Rekonstitution von Septin-Assemblierungen an Membranen zur Untersuchung biophysikalischer Eigenschaften und Funktionen
Summary
Die zellfreie Rekonstitution war ein Schlüsselwerkzeug, um die Zytoskelett-Montage zu verstehen, und die Arbeit in den letzten zehn Jahren hat Ansätze zur Untersuchung der Septindynamik in minimalen Systemen etabliert. Hier werden drei komplementäre Methoden zur Beobachtung der Septinmontage in verschiedenen Membrankontexten vorgestellt: planare Doppelschichten, sphärische Stützen und Stabstützen.
Abstract
Die meisten Zellen können ihre Form wahrnehmen und verändern, um grundlegende Zellprozesse durchzuführen. Bei vielen Eukaryoten ist das Septin-Zytoskelett ein integraler Bestandteil bei der Koordination von Formveränderungen wie Zytokinese, polarisiertem Wachstum und Migration. Septine sind filamentbildende Proteine, die sich zu verschiedenen Strukturen höherer Ordnung zusammensetzen und in vielen Fällen in verschiedenen Bereichen der Plasmamembran vorkommen, insbesondere in Regionen mit positiver Krümmung im Mikrometerbereich. Die Überwachung des Prozesses der Septinmontage in vivo wird durch die Einschränkungen der Lichtmikroskopie in Zellen sowie durch die Komplexität der Wechselwirkungen mit Membranen und Zytoskelettelementen behindert, was es schwierig macht, die Septindynamik in lebenden Systemen zu quantifizieren. Glücklicherweise gab es in den letzten zehn Jahren erhebliche Fortschritte bei der Rekonstitution des Septin-Zytoskeletts in einem zellfreien System, um die Mechanismen zu sezieren, die die Septin-Assemblierung bei hohen räumlichen und zeitlichen Auflösungen steuern. Die Kernschritte der Septin-Assemblierung umfassen die Septin-Heterooligomer-Assoziation und Dissoziation mit der Membran, die Polymerisation in Filamente und die Bildung von Strukturen höherer Ordnung durch Wechselwirkungen zwischen Filamenten. Hier stellen wir drei Methoden vor, um die Septinmontage in verschiedenen Kontexten zu beobachten: planare Doppelschichten, sphärische Stützen und Stabstützen. Diese Methoden können verwendet werden, um die biophysikalischen Parameter von Septinen in verschiedenen Stadien der Montage zu bestimmen: als einzelne Oktamere, die die Membran binden, als Filamente und als Anordnungen von Filamenten. Wir verwenden diese Parameter gepaart mit Messungen der Krümmungsprobenahme und der bevorzugten Adsorption, um zu verstehen, wie die Krümmungsmessung auf einer Vielzahl von Längen- und Zeitskalen funktioniert.
Introduction
Die Formen der Zellen und viele ihrer inneren Kompartimente hängen von den Lipidmembranen ab, die sie umgeben. Membranen sind viskoelastische Strukturen, die durch Wechselwirkungen mit Proteinen, Lipidsortierung und wirkende innere und äußere Kräfte verformt werden können, um eine Vielzahl von Formenzu erzeugen 1,2,3,4. Diese Formen werden oft in Form von Membrankrümmung beschrieben. Zellen verwenden eine Vielzahl von Proteinen, die in der Lage sind, sich bevorzugt auf bestimmte Membrankrümmungen zu setzen oder diese zu “erfassen”, um eine definierte räumlich-zeitliche Kontrolle über Prozesse wie Zellverkehr, Zytokinese und Migration sicherzustellen 5,6. Die Dynamik der Zellmaschinerie an der Membran ist aufgrund der Schwierigkeit, Zeit und räumliche Auflösung mit der Zellgesundheit in Einklang zu bringen, besonders schwer zu beobachten. Während Super-Resolution-Techniken eine detaillierte Ansicht solcher Strukturen bieten können, erfordern sie langwierige Akquisitionen, die für die meisten Maschinen nicht für die Zeitskalen der Montage / Demontage zugänglich sind. Darüber hinaus machen die molekulare Komplexität dieser Baugruppen in ihrer nativen Umgebung und die Vielzahl der Rollen, die eine einzelne Komponente spielen kann, minimale Rekonstitutionssysteme zu einem wertvollen Werkzeug für die Untersuchung der Funktionsfähigkeit von Molekülen.
Minimale Membranmimetika wurden entwickelt, um Membraneigenschaften und Protein-Membran-Interaktionen außerhalb der Zelle zu untersuchen. Die Membranmimetik variiert von freistehenden Lipiddoppelschichten wie Liposomen oder riesigen unilamellären Vesikeln bis hin zu unterstützten Lipiddoppelschichten (SLBs) 7,8,9,10. SLBs sind biomimetische Membranen, die auf dem darunter liegenden Träger verankert sind und typischerweise aus Glas, Glimmer oder Kieselsäure11,12 bestehen. Eine Vielzahl von Geometrien kann verwendet werden, einschließlich planarer Oberflächen, Kugeln, Stäbchen und sogar wellenförmiger oder mikrostrukturierter Substrate, um Protein-Membran-Wechselwirkungen auf konkaven und konvexen Krümmungen gleichzeitig zu untersuchen1 3,14,15,16,17,18 . Die Bilayer-Bildung beginnt mit der Adsorption von Vesikeln auf eine hydrophile Oberfläche, gefolgt von Fusion und Bruch zu einer kontinuierlichen Doppelschicht (Abbildung 1)19. Unterstützte Doppelschichten sind besonders licht- und elektronenmikroskopisch zugänglich und bieten sowohl eine bessere zeitliche als auch eine bessere räumliche Auflösung, als dies in Zellen oft möglich ist. Gekrümmte SLBs bieten insbesondere ein attraktives Mittel, um die Proteinkrümmungsempfindlichkeit ohne signifikante Membranverformung zu untersuchen, so dass zwischen Krümmungsmessung und Krümmungsinduktion unterschieden werden kann, die in freistehenden Systemen oft unmöglich zu trennen sind.
Septine sind eine Klasse von filamentbildenden zytoskelettalen Proteinen, die für ihre Fähigkeit bekannt sind, sich auf positiv gekrümmten Membranen zu sammeln 6,18,20. Im Laufe des Zellzyklus in Hefe lagern sich Septine zu einem Ring zusammen und müssen sich neu anordnen, um die Sanduhr- und Doppelringstrukturen zu bilden, die mit der Knospenentstehung bzw. Zytokinese verbunden sind21. Während schöne Arbeiten mit Platin-Replikatelektronenmikroskopie durchgeführt wurden, um die Septinarchitektur in verschiedenen Zellzyklusstadien22 zu beobachten, ist die Beobachtung der Septin-Montage im Laufe der Zeit mit Lichtmikroskopie in Hefe auf eine begrenzte räumliche Auflösung gestoßen. Frühere Arbeiten an Septinen unter Verwendung von Lipidmonoschichten, die durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) sichtbar gemacht wurden, konnten mehrere interessante Septinstrukturen wie Ringe, Bündel und Gazerekonstruieren 23. Im Gegensatz zur Fluoreszenzmikroskopie sind EM-Techniken jedoch ebenfalls in ihrer zeitlichen Auflösung begrenzt. Um die kinetischen Parameter des Multiskalenprozesses der Septin-Montage besser zu lösen, haben wir uns der unterstützten Membranmimetik zugewandt, bei der die Membrangeometrie, die Probenbedingungen und die Bildgebungsmodalität sorgfältig kontrolliert werden können.
Die hier beschriebenen Protokolle verwenden planare oder gekrümmte SLBs, gereinigtes Protein und eine Kombination von Mikroskopietechniken. Die quantitative Fluoreszenzkonfokalmikroskopie und die totale interne Reflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRFM) wurden verwendet, um sowohl die Bindung von Massenproteinen an verschiedene Membrankrümmungen als auch die Bindungskinetik einzelner Moleküle zu messen. Darüber hinaus wurde dieses Protokoll angepasst, um mit der Rasterelektronenmikroskopie (REM) verwendet zu werden, um die Proteinultrastruktur auf verschiedenen Membrankrümmungen zu untersuchen. Während der Fokus dieser Protokolle auf dem Septin-Zytoskelett liegt, können die Protokolle leicht modifiziert werden, um die Krümmungsempfindlichkeit jedes Proteins zu untersuchen, das der Leser interessant findet. Darüber hinaus können diejenigen, die in Bereichen wie Endozytose oder vesikulärem Verkehr arbeiten, diese Techniken nützlich finden, um die krümmungsabhängigen Anordnungen von Multiproteinkomplexen zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zellmembranen nehmen viele verschiedene Formen, Krümmungen und physikalisch-chemische Eigenschaften an. Um die nanometergroße Maschinerie zu untersuchen, durch die Zellen mikrometergroße Baugruppen aufbauen, ist es notwendig, minimale Rekonstitutionssysteme der Membranmimetik zu entwerfen. Dieses Protokoll stellt Techniken vor, die sowohl die Membrankrümmung als auch die Zusammensetzung präzise steuern und es dem Benutzer ermöglichen, quantitative Fluoreszenzmessungen mit weit verbreiteten Mikroskopietechniken durc…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch den National Institutes of Health (NIH) Grant Nr. R01 GM-130934 und National Science Foundation (NSF) Grant MCB-2016022. B.N.C., E.J.D.V. und K.S.C. wurden zum Teil durch einen Zuschuss des National Institute of General Medical Sciences im Rahmen der Auszeichnung T32 GM119999 unterstützt.
Materials
| 0.2 mL PCR Tubes with flat cap, Natural | Watson | 137-211C(EX) | |
| 0.5 mL low adhesion tubes | USA Scientific | 1405-2600 | |
| Beta mercaptoethanol (BME) | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4612-25G | |
| Coverglass for making PEGylated coverslips | Thermo Scientific | 152450 | Richard-Allan Scientific SLIP-RITE Cover Glass 24×50 #1.5 |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375 | |
| Egg Liss Rhodamine PE | Avanti Polar Lipids | 810146 | |
| EMS Glutaraldehyde Aqueous 25%, EM Grade | VWR | 16220 | |
| EMS Sodium Cacodylate Buffer | VWR | 11652 | |
| Ethanol, 200 proof | Fisher Scientific | 04-355-223EA | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-1KG | |
| Hexamethyldisilazane | Sigma-Aldrich | 440191 | |
| Magnesium chloride | VWR | 7791-18-6 | |
| Methyl cellulose 4000cp | Sigma-Aldrich | M052-100G | |
| Microglass coverslips for planar bilayers | Matsunami | Discontinued | 22×22 |
| Mini centrifuge | |||
| Non-Functionalized Silica Microspheres | Bangs Laboratories, Inc. | Depends on size: SS0200*-SS0500* | Silica in aqueous suspension |
| Optical Adhesive | Norland Thorlabs | NOA 68 | Flexible adhesive for glass or plastics |
| Osmium tetroxide | Millipore Sigma | 20816-12-0 | |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| Plasma Cleaner | Plasma Etch | PE-25 | Voltage: 120V, 60Hz. Current: 15 AMPS |
| Potassium chloride | VWR | 0395-1kg | |
| Round coverglass, #1.5 12mm | VWR | 64-0712 | |
| Sonicator bath | Branson | 1510R-MT | Bransonic Ultrasonic cleaner. 50-60 Hz. Output: 70W |
| Soy PI | Avanti Polar Lipids | 840044 | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 22331 | |
| UV Lamp | Spectroline | ENF-260C | 115 Volts, 60 Hz, 0.20 AMPS |
| WhatmanGlass Microfiber Filter Paper | VWR | 28455-030 | 42.5 mm diameter, Grade GF/C |
Referências
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