Microfluïdica-geassisteerde selectieve depolarisatie van axonale mitochondriën
Summary
Het huidige protocol beschrijft het zaaien en kleuren van neuronale mitochondriën in microfluïdische kamers. De vloeiende drukgradiënt in deze kamers maakt de selectieve behandeling van mitochondriën in axonen mogelijk om hun eigenschappen te analyseren als reactie op farmacologische uitdagingen zonder het cellichaamcompartiment te beïnvloeden.
Abstract
Mitochondriën zijn de primaire leveranciers van ATP (adenosinetrifosfaat) in neuronen. Mitochondriale disfunctie is een veel voorkomend fenotype bij veel neurodegeneratieve ziekten. Gezien de uitgebreide architectuur en extreme lengte van sommige axonen, is het niet verrassend dat mitochondriën in axonen verschillende omgevingen kunnen ervaren in vergelijking met hun tegenhangers van het cellichaam. Interessant is dat disfunctie van axonale mitochondriën vaak voorafgaat aan effecten op het cellichaam. Om axonale mitochondriale disfunctie in vitro te modelleren, maken microfluïdische apparaten behandeling van axonale mitochondriën mogelijk zonder de somale mitochondriën te beïnvloeden. De fluïde drukgradiënt in deze kamers voorkomt diffusie van moleculen tegen de gradiënt, waardoor analyse van mitochondriale eigenschappen mogelijk is als reactie op lokale farmacologische uitdagingen binnen axonen. Het huidige protocol beschrijft het zaaien van gedissocieerde hippocampusneuronen in microfluïdische apparaten, kleuring met een membraanpotentiaal gevoelige kleurstof, behandeling met een mitochondriaal toxine en de daaropvolgende microscopische analyse. Deze veelzijdige methode om axonale biologie te bestuderen kan worden toegepast op veel farmacologische verstoringen en beeldvormingsuitlezingen en is geschikt voor verschillende neuronale subtypen.
Introduction
Mitochondriën zijn de belangrijkste leveranciers van ATP (adenosinetrifosfaat) in neuronen. Aangezien neuronale gezondheid nauw verbonden is met mitochondriale functie, is het niet verrassend dat disfunctionele regulatie van deze organellen in verband is gebracht met het ontstaan van verschillende neurodegeneratieve ziekten, waaronder de ziekte van Parkinson1. Bovendien is mitochondriale intoxicatie met succes gebruikt om parkinsonsymptomen bij dieren 2 temodelleren. In zowel diermodellen als menselijke ziekten begint de ondergang van neuronen bij de distale delen 3,4, wat erop wijst dat axonale mitochondriën mogelijk vatbaarder zijn voor beledigingen. De biologie van mitochondriën in axonen is echter niet goed begrepen vanwege de moeilijkheden die gepaard gaan met gerichte behandeling en analyse van axonale mitochondriën zonder gelijktijdige verstoring van cellichaamsprocessen.
Recente ontwikkelingen in kweektechnieken van gedissocieerde neuronen in vitro maken nu de vloeiende scheiding van axonen en cellichamen mogelijk via microfluïdische apparaten5. Zoals afgebeeld in figuur 1A, hebben deze apparaten vier toegangsputten (a / h pt c / i), met twee kanalen die elk paar verbinden (d pt f). De grote kanalen zijn met elkaar verbonden door een reeks van 450 μm lange microkanalen (e). Opzettelijke verschillen in de vulniveaus tussen de twee kamers creëren een vloeistofdrukgradiënt (figuur 1B) die de diffusie van kleine moleculen van het kanaal met een lager vloeistofniveau naar de andere kant voorkomt (figuur 1C, geïllustreerd met Trypan blauwe kleurstof).
We hebben onlangs microfluïdische apparaten gebruikt om lokale vertaalvereisten in axonale mitofagie te bestuderen, de selectieve verwijdering van beschadigde mitochondriën6. In dit protocol worden verschillende stappen gepresenteerd om lokale mitochondriale schade te induceren door selectieve behandeling van axonen met behulp van de mitochondriale complex III-remmer Antimycine A 6,7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het huidige protocol beschrijft een methode om gedissocieerde hippocampale neuronen te zaaien en te kweken in een microfluïdisch apparaat om axonale mitochondriën afzonderlijk te behandelen. Het nut van deze aanpak met de membraangevoelige kleurstof TMRE en de complexe III-remmer Antimycine A (zoals eerder aangetoond7) wordt hier gedemonstreerd, maar deze methode kan gemakkelijk worden aangepast aan andere mitochondriale kleurstoffen of genetisch gecodeerde sensoren van mitochondriale functies d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door de Duitse Onderzoeksstichting (HA 7728/2-1 en EXC2145 Project ID 390857198) en de Max Planck Society.
Materials
| 6-well Glass bottom plate | Cellvis | P06.1.5H-N | Silicone device |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| EVOS M5000 widefield microscope | Thermofischer Scientific | EVOS M5000 | fully integrated digital widefield microscope |
| Hibernate E | BrainBits | HE500 | |
| Inverted spinning disk confocal | Nikon | TI2-E + CSU-W1 | With incubator chamber |
| Laminin | Invitrogen | L2020 | |
| Microfluidic devices | XONA microfluidics | RD450 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P2636 | |
| TMRE | Sigma | 87917 |
Referências
- Murali Mahadevan, H., Hashemiaghdam, A., Ashrafi, G., Harbauer, A. B. Mitochondria in neuronal health: from energy metabolism to Parkinson’s disease. Advanced Biology. 5 (9), 2100663 (2021).
- Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson’s disease: mechanisms and models. Neuron. 39 (6), 889-909 (2003).
- Moratalla, R., et al. Differential vulnerability of primate caudate-putamen and striosome-matrix dopamine systems to the neurotoxic effects of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6- tetrahydropyridine. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (9), 3859-3863 (1992).
- Cheng, H. -. C., Ulane, C. M., Burke, R. E. Clinical progression in Parkinson disease and the neurobiology of axons. Annals of Neurology. 67 (6), 715-725 (2010).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature Methods. 2 (8), 599-605 (2005).
- Harbauer, A. B., et al. Neuronal mitochondria transport Pink1 mRNA via synaptojanin 2 to support local mitophagy. Neuron. 110 (9), 1516-1531 (2022).
- Ashrafi, G., Schlehe, J. S., LaVoie, M. J., Schwarz, T. L. Mitophagy of damaged mitochondria occurs locally in distal neuronal axons and requires PINK1 and Parkin. Journal of Cell Biology. 206 (5), 655-670 (2014).
- Shipman, C. Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineëthanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 130 (1), 305-310 (1969).
- Harbauer, A. B., Schneider, A., Wohlleber, D. Analysis of mitochondria by single-organelle resolution. Annual Review of Analytical Chemistry. 15, 1-16 (2022).
- Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. The Journal of Neuroscience. 29 (15), 4697-4707 (2009).
- Altman, T., et al. Axonal TDP-43 condensates drive neuromuscular junction disruption through inhibition of local synthesis of nuclear encoded mitochondrial proteins. Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).
