Analyse par cytométrie en flux de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques de moelle osseuse murine et de cellules de niche stromale
Summary
Ici, nous décrivons un protocole simple pour l’isolement et la coloration des cellules de moelle osseuse murine en cellules souches et progénitrices hématopoïétiques phénotypiques ainsi que les cellules souches endothéliales et mésenchymateuses de niche. Une méthode d’enrichissement des cellules situées dans les zones endostéales et centrales de la moelle osseuse est également incluse.
Abstract
La moelle osseuse (BM) est le tissu mou présent dans les os où se produit principalement l’hématopoïèse, le processus par lequel de nouvelles cellules sanguines sont générées. En tant que tel, il contient des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC), ainsi que des cellules stromales de soutien qui contribuent au maintien et à la régulation des HSPC. Les troubles hématologiques et autres troubles de la BM perturbent l’hématopoïèse en affectant directement les cellules hématopoïétiques et / ou par l’altération de la niche BM. Ici, nous décrivons une méthode pour étudier l’hématopoïèse dans la santé et la malignité par l’analyse phénotypique des HSPC BM murins et des populations de niche stromale par cytométrie de flux. Notre méthode détaille les étapes requises pour enrichir les cellules BM en fractions BM endostéales et centrales, ainsi que les stratégies de contrôle appropriées pour identifier les deux principaux types de cellules de niche impliquées dans la régulation HSPC, les cellules endothéliales et les cellules souches mésenchymateuses. L’analyse phénotypique proposée ici peut être combinée avec des mutants murins, des modèles de maladie et des tests fonctionnels pour caractériser le compartiment HSPC et sa niche.
Introduction
La cytométrie de flux est une méthode inestimable pour caractériser et isoler prospectivement les cellules immunitaires et hématopoïétiques. Il est également de plus en plus utilisé pour analyser les populations stromales et épithéliales de différents tissus. La cellule souche hématopoïétique (CSH) possède des propriétés uniques d’auto-renouvellement et de multipotence. Chez les mammifères adultes, les CSH résident principalement dans la moelle osseuse (BM), où elles reçoivent des signaux de quiescence et de survie du microenvironnement environnant ou de la niche1. Les CSH sont formellement définies selon les essais fonctionnels2. Néanmoins, plusieurs articles de référence ont montré l’utilité de la cytométrie en flux pour identifier les CSH. Grâce à l’utilisation de marqueurs de surface cellulaire limités, il est possible de discriminer les populations hématopoïétiques fortement enrichies en CSH3. La cytométrie de flux est donc une méthode centrale dans le domaine des cellules souches. Il a été largement utilisé pour évaluer l’impact des types de cellules de niche putatives et des facteurs de niche sur les CSH. En combinant la cytométrie en flux avec l’imagerie et les tests fonctionnels, il a été démontré que les CSH sont soutenues de manière critique par les cellules souches mésenchymateuses périvasculaires (CSM) et les cellules endothéliales (CE). Les CSM BM sont un groupe hétérogène et ont des contributions différentes en cytokines4, mais il est bien établi que les CSM récepteurs de la leptine (LepR) + sont des cellules de niche clés1. Les EC BM sont également très hétérogènes et peuvent faire partie de sinusoïdes, d’artérioles et de vaisseaux de type H / transitionnels5. Différentes études ont montré la contribution nuancée de ces différentes CE. Par exemple, les EC sinusoïdales endostéales sont spatialement plus proches des CSH6 quiescentes, tandis que les CSH non migratrices avec des niveaux plus faibles d’espèces réactives de l’oxygène sont situées près des CE artériolaires7. L’emplacement endosté par rapport à l’emplacement central des niches est également très important. Les vaisseaux endostéaux de type H sont associés aux cellules stromales périvasculaires qui sont perdues avec le vieillissement, entraînant la perte de CSH8. Dans la leucémie myéloïde aiguë, les EC centrales sont élargies, tandis que les vaisseaux endostés et les CSH endostéales sont perdus9.
La plupart des études dans le domaine se sont concentrées sur l’hématopoïèse elle-même et sur la régulation extrinsèque des CSH par la cellule. Il est toutefois de plus en plus reconnu qu’il est nécessaire de mieux caractériser les niches qui régulent d’autres progéniteurs, à savoir les progéniteurs multipotents (MPP), d’autant plus qu’ils sont les principaux moteurs de l’hématopoïèse à l’état d’équilibre10. Contrairement à une structure hiérarchique fixe, des études récentes ont montré que l’hématopoïèse est un continuum dans lequel les CSH se différencient en MPP biaisés à un stade précoce11. Les MPP ont été nommés d’après différents schémas de classification12, mais un récent document de consensus de la Société internationale d’hématologie expérimentale (ISEH) a proposé que les MPP soient discriminés en tant que MPP précoces et en fonction de leur biais lymphoïde (MPP-Ly), mégacaryocytaire et érythroïde (MPP-Mk/E) et myéloïde (MPP-G/M)13. L’utilisation de la cytométrie de flux sera essentielle pour étudier plus avant l’importance des niches BM dans la régulation de ces populations. Les méthodes actuelles de cytométrie en flux utilisent des stratégies de contrôle variables pour différencier les HSPC et identifier les cellules stromales, à savoir les CE, à l’aide de marqueurs incohérents. L’objectif de la méthode actuelle est de présenter un flux de travail simple et reproductible de coloration BM pour identifier les sous-populations HSPC, les groupes hétérogènes de CE et les CSM LepR+. Nous pensons que cette technique, bien que comparable aux méthodes précédemment rapportées (voir, par exemple, la référence 14), fournit un protocole mis à jour et facile à mettre en œuvre pour l’analyse phénotypique des cellules hématopoïétiques dans les deux zones fonctionnelles de la moelle osseuse, endostéale et centrale BM 8,15, ainsi que des cellules de niche stromale BM.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bien que le protocole décrit soit simple et facile à exécuter, une attention particulière doit être portée à des étapes spécifiques. Par exemple, lors de l’obtention d’une BM rincée (étape 5.2), le volume ou le nombre de fois indiqué pour faire passer PBS 2% FBS à l’intérieur de la partie centrale de l’os ne doit pas être dépassé, car cela pourrait entraîner une contamination importante de l’échantillon rincé par des populations de cellules endosteales.
Des modifi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LM a été soutenu par une subvention du Lady Tata Memorial Trust. JR a été soutenu par une bourse de doctorat de la Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT; Bourse FCT UI/BD/150833/2021). ML a été soutenu par une bourse de doctorat de FCT (FCT fellowship 2021.04773.BD). DD a été soutenu par des subventions de l’American Society of Hematology, de la Pablove Foundation, de la FCT (EXPL/MED-ONC/0522/2021) et de la Société portugaise d’hématologie. Nous remercions le soutien de la Dre Catarina Meireles et d’Emilia Cardoso de l’installation TRACY à i3s.
Materials
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD54/ICAM-1 antibody | BioLegend | 116114 | |
| APC Streptavidin | BioLegend | 405207 | |
| APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) antibody | BioLegend | 105826 | |
| APC/Cyanine7 anti-mouse CD45 antibody | BioLegend | 103116 | |
| APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody | BioLegend | 116223 | |
| Biotin anti-mouse CD3ε antibody | BioLegend | 100304 | |
| Biotin anti-mouse CD4 antibody | BioLegend | 100404 | |
| Biotin anti-mouse CD8a antibody | BioLegend | 100704 | |
| Biotin anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antibody | BioLegend | 108404 | |
| Biotin anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody | BioLegend | 116204 | |
| Biotin anti-mouse/human CD11b antibody | BioLegend | 101204 | |
| Biotin anti-mouse/human CD45R/B220 antibody | BioLegend | 103204 | |
| Brilliant Violet 510 anti-mouse CD150 (SLAM) antibody | BioLegend | 115929 | |
| Calibrite 2 Color Beads | BD Biosciences | 349502 | |
| Collagenase IV | Merck Life Science | C1889 | |
| Dispase II | Merck Life Science | D4693 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin | ThermoFisher Scientific | 10500064 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14175095 | |
| Mouse Leptin R Biotinylated Antibody | R&D systems | BAF497 | |
| NucBlue Fixed Cell Reagent (DAPI) | ThermoFisher Scientific | R37606 | DAPI reagent |
| PE anti-mouse endomucin antibody | ThermoFisher Scientific | 12-5851-82 | |
| PE anti-mouse Flk2 (CD135) | ThermoFisher Scientific | 12-1351-82 | |
| PE/Cyanine7 anti-mouse CD31 antibody | BioLegend | 102524 | |
| PE/Cyanine7 anti-mouse CD48 antibody | BioLegend | 103424 | |
| PerCP anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) antibody | BioLegend | 108122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) tablets | Merck Life Science | P4417 | |
| Purified anti-mouse CD16/32 antibody | BioLegend | 101302 | |
| RBC lysis buffer 10x | BioLegend | 420302 | |
| Zombie Violet Fixable Viability Dye | BioLegend | 423114 | fluorescent dye |
Referências
- Comazzetto, S., Shen, B., Morrison, S. J. Niches that regulate stem cells and hematopoiesis in adult bone marrow. Developmental Cell. 56 (13), 1848-1860 (2021).
- Purton, L. E., Scadden, D. T. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell Stem Cell. 1 (3), 263-270 (2007).
- Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Asada, N., et al. Differential cytokine contributions of perivascular haematopoietic stem cell niches. Nature Cell Biology. 19 (3), 214-223 (2017).
- Mosteo, L., et al. The dynamic interface between the bone marrow vascular niche and hematopoietic stem cells in myeloid malignancy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 635189 (2021).
- Christodoulou, C., et al. Live-animal imaging of native haematopoietic stem and progenitor cells. Nature. 578 (7794), 278-283 (2020).
- Itkin, T., et al. Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis. Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).
- Kusumbe, A. P., et al. Age-dependent modulation of vascular niches for haematopoietic stem cells. Nature. 532 (7599), 380-384 (2016).
- Duarte, D., et al. Inhibition of endosteal vascular niche remodeling rescues hematopoietic stem cell loss in AML. Cell Stem Cell. 22 (1), 64-77 (2018).
- Busch, K., et al. Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo. Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).
- Laurenti, E., Gottgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
- Pietras, E. M., et al. Functionally distinct subsets of lineage-biased multipotent progenitors control blood production in normal and regenerative conditions. Cell Stem Cell. 17 (1), 35-46 (2015).
- Challen, G. A., Pietras, E. M., Wallscheid, N. C., Signer, R. A. J. Simplified murine multipotent progenitor isolation scheme: Establishing a consensus approach for multipotent progenitor identification. Experimental Hematology. 104, 55-63 (2021).
- Mayle, A., Luo, M., Jeong, M., Goodell, M. A. Flow cytometry analysis of murine hematopoietic stem cells. Cytometry A. 83 (1), 27-37 (2013).
- Kusumbe, A. P., Ramasamy, S. K., Adams, R. H. Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone. Nature. 507 (7492), 323-328 (2014).
- Hawkins, E. D., et al. Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data. Nature Protocols. 2 (9), 2057-2067 (2007).
- Akinduro, O., et al. Proliferation dynamics of acute myeloid leukaemia and haematopoietic progenitors competing for bone marrow space. Nature Communications. 9 (1), 519 (2018).
- Beerman, I., et al. Functionally distinct hematopoietic stem cells modulate hematopoietic lineage potential during aging by a mechanism of clonal expansion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (12), 5465-5470 (2010).
- Gomariz, A., et al. Quantitative spatial analysis of haematopoiesis-regulating stromal cells in the bone marrow microenvironment by 3D microscopy. Nature Communications. 9 (1), 2532 (2018).
- Xu, C., et al. Stem cell factor is selectively secreted by arterial endothelial cells in bone marrow. Nature Communications. 9 (1), 2449 (2018).
- Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936 (2016).
- Wang, Y., et al. Ephrin-B2 controls VEGF-induced angiogenesis and lymphangiogenesis. Nature. 465 (7297), 483-486 (2010).
- DeFalco, J., et al. Virus-assisted mapping of neural inputs to a feeding center in the hypothalamus. Science. 291 (5513), 2608-2613 (2001).
- Boyer, S. W., Schroeder, A. V., Smith-Berdan, S., Forsberg, E. C. All hematopoietic cells develop from hematopoietic stem cells through Flk2/Flt3-positive progenitor cells. Cell Stem Cell. 9 (1), 64-73 (2011).
- Siegemund, S., Shepherd, J., Xiao, C., Sauer, K. hCD2-iCre and Vav-iCre mediated gene recombination patterns in murine hematopoietic cells. PLoS One. 10 (4), 0124661 (2015).
