Селективная деполяризация аксональных митохондрий с помощью микрофлюидики
Summary
Настоящий протокол описывает посев и окрашивание нейронных митохондрий в микрофлюидных камерах. Градиент псевдоожиженного давления в этих камерах позволяет селективно обрабатывать митохондрии в аксонах для анализа их свойств в ответ на фармакологические проблемы, не влияя на компартмент клеточного тела.
Abstract
Митохондрии являются основными поставщиками АТФ (аденозинтрифосфата) в нейронах. Митохондриальная дисфункция является распространенным фенотипом при многих нейродегенеративных заболеваниях. Учитывая сложную архитектуру некоторых аксонов и их чрезвычайную длину, неудивительно, что митохондрии в аксонах могут испытывать различные среды по сравнению с их аналогами клеточного тела. Интересно, что дисфункция аксональных митохондрий часто предшествует воздействию на организм клетки. Для моделирования аксональной митохондриальной дисфункции in vitro микрофлюидные устройства позволяют лечить аксональные митохондрии, не затрагивая сомальные митохондрии. Градиент псевдоожиженного давления в этих камерах предотвращает диффузию молекул против градиента, что позволяет анализировать свойства митохондрий в ответ на локальные фармакологические проблемы в аксонах. Текущий протокол описывает посев диссоциированных нейронов гиппокампа в микрофлюидные устройства, окрашивание мембранно-потенциально чувствительным красителем, лечение митохондриальным токсином и последующий микроскопический анализ. Этот универсальный метод изучения аксональной биологии может быть применен ко многим фармакологическим возмущениям и показаниям изображений и подходит для нескольких нейронных подтипов.
Introduction
Митохондрии являются основными поставщиками АТФ (аденозинтрифосфата) в нейронах. Поскольку здоровье нейронов тесно связано с митохондриальной функцией, неудивительно, что дисфункциональная регуляция этих органелл была связана с началом различных нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Паркинсона1. Кроме того, митохондриальная интоксикация успешно используется для моделирования симптомов паркинсонизма у животных2. Как на животных моделях, так и при болезни человека гибель нейронов начинается с дистальных частей 3,4, намекая на то, что аксональные митохондрии могут быть более восприимчивы к оскорблениям. Однако биология митохондрий в аксонах недостаточно изучена из-за трудностей, связанных с целенаправленной обработкой и анализом аксональных митохондрий без одновременного нарушения процессов клеточного организма.
Последние достижения в методах культивирования диссоциированных нейронов in vitro теперь позволяют проводить жидкостное разделение аксонов и клеточных тел с помощью микрофлюидных устройств5. Как показано на рисунке 1A, эти устройства имеют четыре колодца доступа (a/h и c/i) с двумя каналами, соединяющими каждую пару (d и f). Большие каналы соединены друг с другом серией микроканалов длиной 450 мкм (e). Преднамеренные различия в уровнях заполнения между двумя камерами создают градиент давления жидкости (рисунок 1B), который предотвращает диффузию малых молекул из канала с более низким уровнем жидкости на другую сторону (рисунок 1C, проиллюстрированный синим красителем Трипана).
Недавно мы использовали микрофлюидные устройства для изучения требований к локальному переводу в аксональной митофагии, селективного удаления поврежденных митохондрий6. В настоящем протоколе представлены различные этапы индуцирования локального повреждения митохондрий путем селективной обработки аксонов с использованием ингибитора митохондриального комплекса III Антимицина А 6,7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Настоящий протокол описывает способ посева и культивирования диссоциированных нейронов гиппокампа в микрофлюидном устройстве для отдельного лечения аксональных митохондрий. Полезность этого подхода с мембранно-чувствительным красителем TMRE и комплексным ингибитором III Антимицином…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Немецким исследовательским фондом (HA 7728/2-1 и EXC2145 Project ID 390857198) и Обществом Макса Планка.
Materials
| 6-well Glass bottom plate | Cellvis | P06.1.5H-N | Silicone device |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| EVOS M5000 widefield microscope | Thermofischer Scientific | EVOS M5000 | fully integrated digital widefield microscope |
| Hibernate E | BrainBits | HE500 | |
| Inverted spinning disk confocal | Nikon | TI2-E + CSU-W1 | With incubator chamber |
| Laminin | Invitrogen | L2020 | |
| Microfluidic devices | XONA microfluidics | RD450 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P2636 | |
| TMRE | Sigma | 87917 |
Referências
- Murali Mahadevan, H., Hashemiaghdam, A., Ashrafi, G., Harbauer, A. B. Mitochondria in neuronal health: from energy metabolism to Parkinson’s disease. Advanced Biology. 5 (9), 2100663 (2021).
- Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson’s disease: mechanisms and models. Neuron. 39 (6), 889-909 (2003).
- Moratalla, R., et al. Differential vulnerability of primate caudate-putamen and striosome-matrix dopamine systems to the neurotoxic effects of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6- tetrahydropyridine. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (9), 3859-3863 (1992).
- Cheng, H. -. C., Ulane, C. M., Burke, R. E. Clinical progression in Parkinson disease and the neurobiology of axons. Annals of Neurology. 67 (6), 715-725 (2010).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature Methods. 2 (8), 599-605 (2005).
- Harbauer, A. B., et al. Neuronal mitochondria transport Pink1 mRNA via synaptojanin 2 to support local mitophagy. Neuron. 110 (9), 1516-1531 (2022).
- Ashrafi, G., Schlehe, J. S., LaVoie, M. J., Schwarz, T. L. Mitophagy of damaged mitochondria occurs locally in distal neuronal axons and requires PINK1 and Parkin. Journal of Cell Biology. 206 (5), 655-670 (2014).
- Shipman, C. Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineëthanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 130 (1), 305-310 (1969).
- Harbauer, A. B., Schneider, A., Wohlleber, D. Analysis of mitochondria by single-organelle resolution. Annual Review of Analytical Chemistry. 15, 1-16 (2022).
- Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. The Journal of Neuroscience. 29 (15), 4697-4707 (2009).
- Altman, T., et al. Axonal TDP-43 condensates drive neuromuscular junction disruption through inhibition of local synthesis of nuclear encoded mitochondrial proteins. Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).
