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Bioengineering

Herstellung und Verwendung von trockenen makroporösen Alginatgerüsten für die virale Transduktion von T-Zellen

Published: September 9, 2022 doi: 10.3791/64036
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2, 1,2,3
1Joint Department of Biomedical Engineering, University of North Carolina at Chapel Hill and North Carolina State University, 2Comparative Medicine Institute, North Carolina State University, 3Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina at Chapel Hill

Summary

Hierin ist ein Protokoll zur Herstellung trockener makroporöser Alginatgerüste, die einen effizienten viralen Gentransfer für den Einsatz in der Gentechnik von T-Zellen, einschließlich T-Zellen für die CAR-T-Zelltherapie, vermitteln. Es wurde gezeigt, dass die Gerüste aktivierte primäre T-Zellen mit >85% Transduktion transduzieren.

Abstract

Die Gentechnik von T-Zellen für die CAR-T-Zelltherapie ist in den letzten Jahren in den Vordergrund der Krebsbehandlung gerückt. CAR-T-Zellen werden durch viralen Gentransfer in T-Zellen hergestellt. Der derzeitige Goldstandard des viralen Gentransfers beinhaltet die Spinokulation von retronektinbeschichteten Platten, was teuer und zeitaufwendig ist. Es besteht ein erheblicher Bedarf an effizienten und kostengünstigen Methoden zur Erzeugung von CAR-T-Zellen. Hier wird ein Verfahren zur Herstellung kostengünstiger, trockener makroporöser Alginatgerüste, bekannt als Drydux-Gerüste, beschrieben, die die virale Transduktion aktivierter T-Zellen effizient fördern. Die Gerüste sind so konzipiert, dass sie anstelle der Goldstandard-Spinokulation von retronektinbeschichteten Platten, die mit Viren besät sind, verwendet werden und den Prozess zur Übertragung von Zellen vereinfachen. Alginat wird mit Calcium-D-Gluconat vernetzt und über Nacht eingefroren, um die Gerüste zu bilden. Die gefrorenen Gerüste werden in einem Gefriertrockner für 72 h gefriergetrocknet, um die Bildung der trockenen makroporösen Gerüste zu vervollständigen. Die Gerüste vermitteln den viralen Gentransfer, wenn Virus- und aktivierte T-Zellen auf dem Gerüst zusammengesät werden, um genetisch veränderte Zellen zu produzieren. Die Gerüste erzeugen >85% primäre T-Zell-Transduktion, was mit der Transduktionseffizienz der Spinokulation auf retronektinbeschichteten Platten vergleichbar ist. Diese Ergebnisse zeigen, dass trockene makroporöse Alginatgerüste eine kostengünstigere und bequemere Alternative zur herkömmlichen Transduktionsmethode darstellen.

Introduction

Die Immuntherapie hat sich aufgrund ihrer Fähigkeit, Tumore spezifisch anzugreifen, die Off-Target-Zytotoxizität zu begrenzen und einen Rückfall zu verhindern, zu einem revolutionären Krebsbehandlungsparadigma entwickelt. Insbesondere die chimäre Antigenrezeptor-T (CAR-T) -Zelltherapie hat aufgrund ihres Erfolgs bei der Behandlung von Lymphomen und Leukämien an Popularität gewonnen. Die FDA hat die erste CAR-T-Zelltherapie im Jahr 2017 zugelassen und seitdem vier weitere CAR-T-Zelltherapien 1,2,3,4,5 zugelassen. CARs haben eine Antigenerkennungsdomäne, die normalerweise aus einem einkettigen variablen Fragment eines monoklonalen Antikörpers besteht, der spezifisch für ein tumorassoziiertes Antigen 3,4 ist. Wenn eine CAR mit ihrem tumorassoziierten Antigen interagiert, werden die CAR-T-Zellen aktiviert, was zu einer Antitumorreaktion mit Zytokinfreisetzung, zytolytischer Degranulation, Transkriptionsfaktorexpression und T-Zellproliferation führt. Um CAR-T-Zellen zu produzieren, wird Blut vom Patienten gesammelt, um seine T-Zellen zu erhalten. CARs werden den T-Zellen des Patienten mit Hilfe eines Virus genetisch hinzugefügt. Die CAR-T-Zellen werden in vitro gezüchtet unddem Patienten 2,3,4,6 wieder infundiert. Die erfolgreiche Erzeugung von CAR-T-Zellen wird durch die Transduktionseffizienz bestimmt, die die Anzahl der T-Zellen beschreibt, die genetisch zu CAR-T-Zellen verändert werden.

Derzeit ist der Goldstandard für die CAR-T-Zellerzeugung die Spinokulation von aktivierten T-Zellen und Viren auf retronektinbeschichteten Platten 7,8. Die Transduktion beginnt, wenn Viruspartikel mit der Oberfläche der T-Zellen interagieren. Retronectin fördert die Kolokalisierung von Virus und Zellen, indem es die Bindungseffizienz zwischen den Viruspartikeln und den Zellen erhöht und die Transduktion verbessert 7,8. Retronectin allein wirkt nicht gut und muss von einer Spinokulation begleitet werden, die den Gentransfer verbessert, indem sie die Viruspartikel konzentriert und die Oberflächenpermeabilität der T-Zelle erhöht, was eine leichtere Virusinfektion ermöglicht8. Trotz des Erfolgs der Spinokulation auf retronektinbeschichteten Platten ist es ein komplexer Prozess, der mehrere Spinzyklen und teure Reagenzien erfordert. Daher sind alternative Methoden für den viralen Gentransfer, die schneller und billiger sind, sehr wünschenswert.

Alginat ist ein natürliches anionisches Polysaccharid, das in der biomedizinischen Industrie aufgrund seiner niedrigen Kosten, seines guten Sicherheitsprofils und seiner Fähigkeit, Hydrogele beim Mischen mit zweiwertigen Kationen 9,10,11,12 zu bilden, häufig verwendet wird. Alginat ist ein GMP-konformes Polymer und wird von der FDA13 allgemein als sicher (GRAS) anerkannt. Die Vernetzung von Alginat mit Kationen erzeugt stabile Hydrogele, die häufig in der Wundheilung, der Abgabe kleiner chemischer Medikamente und Proteine und des Zelltransports verwendetwerden 9,10,11,12,14,15,16. Aufgrund seiner hervorragenden Geliereigenschaften ist Alginat das bevorzugte Material zur Herstellung poröser Gerüste durch Gefriertrocknung10,17. Diese Eigenschaften von Alginat machen es zu einem attraktiven Kandidaten für die Herstellung eines Gerüsts, das den viralen Gentransfer aktivierter Zellen vermitteln kann.

Hier wird ein Protokoll zur Herstellung trockener makroporöser Alginatgerüste, bekannt als Drydux-Gerüste, beschrieben, die T-Zellen statisch durch viralen Gentransfer transduzieren17,18. Der Prozess zur Herstellung dieser Gerüste ist in Abbildung 1 dargestellt. Diese Gerüste machen die Spinokulation retronektinbeschichteter Platten überflüssig. Die makroporösen Alginatgerüste fördern die Interaktion von Viruspartikeln und T-Zellen, um einen effizienten Gentransfer in einem einzigen Schritt zu ermöglichen, ohne die Funktionalität und Lebensfähigkeit der technisch hergestellten T-Zellen zu beeinträchtigen17. Bei korrekter Befolgung haben diese makroporösen Alginatgerüste eine Transduktionseffizienz von mindestens 80%, was den viralen Transduktionsprozess vereinfacht und verkürzt.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung und Zeitleiste des Protokolls . (A) Zeitplan für die Herstellung der trockenen makroporösen Alginatgerüste. Alginat wird mit Calcium-D-gluconat vernetzt und über Nacht eingefroren. Die gefrorenen Gerüste werden für 72 h lyophilisiert, um die Drydux-Gerüste herzustellen. (B) Zeitplan für die virale Transduktion aktivierter Zellen. Aktivierte Zellen und Viren (MOI 2) werden auf dem Gerüst ausgesät und in kompletten Medien inkubiert, ergänzt mit IL-7 und IL-15. Die Gerüste absorbieren die Mischung und fördern den viralen Gentransfer. EDTA wird verwendet, um die Gerüste aufzulösen und die transduzierten Zellen zu isolieren. Nach zweimaligem Waschen mit PBS kann das Zellpellet zur Analyse verwendet werden. Abkürzungen: PBS = phosphatgepufferte Kochsalzlösung; PBMCs = periphere mononukleäre Blutzellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Protocol

Alle Verfahren mit menschlichen Primacy-Zellen und retroviralen Vektoren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für biologische Sicherheit der North Carolina State University durchgeführt und vom Environmental Health and Safety Office genehmigt. Menschliche mononukleäre Zellen des peripheren Blutes wurden als Buffy-Mäntel aus kommerziellen Quellen gekauft. Primäre menschliche Zellen müssen aus menschlichen Buffy-Fellfraktionen isoliert werden und erfordern eine Freigabe der Biosicherheitsstufe 2 sowie detaillierte Standardarbeitsanweisungen und die Genehmigung der Institution, in der die Arbeit stattfinden soll. Virale Vektoren, einschließlich der retroviralen Vektorüberstände, die für die zuvor beschriebene Transduktion verwendet werden19, können je nach kodiertem Protein entweder als Biosicherheitsstufe 1 oder Biosicherheitsstufe 2 eingestuft werden und bedürfen der Genehmigung durch den zuständigen institutionellen Ausschuss für biologische Sicherheit.

1. Herstellung der makroporösen Alginatgerüste

  1. Eine Stammlösung von 0,4% (Gewicht pro Volumen) Calcium-D-Gluconat wird durch Zugabe von steril gefiltertem entionisiertem Wasser zu Calcium-D-Gluconat in einem Becherglas hergestellt. Bei mittlerer Geschwindigkeit umrühren, bis sich das Calciumgluconat aufgelöst hat (~1,5 h), steril filtern und bei Raumtemperatur lagern.
    HINWEIS: Es ist nicht notwendig, den pH-Wert der Lösung zu überprüfen.
  2. Bereiten Sie eine Lösung von 2% (Gewicht pro Volumen) Alginat in einer Durchstechflasche oder einem Becherglas mit Schraubverschluss vor. Geben Sie das hochreine Alginat vorsichtig in das Gefäß und fügen Sie dem Alginat steril gefiltertes entionisiertes Wasser hinzu. Wählen Sie den größtmöglichen Rührstab, der das Mischen nicht behindert, und fügen Sie ihn dem Gefäß hinzu.
    HINWEIS: Informationen über die Art des hochreinen Alginats, das für dieses Protokoll verwendet wird, finden Sie in der Materialtabelle und auf der Novamatrix-Website20. Verschiedene Alginate wurden für diese Gerüste nicht untersucht, da sie zu unerwünschten Veränderungen der Porosität und Biokompatibilität der Gerüste führen können 9,10,11.
  3. Rühren Sie die Lösung auf hoher Geschwindigkeit, bis sich das Alginat auflöst (~ 1 h). Wenn sich an den Seiten des Gefäßes große Klumpen befinden, neigen Sie das Gefäß, um sie zu entfernen. Kleine Mengen Alginat an den Seiten lösen sich beim Rühren auf und sind kein Grund zur Besorgnis.
    HINWEIS: Es ist nicht notwendig, den pH-Wert der Lösung zu überprüfen.
  4. Wenn sich das Alginat auflöst, reduzieren Sie die Rührgeschwindigkeit, fügen Sie der Alginatlösung langsam ein gleiches Volumen von 0,4% Calcium-D-Gluconat hinzu, um die Bildung von Vernetzungsklumpen zu verhindern, und rühren Sie kräftig für 15 min.
  5. Neigen Sie das Becherglas oder die Durchstechflasche zur Seite, um eventuell gebildete Klumpen zu entfernen.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, einen Homogenisator zu verwenden. Die endgültige Lösung sollte optisch klar sein.
  6. Pipettieren Sie das gewünschte Volumen der Lösung in jede Vertiefung einer 48-Well-Platte oder 24-Well-Platte. Verwenden Sie 300 μL/Welle für eine 48-Well-Platte und 1 ml/Welle für eine 24-Well-Platte. Gießen Sie langsam und wechseln Sie die Spitzen häufig, da die Lösung viskos ist und an der Spitze haften bleibt.
  7. Die Teller mit Deckeln abdecken und über Nacht bei -20 °C einfrieren.
  8. Bereiten Sie die Platte für den Gefriertrockner vor, indem Sie den Deckel entfernen und die Oberseite mit Tüchern und Gummibändern sichern. Legen Sie die Platten in 750 ml bis 2.000 ml Gefriertrocknungskolben und legen Sie sie für 72 h auf den Gefriertrockner.
  9. Nach 72 h die Platte aus dem Gefriertrockner nehmen und den Deckel wieder einsetzen. Die Platte verschließen und bei 4 °C lagern. Für eine Langzeitlagerung vakuumverschließen Sie die Platte vor der Lagerung bei 4 °C. Trocken lagern, bis sie benötigt werden.
    HINWEIS: Stellen Sie aufgrund eines Volumenfehlers eine zusätzliche Calcium-Alginat-Lösung her (einige kleben an den Wänden der Durchstechflasche, Pipettenspitzen). Zum Beispiel, um vier Gerüste in einer 24-Well-Platte herzustellen, sind 4 ml kombinierte Lösung (2 ml Alginat + 2 ml Calcium-D-Gluconat) erforderlich, aber es wird empfohlen, 2,5 ml 2% ige Alginatlösung und 2,5 ml 0,4% ige Calcium-D-Gluconatlösung herzustellen.

2. Transduktion

  1. Konzentration des viralen Überstands mit 100 kDa-Filtern
    1. Hydratisieren Sie den Zentrifugalfilter für 2 min mit 1 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Verwerfen Sie den PBS.
    2. Die virale Suspension wird konzentriert, indem Sie 2 ml Virussuspension (1 × 106 TU/ml) zugeben und durch den Zentrifugalfilter bei 1.500 × g für 10 min in einem schwingenden Schaufelrotor zentrifugieren.
      HINWEIS: Pro Gerüst werden ein bis zweihundert Mikroliter konzentriertes Virus benötigt.
    3. Für einige zusätzliche Minuten drehen, wenn das Volumen der konzentrierten Virussuspension größer als 200 μL ist.
    4. Wiederholen Sie die Schritte 2.1.1-2.1.3 für jedes Gerüst.
      HINWEIS: Es ist auch akzeptabel, einen großen Virusvorrat zu konzentrieren und 100-200 μL Aliquots aus dem konzentrierten Bestand zu entnehmen.
  2. Samenaktivierte Zellen und Virus zusammen.
    1. Bereiten Sie für jedes Gerüst ein Aliquot vor, indem Sie 1 × 106 aktivierte mononukleäre Blutzellen (PBMCs) in 50 μL vollständiger Zellkulturmedien (250 ml Click-Medien + 250 ml RPMI 1640 Medien + 50 ml fetales Rinderserum + 5 ml Glutaminersatz + 5 ml Penicillin / Streptomycin) suspendieren.
      Hinweis: Ein Protokoll zur Aktivierung von PBMCs finden Sie in der Zusatzdatei 1 .
    2. Fügen Sie den konzentrierten viralen Überstand (~2 × 106 TU, MOI 2) zur Zellsuspension hinzu. Das Gesamtvolumen der Zellvirussuspension sollte 200 μL für ein 48-Well-Gerüst oder 350 μL für ein 24-Well-Gerüst nicht überschreiten.
    3. Fügen Sie die Zell-Virus-Mischung tropfenweise auf die Oberseite des trockenen Gerüsts hinzu. Verwenden Sie für Negativkontrollexperimente vollständige Zellkulturmedien anstelle des konzentrierten Virus. Fügen Sie die Zellsuspension oben auf das trockene Gerüst ein.
    4. Wiederholen Sie die Schritte 2.2.1-2.2.3 für jedes Gerüst.
    5. Inkubieren Sie die Gerüste in einem Zellkulturinkubator bei 37 °C für 45-60 min. Entfernen Sie die Gerüste aus dem Inkubator; Die Gerüste absorbieren die Lösung während dieser Zeit vollständig.
    6. Um die Proliferation zu induzieren, fügen Sie vollständige Zellkulturmedien, ergänzt mit IL-15 (5 ng / ml) und IL-7 (10 ng / ml) zu jeder Vertiefung; IL-2 kann auch verwendet werden. Fügen Sie 500 μL zu jedem 48-Well-Gerüst oder 1 ml zu jedem 24-Well-Gerüst hinzu.
    7. Die Gerüste bei 37 °C 72 h inkubieren. Wenn sich die Zellen vermehren, werden die Medien orange.
  3. Isolieren Sie Zellen aus den Gerüsten für die Analyse.
    1. 0,5 M EDTA in 1x PBS auf 0,25 M EDTA verdünnen.
    2. Entfernen Sie überschüssiges Medium aus jeder Vertiefung und sammeln Sie es in separaten 15-ml-Zentrifugenröhrchen.
    3. Um Zellen aus dem Gerüst zu isolieren, fügen Sie 0,25 M EDTA zu jedem Gerüst hinzu. Fügen Sie 300 μL zu 48-Well-Gerüsten oder 1 ml zu 24-Well-Gerüsten hinzu. Lassen Sie den Teller 3-4 min ruhen oder rühren Sie ihn vorsichtig um.
    4. Sobald das Gerüst größtenteils aufgelöst ist, pipettieren Sie vorsichtig im Inneren des Brunnens. Ein paar ein- und ausgehende Pipettierschritte können notwendig sein, um das Gerüst vollständig aufzulösen. Wenn es sich nicht in 10 min auflöst, fügen Sie weitere 200 μL 0,25 M EDTA hinzu.
    5. Sobald sich das Gerüst vollständig aufgelöst hat, geben Sie die Lösung in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen.
    6. Wiederholen Sie die Schritte 2.3.4 und 2.3.5 für jedes Gerüst.
    7. Waschen Sie die Zellen zweimal, indem Sie 12 ml PBS in jedes Zentrifugenröhrchen geben und bei 400 × g für 5 min zentrifugieren. Am Boden jedes Röhrchens bildet sich ein Zellpellet. Saugen Sie den Überstand ab und wiederholen Sie die Wäsche. Achten Sie darauf, den Überstand bei jeder Wäsche vollständig abzusaugen, da es wichtig ist, das gesamte EDTA zu entfernen.
    8. Nach der zweiten Wäsche mit PBS ist das Zellpellet nun bereit für die Analyse. Befolgen Sie das entsprechende Protokoll, das für die Analyse erforderlich ist.

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Representative Results

Diese makroporösen Alginatgerüste sind einfach herzustellen und sollten als poröse, flauschige und weiße Scheiben aus dem Gefriertrockner kommen. Obwohl in diesem Experiment nicht untersucht, kann Calcium-Alginat-Lösung in verschiedene Formen gegossen werden, um Gerüste unterschiedlicher Form zu erzeugen, abhängig von den Bedürfnissen des Benutzers 9,10. Die Gerüste sind elektrostatisch und können am Deckel der Well-Platte oder an einem behandschuhten Finger haften. Abbildung 2 zeigt, wie die Gerüste nach Fertigstellung aussehen sollten. Ungefähre Abmessungen von 24- und 48-Well-Gerüsten sind ebenfalls in der Abbildung dargestellt.

Figure 2
Abbildung 2: Bilder von trockenen makroporösen Alginatgerüsten . (A) Eine 48-Well-Platte voller Gerüste. (B) Eine 24-Well-Platte voller Gerüste. (C) Vergleich eines 48-Well-Gerüsts mit einem 24-Well-Gerüst. Gerüstmaße werden ebenfalls angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die Porosität der Gerüste ist sehr wichtig für eine erfolgreiche Transduktion, und wir haben zuvor mit der Porosität der Gerüste experimentiert. Weitere Informationen zur Porosität, einschließlich REM-Bildern der Gerüste, finden Sie in den Artikeln von Agarwalla et. al. in den Referenzen17,18.

Die Transduktionseffizienz wurde mittels Durchflusszytometrie analysiert und die Ergebnisse sind in Abbildung 3 dargestellt. Gefrorene PBMCs desselben Spenders wurden aktiviert und für alle experimentellen Gruppen verwendet. Ein Protokoll zur Aktivierung von PBMCs finden Sie in der Zusatzdatei 1, und jede Standardmethode zur Aktivierung von T-Zellen und zur Validierung der Aktivierung kannverwendet werden 21,22,23. Die aktivierten PBMCs wurden entweder auf einem Gerüst mit GFP-kodierendem Retrovirus oder einem Gerüst ohne Virus, das als "leeres" Gerüst bezeichnet wird, ausgesät. Aktivierte PBMCs wurden auch auf Platten ausgesät, die mit Retronektin und GFP-kodierendem Retrovirus spinokuliert wurden, um die Transduktionseffizienz der Alginatgerüste mit der herkömmlichen Methode zu vergleichen. Als Negativkontrollgruppe wurden nicht transduzierte (NT) Zellen aktivierte PBMCs verwendet, die in unbeschichteten Vertiefungen einer 24-Well-Platte ausgesät wurden. Wie erwartet, zeigten die nicht transduzierten Zellen und die aus dem leeren Gerüst isolierten Zellen keine Transduktion. Aus dem Gerüst isolierte Zellen, die mit aktivierten PBMCs und GFP-Retroviren gesät wurden, zeigten eine vergleichbare Transduktionseffizienz wie die retronektinbeschichteten Platten. Das Gerüst hatte eine durchschnittliche Transduktionseffizienz von 85%, knapp unter der Retronektingruppe. Diese Ergebnisse zeigen, dass diese Alginatgerüste eine einfachere und kostengünstigere Alternative zur viralen Transduktion von T-Zellen darstellen, ohne dass eine Spinokulation von Retronektin erforderlich ist.

Figure 3
Abbildung 3: FACS-Quantifizierung der Transduktionseffizienz . (A) FACS-Diagramme, die die GFP-Expression zeigen. Die Zellen wurden auf lebensfähigen Zellen, FSC-Singuletts und GFP-positiven Zellen eingezäunt. (B) Quantifizierung von GFP-positiven Zellen durch FACS. Als Positivkontrolle wurde die konventionelle Spinokulation von retronektinbeschichteten Platten (violettes umgekehrtes Dreieck) verwendet. Nicht transduzierte Zellen (blauer Kreis) und aktivierte Zellen, die auf den Alginatgerüsten ohne Virus (rotes Quadrat) ausgesät wurden, wurden als Negativkontrollen verwendet. Gerüste, die mit aktivierten Zellen und GFP-Retrovirus (grünes Dreieck) ausgesät wurden, hatten eine Transduktionseffizienz von 85%, vergleichbar mit Retronektin. Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung mit n = 4 dargestellt. Abkürzungen: GFP = grün fluoreszierendes Protein; FACS = fluoreszenzaktivierte Zellsortierung; SSC-A = Seitenstreu-Peak-Fläche; FSC = Vorwärtsstreuung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Zusatzdatei 1: Protokoll zur Aktivierung von Zellen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S1: Bilder von trockenen makroporösen Alginatgerüsten, die bei -80 °C hergestellt wurden. Das Einfrieren von Gerüsten bei -80 °C führt zu einem weniger gleichmäßigen Aussehen und einer weniger gleichmäßigen Funktion des Gerüsts als beim Einfrieren bei -20 °C. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Die CAR-T-Zelltherapie gewinnt weiterhin an Interesse sowohl für die Forschung als auch für kommerzielle Anwendungen. Trotz des Erfolgs der CAR-T-Zelltherapie bei der Behandlung von Blutkrebs schränken die hohen Kosten des Verfahrens seine Verwendung ein. Das hier vorgestellte Protokoll stellt eine neue Methode für den viralen Gentransfer von T-Zellen vor, ohne dass eine Spinokulation von retronektinbeschichteten Platten erforderlich ist. Die Herstellung trockener makroporöser Alginatgerüste zur Vermittlung der Transduktion ist relativ einfach und ein geeigneter kostengünstiger Ersatz für das herkömmliche Verfahren.

Gelegentlich kann sich das Aussehen des Gerüsts von dem in Abbildung 2 gezeigten unterscheiden und stattdessen klar und kristallin statt weiß und flauschig erscheinen. Dies kann durch inkonsistentes Einfrieren bei -20 °C aufgrund wiederholten Öffnens der Gefriertür auftreten oder wenn die einzufrierende Platte isoliert ist, indem sie sich neben oder auf sperrigen Gegenständen im Gefrierschrank befindet. Trotz des unterschiedlichen Aussehens hat unser Labor keinen Unterschied in der Transduktionseffizienz mit den kristallinen Gerüsten festgestellt. Obwohl frühere Arbeiten zur Kryogelierung niedrigere Gefriertemperaturen24,25 verwendet haben, haben wir festgestellt, dass das Einfrieren bei niedrigeren Temperaturen zu einem weniger konsistenten Aussehen und einer weniger konsistenten Funktion des Gerüsts führt als beim Einfrieren bei -20 ° C. Bilder eines Gerüsts, das durch Einfrieren bei -80 °C entstanden ist, finden Sie in der ergänzenden Abbildung S1. Daher wird immer noch empfohlen, Gerüste bei -20 ° C mit minimaler Störung einzufrieren und die Platte auf ein Regal zu stellen, das einen Luftstrom unter der Platte ermöglicht.

Obwohl diese Gerüste eine ausgezeichnete Transduktionseffizienz gezeigt haben, sollten einige Einschränkungen beachtet werden. Erstens ist bei der Arbeit mit EDTA Vorsicht geboten, die die Lebensfähigkeit der Zellen auch in kleinen Mengen einschränken kann. Daher sollte EDTA vollständig entfernt werden. Darüber hinaus begrenzt die Gerüstgröße die Menge an Flüssigkeit, die absorbiert werden kann, und damit die Anzahl der Zellen, die übertragen werden können. Schließlich kann dieses Protokoll nicht verwendet werden, um nicht aktivierte T-Zellen zu transduzieren. Zukünftige Arbeiten werden sich auf die Berichterstattung über die Herstellung von Gerüsten konzentrieren, die in der Lage sind, gleichzeitig die Aktivierung und Proliferation von Zellen zu vermitteln, die Kolokalisierung von Zellen und viralen Partikeln für die Transduktion zu fördern und voll funktionsfähige transduzierte Zellen in vivofreizusetzen 18.

Veröffentlichte Studien unseres Labors berichten über die phänotypische Analyse und Funktionalität von CAR-T-Zellen, die mit diesen Gerüsten erzeugt werden. Die CD19-spezifischen CAR-T-Zellen, die von diesen Gerüsten produziert wurden, behielten den Effektor-Phänotyp bei und waren in der Lage, CD19+ Daudi-Zellen in vitro zu eliminieren, wenn sie in einem 1:5-Effektor-zu-Ziel-Verhältnis co-kultiviert wurden17. Die mit Daudi-Zellen kokultivierten CAR-T-Zellen setzten auch IL-2 und IFN-γ frei, proinflammatorische Zytokine, die darauf hinweisen, dass die T-Zellen aktiviert sind. Diese Ergebnisse zeigen, dass diese Gerüste in vitro hochfunktionelle CAR-T-Zellen produzieren. CAR-T-Zellen, die von diesen Gerüsten erzeugt wurden, zeigten eine ausgezeichnete In-vivo-Antitumorfunktion gegen CD19+ Daudi-Zellen, die mit Glühwürmchen-Luciferase markiert waren. Die CAR-T-Zellen kontrollierten effektiv das Tumorwachstum, verbesserten die Gesamtüberlebensrate und zeigten keine signifikanten Anzeichen von Toxizität17. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass diese Gerüste verwendet werden können, um Zellen für die CAR-T-Zelltherapie genetisch zu verändern, ohne die Funktionalität und Antitumoraktivität der Zellen zu beeinträchtigen. Zukünftige Studien mit diesen Alginatgerüsten beinhalten die Optimierung der Transduktionseffizienz durch Anpassung der Makroporosität sowie der Alginat- und Calciumkonzentrationen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese makroporösen Alginatgerüste eine vergleichbare Transduktionseffizienz wie Retronektin aufweisen und eine alternative Methode zur Übertragung von Zellen für die CAR-T-Zelltherapie darstellen. Diese Gerüste produzieren auch voll funktionsfähige CAR-T-Zellen mit Antitumoraktivität sowohl in vitro als auch in vivo17. Drydux-Gerüste bieten eine alternative Methode, die einfach und kostengünstig ist, um T-Zellen für den Einsatz in CAR-T-Zelltherapien zu transduzieren.

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Disclosures

P.A. und Y.B. sind Erfinder von Patenten im Zusammenhang mit der Verwendung von Biomaterialien zur Erzeugung von CAR-T-Zelltherapeutika. Y.B. erhält ein von der Industrie gesponsertes Forschungsstipendium im Zusammenhang mit der therapeutischen CAR-T-Zelltechnologie (unabhängig von dieser Arbeit). Alle anderen Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit diesem Artikel haben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health durch die Grant Award Nummern R37-CA260223, R21CA246414 unterstützt. Wir danken dem NCSU-Durchflusszytometrie-Kern für die Schulung und Anleitung zur Durchflusszytometrie-Analyse. Schaltpläne wurden mit Biorender.com erstellt

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA Invitrogen 15575-038 UltraPure, pH 8.0
1x DPBS Gibco 14190-144 No calcium chloride or magnesium chloride
3% Acetic Acid with Methylene Blue Stemcell Technologies Inc 07060
Activated Periphreal Blood Mononuclear Cells - - Fresh or frozen
Calcium-D-Gluconate Alfa Aesar A11649
CD28.2 Antibody BD 555725 1 mg/mL
CD3 Antibody Miltenyi 130-093-387 100 μg/mL
Click's Media FUJIFILM IRVINE SCIENTIFIC MS 9195
DI Water - -
Glutamax Gibco 35-050-061
HyClone FBS Cytvia SH3039603
HyClone RPMI 1640 Media Cytvia SH3009601
Penicillin-streptomycin (P/S) Gibco 15-140-122
Peripheral Blood Mononuclear Cells - - Fresh or frozen
PRONOVA UP MVG NovaMatrix 4200101 Sodium alginate
Recombinant Human IL-15 Peprotech 200-15 5 ng/mL
Recombinant Human IL-7 Peprotech 200-07 10 ng/mL
Retrovirus - - 1 x 106 TU/mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Bioengineering Ausgabe 187 Biomaterialgerüst Alginat makroporös virale Transduktion Immuntherapie CAR-T-Zellen
Herstellung und Verwendung von trockenen makroporösen Alginatgerüsten für die virale Transduktion von T-Zellen
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VanBlunk, M., Agarwalla, P., Pandit, … More

VanBlunk, M., Agarwalla, P., Pandit, S., Brudno, Y. Fabrication and Use of Dry Macroporous Alginate Scaffolds for Viral Transduction of T Cells. J. Vis. Exp. (187), e64036, doi:10.3791/64036 (2022).

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