Dépolarisation sélective des mitochondries axonales assistée par microfluidique

Summary

Le présent protocole décrit l’ensemencement et la coloration des mitochondries neuronales dans des chambres microfluidiques. Le gradient de pression fluidique dans ces chambres permet le traitement sélectif des mitochondries dans les axones pour analyser leurs propriétés en réponse à des défis pharmacologiques sans affecter le compartiment du corps cellulaire.

Abstract

Les mitochondries sont les principaux fournisseurs d’ATP (adénosine triphosphate) dans les neurones. Le dysfonctionnement mitochondrial est un phénotype courant dans de nombreuses maladies neurodégénératives. Compte tenu de l’architecture élaborée et de la longueur extrême de certains axones, il n’est pas surprenant que les mitochondries dans les axones puissent connaître des environnements différents de ceux de leurs homologues du corps cellulaire. Fait intéressant, le dysfonctionnement des mitochondries axonales précède souvent les effets sur le corps cellulaire. Pour modéliser le dysfonctionnement mitochondrial axonal in vitro, des dispositifs microfluidiques permettent de traiter les mitochondries axonales sans affecter les mitochondries somales. Le gradient de pression fluidique dans ces chambres empêche la diffusion des molécules contre le gradient, permettant ainsi l’analyse des propriétés mitochondriales en réponse aux défis pharmacologiques locaux au sein des axones. Le protocole actuel décrit l’ensemencement des neurones dissociés de l’hippocampe dans des dispositifs microfluidiques, la coloration avec un colorant sensible au potentiel membranaire, le traitement avec une toxine mitochondriale et l’analyse microscopique subséquente. Cette méthode polyvalente pour étudier la biologie axonale peut être appliquée à de nombreuses perturbations pharmacologiques et lectures d’imagerie, et convient à plusieurs sous-types neuronaux.

Introduction

Les mitochondries sont les principaux fournisseurs d’ATP (adénosine triphosphate) dans les neurones. Comme la santé neuronale est intimement liée à la fonction mitochondriale, il n’est pas surprenant que la régulation dysfonctionnelle de ces organites ait été associée à l’apparition de diverses maladies neurodégénératives, dont la maladie de Parkinson¹. De plus, l’intoxication mitochondriale a été utilisée avec succès pour modéliser les symptômes parkinsoniens chez les animaux². Dans les modèles animaux et les maladies humaines, la disparition des neurones commence aux parties distales^{3,4, ce} qui suggère que les mitochondries axonales pourraient être plus sensibles aux insultes. Cependant, la biologie des mitochondries dans les axones n’est pas bien comprise en raison des difficultés associées au traitement ciblé et à l’analyse des mitochondries axonales sans perturbation simultanée des processus du corps cellulaire.

Les progrès récents dans les techniques de culture de neurones dissociés in vitro permettent maintenant la séparation fluidique des axones et des corps cellulaires grâce à des dispositifs microfluidiques⁵. Comme le montre la figure 1A, ces dispositifs comportent quatre puits d’accès (a/h et c/i), avec deux canaux reliant chaque paire (d et f). Les grands canaux sont reliés entre eux par une série de microcanaux de 450 μm de long (e). Les différences intentionnelles dans les niveaux de remplissage entre les deux chambres créent un gradient de pression du fluide (Figure 1B) qui empêche la diffusion de petites molécules du canal avec un niveau de fluide inférieur de l’autre côté (Figure 1C, illustrée avec un colorant bleu trypan).

Nous avons récemment utilisé des dispositifs microfluidiques pour étudier les besoins de traduction locale en mitophagie axonale, l’élimination sélective des mitochondries endommagées⁶. Dans le présent protocole, différentes étapes sont présentées pour induire des lésions mitochondriales locales par traitement sélectif des axones à l’aide de l’inhibiteur du complexe mitochondrial III Antimycine A ^6,7.

Protocol

Toutes les expériences sur les animaux ont été réalisées conformément aux directives et réglementations pertinentes du gouvernement de Haute-Bavière. Les neurones primaires ont été préparés à partir d’embryons de souris sauvages E16.5 C57BL/6 des deux sexes selon les méthodes standard décrites précédemment6. 1. Assemblage du dispositif microfluidique Enduire une plaque de culture tissulaire à fond de verre à six puits avec…

Representative Results

Les neurones primaires de l’hippocampe ont été cultivés dans des dispositifs microfluidiques pendant 7 à 8 jours avant que les mitochondries ne soient colorées avec le colorant sensible à la membrane (TMRE) pendant 25 minutes dans les deux canaux. Comme le montre la figure 2A, cela a donné une coloration homogène des mitochondries des deux côtés des microrainures, mais elle était insuffisante pour équilibrer la coloration au milieu des microrainures. Lors de l’ajout de l’an…

Discussion

Le présent protocole décrit une méthode pour ensemencer et cultiver des neurones hippocampiques dissociés dans un dispositif microfluidique pour traiter séparément les mitochondries axonales. L’utilité de cette approche avec le colorant TMRE sensible à la membrane et l’inhibiteur complexe III Antimycin A (comme démontré précédemment⁷) est démontrée ici, mais cette méthode peut être facilement adaptée à d’autres colorants mitochondriaux ou capteurs génétiquement codés des…

Materials

6-well Glass bottom plate	Cellvis	P06.1.5H-N	Silicone device
Antimycin A	Sigma	A8674
B27	Gibco	17504044
EVOS M5000 widefield microscope	Thermofischer Scientific	EVOS M5000	fully integrated digital widefield microscope
Hibernate E	BrainBits	HE500
Inverted spinning disk confocal	Nikon	TI2-E + CSU-W1	With incubator chamber
Laminin	Invitrogen	L2020
Microfluidic devices	XONA microfluidics	RD450
Neurobasal medium	Gibco	21103049
Poly-D-Lysine	Sigma	P2636
TMRE	Sigma	87917