwendung von Agarplatten mit zwei oder mehr Arten in Konfrontation. Ihre Wechselwirkung wird durch Messung der Wachstumsraten und der Metabolitenproduktion der konfrontierenden Spezies^14,15,16 bewertet; Diese Methodik wird jedoch nur auf Kolonieebene gelöst. Um Wechselwirkungen auf zellulärer Ebene zu untersuchen, können bakterielle und pilzliche Impfmittel auf mit Agar beschichteten Glasmikroskopobjektträgern kultiviert werden, die dann unter einem Mikroskop^{abgebildet werden 17}. Dennoch kann es schwierig sein, einem einzelnen Hypha mit Objektträgern zu folgen, da es an Enge mangelt, was bedeutet, dass Zeitrafferbilder schwieriger zu erhalten sind. Darüber hinaus ist die Möglichkeit, andere Mikroorganismen räumlich in definierten Regionen des Pilzmyzels einzuschließen oder definierte chemische Umgebungen zu schaffen, die beispielsweise gestört werden können, in solchen Aufbauten nicht möglich. Die “Black Box” -Natur des Bodens trägt auch zur Komplexität der Untersuchung von Pilz-mikrobiellen Interaktionen auf der Ebene einzelner Zellen^{bei 18}. Durch die Beobachtung interagierender Arten abseits der unglaublichen Vielfalt des Bodenmikrobioms kann die genaue Art und Weise, wie einzelne Mitglieder interagieren, beurteilt werden. Daher besteht weiterhin Bedarf an vielseitigen Plattformen, die eine hochauflösende Einzelzellbildgebung von BFIs und FFIs ermöglichen.

Mikrofluidische Technologien, sogenannte Lab-on-a-Chip-Systeme, bieten eine ideale Plattform für die Untersuchung von BFIs und FFIs auf der Ebene einzelner Zellen. Der Bereich der Mikrofluidik, der aus Technologien stammt, die für die chemische Analyse und Mikroelektronik entwickelt wurden, wurde von den Biowissenschaften^{übernommen 19}. Mikrofluidische Technologien regulieren kleine Mengen von Flüssigkeiten innerhalb eines maßgeschneiderten Netzwerks miniaturisierter Kanäle, die mindestens eine Dimension auf der Mikrometerskala haben, und ihre Verwendung in der biologischen Forschung nimmt zu²⁰. Insbesondere wurden mikrofluidische Geräte entwickelt, um das Wachstum von fadenförmigen Pilzen 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 zu untersuchen. Ein Vorteil der Verwendung dieser Technologie besteht darin, dass der Einschluss von Hyphen und die Verteilung von Nährstoffen innerhalb von Mikrokanälen der Struktur der Bodenumgebung ähnlicher ist als herkömmliche Agarmethoden³¹. In jüngster Zeit wurden mikrofluidische Plattformen verwendet, um Wechselwirkungen zwischen menschlichen Neutrophilen und pilzlichen Krankheitserregern 32, Bakterien und Pflanzenwurzeln³³ sowie Pilzen und Nematoden^34,35 zu untersuchen.

Einer der vielen Vorteile der Verwendung von Mikrofluidik zur Untersuchung mikrobieller Wechselwirkungen ist die spezifische Steuerung der Mikrokanalumgebung. Zum Beispiel können laminare Strömungsregime genutzt werden, um definierte Konzentrationsgradienten zu erzeugen, was besonders bei der Untersuchung der bakteriellen Chemotaxis³⁶ nützlich ist. Ein weiterer Vorteil ist, dass die transparente Natur von Poly(dimethylsiloxan) (PDMS), einem kostengünstigen, biokompatiblen Elastomerpolymer, das üblicherweise bei der Herstellung von mikrofluidischen Bauelementen verwendet wird, die hochauflösende Bildgebung einzelner Zellen mittels Hellfeld- und Fluoreszenzmikroskopie^{ermöglicht 37}. Ebenso bedeutet der Einschluss von Mikroben in Mikrokanälen, dass Zeitrafferexperimente, die einzelne Zellen verfolgen, durchgeführt werden können, so dass einzelne zelluläre Reaktionen aufgezeichnet und quantifiziert werden^{können 37}. Da mikrofluidische Geräte benutzerfreundlich gestaltet werden können, können sie von Nicht-Experten leicht eingesetzt werden³⁸.

Die Förderung des Wissens über die Wechselwirkungen zwischen bodenbewohnenden Mikroorganismen ist wichtig, um nachhaltige Ökosystembewirtschaftungspraktiken zu verbessern, die die biologische Vielfalt erhalten und die Auswirkungen des Klimawandels auf die terrestrische Umwelt mildern³⁹. Daher ist die Entwicklung neuartiger mikrofluidischer Werkzeuge von grundlegender Bedeutung, um das Verständnis von Pilzen und ihren Wechselwirkungen auf zellulärer Ebene zu erweitern. Das Protokoll konzentriert sich hier auf zwei mikrofluidische Geräte, die für die Untersuchung der BFIs⁴⁰ und FFIs⁴¹ hergestellt wurden, wie in Abbildung 1 dargestellt.

Abbildung 1: Visuelle und schematische Darstellung der Geräte für die bakterielle-pilzische Interaktion (BFI) und die Pilz-Pilz-Interaktion (FFI). (A) Bild des BFI-Geräts. Ein Myzelstopfen wird am Eingang zu einem Ende der Mikrokanäle platziert, um das Wachstum der Hyphen in das Gerät zu ermöglichen. Der bakterielle Einlass befindet sich am gegenüberliegenden Ende. Maßstabsleiste = 5 mm. (B) Schematische Übersicht des BFI-Geräts, das die Positionierung der bakteriellen Einlässe und die Richtung des Hyphenwachstums durch die Interaktionsmikrokanäle darstellt. Die Kanäle sind 10 μm tief, 100 μm breit und 7 mm lang, mit insgesamt 28 Beobachtungskanälen. (C) Konfrontationstest auf Agarplatte zwischen Coprinopsis cinerea und Bacillus subtilis NCIB 3610, Skalenstab = 20 mm (links). Mikroskopische Aufnahmen, die die Wechselwirkung zwischen C. cinerea und B. subtilis NCIB 3610 innerhalb des Mikrokanals (Mitte und rechts) zeigen, d.h. die polare Anheftung von Bakterien an Pilzhyphen. Skalenbalken = 25 μm (Mitte) und 10 μm (rechts). (D) Abbildung des FFI-Geräts, das an eine Petrischale mit Glasboden gebunden ist, die mit Myzelstopfen doppelt beimpft ist. Maßstabsleiste = 1 cm. (E) Schematische Übersicht des FFI-Geräts. Zwei Pilzimpfstopfen werden an beiden Enden des Geräts in die Einlässe eingeführt, was eine hyphalische Exploration der Mikrokanäle ermöglicht. Die Steuerkanäle sind nur mit einem Pilzeinlass verbunden und haben einen Sackgassenkanal, der Wechselwirkungen zwischen den Testpilzen verhindert. Interaktionskanäle verbinden beide Pilzeinlässe und ermöglichen hyphalische Interaktionen zwischen den Probanden innerhalb des Mikrokanals. Jeder Interaktionskanal besteht aus 18 rautenförmigen Abschnitten, die eine Gesamtlänge von 8,8 mm (490 x 430 μm pro Diamant), 10 μm tief und einen Verbindungsbereich zwischen jedem Diamanten von 20 μm messen. Kanaltypen werden dupliziert, Maßstabsbalken = 1 mm. (F) Interaktionszone zwischen zwei sich nähernden Hyphenfronten, die von gegenüberliegenden Enden des miteinander verbundenen Interaktionskanals wächst. Phasenkontrastmikroskopie-Bild, Maßstabsbalken = 250 μm. Die Paneele in dieser Abbildung wurden von Stanley et al., 2014 (A-C)⁴⁰ und Gimeno et al., 2021 (D-F)⁴¹ modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Protocol

HINWEIS: Eine Zusammenfassung der in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren ist in Abbildung 2 visuell dargestellt. Abbildung 2: Schematische Darstellung der vorgestellten Methodik, bestehend aus fünf Hauptabschnitten, die in diesem Protokoll detailliert beschrieben sind. Gerätedesigns we…

Representative Results

Repräsentative Ergebnisse werden anhand der Exemplare BFI40 und FFI41 vorgestellt. Hyphenwachstumsratenmessungen können mit diesen Geräten in Kombination mit grundlegenden Mikroskopietechniken leicht durchgeführt werden. Abbildung 3A-B veranschaulicht bakteriell-pilzliche Interaktionen zwischen C. cinerea hyphae und B. subtilis NCIB 3610. Das Vorhandensein von B. subtilis stoppt d…

Discussion

Dieser Artikel stellt ein Protokoll zur Untersuchung von Pilz-mikrobiellen Wechselwirkungen unter Verwendung der Kanalmikrofluidik vor. Ziel der Autoren ist es, die Vielseitigkeit dieser Geräte zu demonstrieren und die Anpassung an die Interessen des Forschers zu fördern. Mit Hilfe der beispielhaften BFI- und FFI-Geräte können pilzlich-mikrobielle Wechselwirkungen detaillierter untersucht werden, als bisher zugänglich. Durch die Beseitigung der Hintergrundkomplexität und Heterogenität des Bodens, die Moderation de…

Materials

Agar	Difco Laboratories	214010	Used to solidify culture medium for bacterial and fungal cultivation within Petri dishes
Aluminum foil	Fisher Scientific Ltd	11759408
AutoCAD 2021	Autodesk, USA
Autoclave (VX-75)	Systec
Centrifuge (5810R)	Eppendorf
Chlorotrimethysilane	Merck Life Sciences	386529	CAUTION: Chlorotrimethylsilane is a hazardous substance. Wear appropriate PPE and handle with care. Avoid contact with skin and eyes and prevent inhalation. Keep away from sources of ignition and use in a well-ventilated area.
Cork borer	SLS	COR1000
Developer solution (mr-Dev 600)	Microresist Technologies		CAUTION: mr-Dev 600 developer solution is flammable
Erlenmeyer flasks	VWR	214-1108	e.g. 200 mL; choose size to suit your exact needs
Ethanol (70% v/v)	Fisher Scientific Ltd	E/0650DF/15	Diluted from 99.8% (Analytical Reagent Grade)
Fiji	ImageJ		Exemplar software package for imaging processing
Filtered, compressed air			Available as standard in most labs. Altervatively, an oil-free compressor with air regulator can be used.
Flat-headed wafer tweezers	SLS	INS5026
Forceps	Fisher Scientific Ltd	10008051	Bent, sharp
Glass bottom petri dish	World Precision Instruments	FD35-100	35 mm
Glass bottom petri dish	World Precision Instruments	FD5040-100	50 mm
Glass crystallisation dishes	VWR	216-1865	Used for washing of PDMS slabs
Glass crystallisation dishes	VWR	216-1866	Used in the development of master moulds
Glass media bottles	Fisher Scientific Ltd	15456113	e.g. 250 mL; choose size to suit your exact needs
Glass syringe (Hamilton)	Fisher Scientific Ltd	10625251	Used for dispensing chlorotrimethylsilane
Hot plate (HP 160 III BM)	SAWATEC
Inoculation loop	VWR	COPA175CS01
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich	W292907
Laminar flow hood	Air Science (PCR)		Exemplar laminar flow hood used for device fabrication
LB medium	Fisher Scientific Ltd	BP9723-500	Exemplar nutrient broth for bacterial overnight culture
Light emitting diode light engine (LedHUB)	Omicron-Laserage Laserprodukte GmbH		Exemplar light source that can be used for imaging fungal-microbial interactions (fluorescence)
MA6 Ultraviolet mask aligner	Suss Microtec
Malt extract	VWR	84618	Used to make exemplar fungal culture medium (Malt extract agar)
Mask Writer	Applied Materials	4700DP	Example of a mask writer which can be used to print photo-mask for photolithography
Master mould plastic mount			3D-printed bespoke holder manufactured in-house
Microbiological safety cabinet  (BioMat2)	Contained Air Solutions		Exemplar MSC used for microbial culture and device inoculation
Milli-Q purified water			Available as standard in biology labs.
NaOH	Fisher Scientific Ltd	BP359-500
NIS-Elements Advanced Research imaging software	Nikon		Exemplar software package for image acquisition
NIS-Elements Free Viewer	Nikon		Exemplar software package for viewing acquired images
Oven (Binder BD115)	Fisher Scientific Ltd	15602126	Used for curing poly(dimethylsiloxane)(PDMS)
Oven (CLO-2AH-S)	KOYO		Used for preparing silicon wafers
Parafilm	Bemis	HS234526B	transparent film
Petri dishes, square sterile	Fisher Scientific Ltd	11708573	120.5 mm
Petri dishes, sterile	Fisher Scientific Ltd	15370366	90 mm
Photolithography mask	Micro Lithography Services Ltd. UK
Plasma cleaner (Zepto)	Diener Electronic	100012601
Plastic cup	Semadeni	8323
Plastic spatula	Semadeni	3340
Portable precision balance (OHAUS Scout)	Fisher Scientific Ltd	15519631	Used for weighing PDMS, media components etc.
Precision cutter	Syneo	HS1251135P1183	Cutting edge diameter: 3.18 mm
Precision cutter	Syneo	HS1871730P1183S	Cutting edge diameter: 4.75 mm
Profilometer	Bruker		Dektak XT-stylus
Razor blades	Häberle Labortechnik	9156110
Refridgerator	Haden		4-6 °C
Retiga R1 CCD camera	Qimaging		Exemplar camera that can be used for imaging fungal-microbial interactions
Scotch magic tape	Office Depot	3969954	19 mm invisible tape; clear tape
Shaking incubator (Cole-Parmer SI500)	Fisher Scientific Ltd	10257954
Silicon wafer	Inseto		100 mm
Soda lime glass plate	Inseto		125 mm x 125 mm x 2 mm. Used to hold photolithography mask in mask aligner
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Spincoater	SAWATEC	SM-180-BM
SU-8 2010 photoresist	MicroChem		CAUTION: SU-8 photoresist is hazardous, take care when handling and prevent inhalation and contact with skin. Flammable, potentially carcinogenic and toxic to the environment.
Sylgard 184 elastomer kit	VWR	634165S	Used for the preparation of poly(dimethylsiloxane)(PDMS) devices
Temperature controlled incubator	Okolab		Exemplar incubator that can be used for imaging fungal-microbial interactions
Ti2-E inverted epifluorescence microscope	Nikon	MEA54000	Exemplar microscope that can be used for imaging fungal-microbial interactions
Ultrasonic cleaner S-Line	Fisher Scientific Ltd	FB15050
Vacuum desiccator	Fisher Scientific Ltd	10528861	Silianisation and PDMS degassing should be conducted in separate desiccators
x10/0.3 NA CFI Plan Fluor DL objective lens	Nikon	MRH20105	Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions
x20/0.45 NA CFI Plan Fluor DL objective lens	Nikon	MRH48230	Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions