Ricostituzione dell'assemblaggio di septina alle membrane per lo studio delle proprietà e delle funzioni biofisiche

Summary

La ricostituzione senza cellule è stata uno strumento chiave per comprendere l’assemblaggio del citoscheletro e il lavoro nell’ultimo decennio ha stabilito approcci per studiare la dinamica della settina in sistemi minimi. Qui sono presentati tre metodi complementari per osservare l’assemblaggio della settina in diversi contesti di membrana: doppi strati planari, supporti sferici e supporti per aste.

Abstract

La maggior parte delle cellule può percepire e cambiare la propria forma per eseguire processi cellulari fondamentali. In molti eucarioti, il citoscheletro della settina è una componente integrante nel coordinare i cambiamenti di forma come la citochinesi, la crescita polarizzata e la migrazione. Le settine sono proteine che formano filamenti che si assemblano per formare diverse strutture di ordine superiore e, in molti casi, si trovano in diverse aree della membrana plasmatica, in particolare nelle regioni di curvatura positiva su scala micron. Il monitoraggio del processo di assemblaggio della settina in vivo è ostacolato dalle limitazioni della microscopia ottica nelle cellule, nonché dalla complessità delle interazioni sia con le membrane che con gli elementi citoscheletrici, rendendo difficile quantificare la dinamica della settina nei sistemi viventi. Fortunatamente, ci sono stati progressi sostanziali nell’ultimo decennio nella ricostituzione del citoscheletro della settina in un sistema privo di cellule per sezionare i meccanismi che controllano l’assemblaggio della settina ad alte risoluzioni spaziali e temporali. Le fasi principali dell’assemblaggio della settina includono l’associazione e la dissociazione dell’eterooligomero della settina con la membrana, la polimerizzazione in filamenti e la formazione di strutture di ordine superiore attraverso le interazioni tra i filamenti. Qui, presentiamo tre metodi per osservare l’assemblaggio della settina in diversi contesti: doppi strati planari, supporti sferici e supporti per aste. Questi metodi possono essere utilizzati per determinare i parametri biofisici delle settine in diverse fasi di assemblaggio: come singoli ottameri che legano la membrana, come filamenti e come gruppi di filamenti. Utilizziamo questi parametri abbinati a misurazioni del campionamento della curvatura e dell’adsorbimento preferenziale per capire come funziona il rilevamento della curvatura in una varietà di scale di lunghezza e tempo.

Introduction

Le forme delle cellule e molti dei loro compartimenti interni dipendono dalle membrane lipidiche che le circondano. Le membrane sono strutture viscoelastiche che possono essere deformate attraverso interazioni con proteine, selezione lipidica e forze interne ed esterne che agiscono per generare una varietà di forme 1,2,3,4. Queste forme sono spesso descritte in termini di curvatura della membrana. Le cellule utilizzano una suite diversificata di proteine in grado di assemblarsi preferenzialmente su particolari curvature di membrana per garantire un controllo spazio-temporale definito su processi tra cui il traffico cellulare, la citochinesi e la migrazione ^5,6. La dinamica dei macchinari cellulari sulla membrana è notevolmente difficile da osservare a causa della difficoltà di bilanciare il tempo e la risoluzione spaziale con la salute delle cellule. Mentre le tecniche di super-risoluzione possono offrire una visione dettagliata di tali strutture, richiedono lunghe acquisizioni che non sono suscettibili ai tempi di assemblaggio / smontaggio per la maggior parte dei macchinari. Inoltre, la complessità molecolare di questi assemblaggi nel loro ambiente nativo e la moltitudine di ruoli che un singolo componente può svolgere rendono i sistemi di ricostituzione minimi uno strumento prezioso per studiare la capacità funzionale delle molecole.

Sono stati sviluppati mimetici di membrana minimi per studiare le proprietà della membrana e le interazioni proteina-membrana al di fuori della cellula. I mimetici di membrana variano da doppi strati lipidici indipendenti, come liposomi o vescicole unilamellari giganti, a doppi strati lipidici supportati (SLB)7,8,9,10. Le SLB sono membrane biomimetiche ancorate al supporto sottostante, tipicamente composte da vetro, mica o silice^11,12. È possibile utilizzare una varietà di geometrie, tra cui superfici planari, sfere, barre e persino substrati ondulati o micropatterati per sondare simultaneamente le interazioni proteina-membrana su curvature concave e convesse¹ 3,14,15,16,17,18 . La formazione di due strati inizia con l’adsorbimento delle vescicole su una superficie idrofila, seguita dalla fusione e dalla rottura per formare un doppio strato continuo (Figura 1)¹⁹. I doppi strati supportati sono particolarmente suscettibili alla microscopia ottica ed elettronica, fornendo sia una migliore risoluzione temporale che spaziale rispetto a quella spesso ottenibile nelle cellule. Le SLB curve forniscono in particolare un mezzo interessante per sondare la sensibilità alla curvatura delle proteine in assenza di una significativa deformazione della membrana, consentendo di distinguere tra rilevamento della curvatura e induzione della curvatura, che sono spesso impossibili da separare nei sistemi indipendenti.

Le settine sono una classe di proteine citoscheletriche che formano filamenti ben note per la loro capacità di assemblarsi su membrane curve positive ^6,18,20. Nel corso del ciclo cellulare nel lievito, le settine si assemblano in un anello e devono riorganizzarsi per formare le strutture a clessidra e a doppio anello associate all’emergenza delle gemme e alla citochinesi, rispettivamente²¹. Mentre un bel lavoro è stato fatto usando la microscopia elettronica replica al platino per osservare l’architettura della settina in vari stadi del ciclo cellulare²², guardare l’assemblaggio della settina nel tempo usando la microscopia ottica nel lievito ha incontrato una risoluzione spaziale limitata. Precedenti lavori sulle settine utilizzando monostrati lipidici visualizzati mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM) sono stati in grado di ricostituire diverse strutture di settina interessanti come anelli, fasci e garze²³. Tuttavia, le tecniche EM sono anche limitate nella loro risoluzione temporale, a differenza della microscopia a fluorescenza. Al fine di risolvere meglio i parametri cinetici del processo multiscala di assemblaggio della settina, ci siamo rivolti alla mimetica di membrana supportata, dove è possibile controllare attentamente la geometria della membrana, le condizioni del campione e la modalità di imaging.

I protocolli qui descritti utilizzano SLB planari o curvi, proteine purificate e una combinazione di tecniche di microscopia. La microscopia confocale a fluorescenza quantitativa e la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRFM) sono state utilizzate sia per misurare il legame proteico di massa su varie curvature di membrana, sia per misurare la cinetica di legame di singole molecole. Inoltre, questo protocollo è stato adattato per essere utilizzato con la microscopia elettronica a scansione (SEM) per esaminare l’ultrastruttura proteica su diverse curvature della membrana. Mentre il focus di questi protocolli è sul citoscheletro della settina, i protocolli possono essere facilmente modificati per indagare la sensibilità alla curvatura di qualsiasi proteina che il lettore trova interessante. Inoltre, coloro che lavorano in campi come l’endocitosi o il traffico vescicolare possono trovare queste tecniche utili per sondare gli assemblaggi dipendenti dalla curvatura di complessi multi-proteici.

Protocol

NOTA: la formazione di doppi strati lipidici supportati richiede la preparazione di piccole vescicole unilamellari monodisperse (SUV). Si prega di fare riferimento a un protocollo24 precedentemente pubblicato sulla formazione di SUV. In breve, tutti i SUV sono formati dalla sonicazione della sonda per 12 minuti in totale al 70% di ampiezza attraverso periodi di sonicazione di 4 minuti seguiti da periodi di riposo di 2 minuti in acqua ghiacciata. Le soluzioni SUV devono essere ben chiarite e monodi…

Representative Results

Dopo la preparazione di ogni SLB, le settine o la proteina di interesse possono essere incubate con il supporto desiderato e fotografate tramite TIRFM, microscopia confocale o SEM. I risultati mostrati qui utilizzano settine espresse in modo ricombinante e purificate da E. coli17. Utilizzando TIRFM su SLB planari, è possibile determinare la lunghezza dei filamenti e la loro flessibilità, misurare i coefficienti di diffusione e osservare l’assemblaggio nel tempo28,29</s…

Discussion

Le membrane cellulari assumono molte forme, curvature e proprietà fisico-chimiche diverse. Per studiare il meccanismo su scala nanometrica attraverso il quale le cellule costruiscono assemblaggi su scala micrometrica, è necessario progettare sistemi di ricostituzione minimi di mimetica a membrana. Questo protocollo presenta tecniche che controllano con precisione sia la curvatura della membrana che la composizione, consentendo all’utente di effettuare facilmente misurazioni quantitative di fluorescenza utilizzando tecn…

Materials

0.2 mL PCR Tubes with flat cap, Natural	Watson	137-211C(EX)
0.5 mL low adhesion tubes	USA Scientific	1405-2600
Beta mercaptoethanol (BME)	Sigma-Aldrich	M6250-100ML
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A4612-25G
Coverglass for making PEGylated coverslips	Thermo Scientific	152450	Richard-Allan Scientific SLIP-RITE Cover Glass 24×50 #1.5
DOPC	Avanti Polar Lipids	850375
Egg Liss Rhodamine PE	Avanti Polar Lipids	810146
EMS Glutaraldehyde Aqueous 25%, EM Grade	VWR	16220
EMS Sodium Cacodylate Buffer	VWR	11652
Ethanol, 200 proof	Fisher Scientific	04-355-223EA
HEPES	Sigma Aldrich	H3375-1KG
Hexamethyldisilazane	Sigma-Aldrich	440191
Magnesium chloride	VWR	7791-18-6
Methyl cellulose 4000cp	Sigma-Aldrich	M052-100G
Microglass coverslips for planar bilayers	Matsunami	Discontinued	22×22
Mini centrifuge
Non-Functionalized Silica Microspheres	Bangs Laboratories, Inc.	Depends on size: SS0200*-SS0500*	Silica in aqueous suspension
Optical Adhesive	Norland Thorlabs	NOA 68	Flexible adhesive for glass or plastics
Osmium tetroxide	Millipore Sigma	20816-12-0
Parafilm	VWR	52858-000
Plasma Cleaner	Plasma Etch	PE-25	Voltage: 120V, 60Hz. Current: 15 AMPS
Potassium chloride	VWR	0395-1kg
Round coverglass, #1.5 12mm	VWR	64-0712
Sonicator bath	Branson	1510R-MT	Bransonic Ultrasonic cleaner. 50-60 Hz. Output: 70W
Soy PI	Avanti Polar Lipids	840044
Tabletop centrifuge	Eppendorf	22331
UV Lamp	Spectroline	ENF-260C	115 Volts, 60 Hz, 0.20 AMPS
WhatmanGlass Microfiber Filter Paper	VWR	28455-030	42.5 mm diameter, Grade GF/C