Depolarizzazione selettiva assistita da microfluidica dei mitocondri assonali

Summary

Il presente protocollo descrive la semina e la colorazione dei mitocondri neuronali in camere microfluidiche. Il gradiente di pressione fluidica in queste camere consente il trattamento selettivo dei mitocondri negli assoni per analizzare le loro proprietà in risposta alle sfide farmacologiche senza influenzare il compartimento corporeo cellulare.

Abstract

I mitocondri sono i principali fornitori di ATP (adenosina trifosfato) nei neuroni. La disfunzione mitocondriale è un fenotipo comune in molte malattie neurodegenerative. Data l’architettura elaborata e l’estrema lunghezza di alcuni assoni, non sorprende che i mitocondri negli assoni possano sperimentare ambienti diversi rispetto alle loro controparti del corpo cellulare. È interessante notare che la disfunzione dei mitocondri assonali spesso precede gli effetti sul corpo cellulare. Per modellare la disfunzione mitocondriale assonale in vitro, i dispositivi microfluidici consentono il trattamento dei mitocondri assonali senza influenzare i mitocondri somali. Il gradiente di pressione fluidica in queste camere impedisce la diffusione delle molecole contro il gradiente, consentendo così l’analisi delle proprietà mitocondriali in risposta alle sfide farmacologiche locali all’interno degli assoni. L’attuale protocollo descrive la semina di neuroni ippocampali dissociati in dispositivi microfluidici, la colorazione con un colorante sensibile al potenziale di membrana, il trattamento con una tossina mitocondriale e la successiva analisi microscopica. Questo metodo versatile per studiare la biologia assonale può essere applicato a molte perturbazioni farmacologiche e letture di imaging ed è adatto a diversi sottotipi neuronali.

Introduction

I mitocondri sono i principali fornitori di ATP (adenosina trifosfato) nei neuroni. Poiché la salute neuronale è intimamente legata alla funzione mitocondriale, non sorprende che la regolazione disfunzionale di questi organelli sia stata associata all’insorgenza di varie malattie neurodegenerative, tra cui il morbo di Parkinson¹. Inoltre, l’intossicazione mitocondriale è stata utilizzata con successo per modellare i sintomi parkinsoniani negli animali². Sia nei modelli animali che nelle malattie umane, la scomparsa dei neuroni inizia alle parti distali^3,4, suggerendo che i mitocondri assonali potrebbero essere più suscettibili agli insulti. Tuttavia, la biologia dei mitocondri negli assoni non è ben compresa a causa delle difficoltà associate al trattamento mirato e all’analisi dei mitocondri assonali senza disturbi simultanei dei processi del corpo cellulare.

I recenti progressi nelle tecniche di coltura di neuroni dissociati in vitro consentono ora la separazione fluidica di assoni e corpi cellulari attraverso dispositivi microfluidici⁵. Come illustrato nella Figura 1A, questi dispositivi sono dotati di quattro pozzetti di accesso (a/h e c/i), con due canali che collegano ogni coppia (d e f). I grandi canali sono collegati tra loro da una serie di microcanali lunghi 450 μm (e). Le differenze intenzionali nei livelli di riempimento tra le due camere creano un gradiente di pressione del fluido (Figura 1B) che impedisce la diffusione di piccole molecole dal canale con un livello di fluido inferiore all’altro lato (Figura 1C, illustrata con colorante blu Trypan).

Recentemente abbiamo utilizzato dispositivi microfluidici per studiare i requisiti di traduzione locale nella mitofagia assonale, la rimozione selettiva dei mitocondri danneggiati⁶. Nel presente protocollo, vengono presentati diversi passaggi per indurre danni mitocondriali locali attraverso il trattamento selettivo degli assoni utilizzando l’inibitore del complesso mitocondriale III Antimicina A ^6,7.

Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti seguendo le linee guida e i regolamenti pertinenti del governo dell’Alta Baviera. I neuroni primari sono stati preparati da E16.5 C57BL/6 embrioni di topo wild-type di entrambi i sessi seguendo metodi standard come precedentemente descritto6. 1. Assemblaggio del dispositivo microfluidico Rivestire una piastra di coltura tissutale con fondo di vetro a sei pozzetti con una concentrazione fi…

Representative Results

I neuroni ippocampali primari sono stati coltivati in dispositivi microfluidici per 7-8 giorni prima che i mitocondri fossero colorati con il colorante sensibile alla membrana (TMRE) per 25 minuti in entrambi i canali. Come mostrato nella Figura 2A, questo ha prodotto una colorazione omogenea dei mitocondri su entrambi i lati dei microsolchi, ma era insufficiente per equilibrare la colorazione nel mezzo dei microsolchi. Dopo l’aggiunta di Antimicina A al lato assonale, i mitocondri somali ha…

Discussion

Il presente protocollo descrive un metodo per seminare e coltivare neuroni ippocampali dissociati in un dispositivo microfluidico per trattare separatamente i mitocondri assonali. L’utilità di questo approccio con il colorante sensibile alla membrana TMRE e l’inibitore III complesso Antimicina A (come precedentemente dimostrato⁷) è dimostrata qui, ma questo metodo può essere facilmente adattato ad altri coloranti mitocondriali o sensori geneticamente codificati di funzioni mitocondriali che con…

Materials

6-well Glass bottom plate	Cellvis	P06.1.5H-N	Silicone device
Antimycin A	Sigma	A8674
B27	Gibco	17504044
EVOS M5000 widefield microscope	Thermofischer Scientific	EVOS M5000	fully integrated digital widefield microscope
Hibernate E	BrainBits	HE500
Inverted spinning disk confocal	Nikon	TI2-E + CSU-W1	With incubator chamber
Laminin	Invitrogen	L2020
Microfluidic devices	XONA microfluidics	RD450
Neurobasal medium	Gibco	21103049
Poly-D-Lysine	Sigma	P2636
TMRE	Sigma	87917