Despolarização Seletiva Assistida por Microfluídica das Mitocôndrias Axonais

Resumo

O presente protocolo descreve a semeadura e coloração de mitocôndrias neuronais em câmaras microfluídicas. O gradiente de pressão fluídica nessas câmaras permite o tratamento seletivo de mitocôndrias em axônios para analisar suas propriedades em resposta a desafios farmacológicos sem afetar o compartimento do corpo celular.

Resumo

As mitocôndrias são os principais fornecedores de ATP (trifosfato de adenosina) nos neurônios. A disfunção mitocondrial é um fenótipo comum em muitas doenças neurodegenerativas. Dada a arquitetura elaborada e o comprimento extremo de alguns axônios, não é surpreendente que as mitocôndrias nos axônios possam experimentar ambientes diferentes em comparação com suas contrapartes do corpo celular. Curiosamente, a disfunção das mitocôndrias axonais muitas vezes precede os efeitos no corpo celular. Para modelar a disfunção mitocondrial axonal in vitro, os dispositivos microfluídicos permitem o tratamento das mitocôndrias axonais sem afetar as mitocôndrias somais. O gradiente de pressão fluídica nessas câmaras impede a difusão de moléculas contra o gradiente, permitindo assim a análise das propriedades mitocondriais em resposta a desafios farmacológicos locais dentro dos axônios. O protocolo atual descreve a semeadura de neurônios hipocampais dissociados em dispositivos microfluídicos, coloração com um corante sensível ao potencial de membrana, tratamento com uma toxina mitocondrial e a subsequente análise microscópica. Este método versátil para estudar a biologia axonal pode ser aplicado a muitas perturbações farmacológicas e leituras de imagem, e é adequado para vários subtipos neuronais.

Introdução

As mitocôndrias são os principais fornecedores de ATP (trifosfato de adenosina) nos neurônios. Como a saúde neuronal está intimamente ligada à função mitocondrial, não é de surpreender que a regulação disfuncional dessas organelas tenha sido associada ao aparecimento de várias doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Parkinson¹. Além disso, a intoxicação mitocondrial tem sido utilizada com sucesso para modelar sintomas parkinsonianos em animais². Tanto em modelos animais quanto em doenças humanas, o desaparecimento dos neurônios começa nas partes distais^3,4,

Protocolo

Todos os experimentos em animais foram realizados seguindo as diretrizes e regulamentos relevantes do Governo da Alta Baviera. Os neurônios primários foram preparados a partir de embriões de camundongos do tipo selvagem E16.5 C57BL/6 de ambos os sexos, seguindo métodos padrão, conforme descrito anteriormente⁶.

1. Montagem do dispositivo microfluídico

1. Revestir uma placa de cultura de tecido com fundo de vidro de seis poços com uma concentração final de 20 μg/mL de poli-D-lisina e 3,4 μg/mL de laminina em PBS (solução salina tamponada com fosfato) (ver Tabela de Materiais).

Resultados

Os neurônios primários do hipocampo foram cultivados em dispositivos microfluídicos por 7-8 dias antes que as mitocôndrias fossem coradas com o corante sensível à membrana (TMRE) por 25 minutos em ambos os canais. Como mostrado na Figura 2A, isso produziu coloração homogênea de mitocôndrias em ambos os lados dos microsulcos, mas foi insuficiente para equilibrar a coloração no meio dos microsulcos. Após a adição de Antimicina A ao lado axonal, as mitocôndrias sanais retiveram o sinal de TMRE .......

Discussão

O presente protocolo descreve um método para semear e cultivar neurônios hipocampais dissociados em um dispositivo microfluídico para tratar mitocôndrias axonais separadamente. A utilidade dessa abordagem com o corante sensível à membrana TMRE e o inibidor do complexo III Antimicina A (como demonstrado anteriormente⁷) é demonstrada aqui, mas esse método pode ser facilmente adaptado a outros corantes mitocondriais ou sensores geneticamente codificados de funções mitocondriais que permitem leituras .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placa inferior de vidro de 6 poços	Cellvis	P06.1.5H-N Dispositivo de	silicone
Antimicina A	Sigma	A8674
B27	Gibco	17504044
EVOS M5000 microscópio de campo amplo	Thermofischer Scientific	EVOS M5000	microscópio de campo amplo digital totalmente integrado
Hibernate E	BrainBits	HE500
Confocal de disco giratório invertido	Nikon	TI2-E + CSU-W1	Com câmara de incubadora
Laminina	Invitrogen	L2020
Dispositivos microfluídicos	XONA microfluídica	RD450
Meio neurobasal	Gibco	21103049
Poli-D-Lisina	Sigma	P2636
TMRE	Sigma	87917