ניתוח ציטומטריית זרימה של תאי גזע ותאי אב המטופויטיים של מח עצם מורין ותאי נישה סטרומליים
Summary
כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט לבידוד והכתמה של תאי מח עצם מורין לפנוטיפ תאי גזע המופויטיים ותאי אב יחד עם תאי גזע אנדותל ומזנכימליים תומכים. כמו כן נכללת שיטה להעשרת תאים הממוקמים באזורי אנדוסטל ומח עצם מרכזי.
Abstract
מח העצם (BM) הוא הרקמה הרכה המצויה בתוך העצמות שבהן מתרחשת בעיקר המטופויזה, התהליך שבו נוצרים תאי דם חדשים. ככזה, הוא מכיל תאי גזע ותאי אב המטופויטיים (HSPCs), כמו גם תאי סטרומה תומכים התורמים לתחזוקה ולוויסות של HSPCs. הפרעות BM המטולוגיות ואחרות משבשות את ההמטופוייזה על ידי השפעה ישירה על תאים המטופויטיים ו / או באמצעות שינוי של נישת BM. כאן, אנו מתארים שיטה לחקר hematopoiesis בבריאות וממאירות באמצעות ניתוח פנוטיפי של מורין BM HSPCs ואוכלוסיות נישה סטרומה על ידי ציטומטריית זרימה. השיטה שלנו מפרטת את השלבים הנדרשים להעשרת תאי BM בשברים אנדוסטליים ובשברי BM מרכזיים, כמו גם את אסטרטגיות הגאטינג המתאימות לזיהוי שני סוגי תאי הנישה העיקריים המעורבים בוויסות HSPC, תאי אנדותל ותאי גזע מזנכימליים. הניתוח הפנוטיפי המוצע כאן עשוי להיות משולב עם מוטציות עכבר, מודלים של מחלות ומבדקים פונקציונליים כדי לאפיין את תא HSPC ואת הנישה שלו.
Introduction
ציטומטריית זרימה היא שיטה רבת ערך לאפיון ובידוד פרוספקטיבי של תאים חיסוניים והמטופויאטיים. הוא גם משמש יותר ויותר לניתוח אוכלוסיות סטרומה ואפיתל של רקמות שונות. לתא הגזע ההמטופויאטי (HSC) תכונות ייחודיות של התחדשות עצמית ורב-עוצמה. ביונקים בוגרים, HSCs מתגוררים בעיקר במח העצם (BM), שם הם מקבלים אותות שקט והישרדות מהמיקרו-סביבה שמסביב או מנישה1. HSCs מוגדרים באופן רשמי על פי בדיקות פונקציונליות2. אף על פי כן, מספר מאמרים פורצי דרך הראו את התועלת של ציטומטריית זרימה לזיהוי HSCs. באמצעות שימוש בסמנים מוגבלים בפני השטח של התא, ניתן להבחין בין אוכלוסיות המטופויטיות המועשרות מאוד ב-HSCs3. ציטומטריית זרימה היא, אם כן, שיטה מרכזית בשדה תאי הגזע. נעשה בו שימוש נרחב כדי להעריך את ההשפעה של סוגי תאי נישה משוערים וגורמי נישה על HSC. על ידי שילוב של ציטומטריית זרימה עם הדמיה ובדיקות פונקציונליות, הוכח כי HSCs נתמכים באופן קריטי על ידי תאי גזע מזנכימליים פריווסקולריים (MSCs) ותאי אנדותל (ECs). BM MSCs הם קבוצה הטרוגנית ויש להם תרומות ציטוקינים שונות4, אבל זה מבוסס היטב כי קולטן לפטין (LepR)+ MSCs הם תאי נישה מרכזיים1. BM ECs הם גם הטרוגניים מאוד ויכולים להיות חלק מסינוסואידים, עורקים וכלי דם מסוג H / מעבר5. מחקרים שונים הראו את התרומה הניואנסית של ECs שונים אלה. לדוגמה, ECs סינוסואידים אנדוסטליים קרובים יותר מרחבית ל- HSCs6 שקטים, בעוד HSCs לא נודדים עם רמות נמוכות יותר של מיני חמצן תגובתי ממוקמים ליד ECsעורקיים 7. גם המיקום האנדוסטאלי לעומת המרכזי של הנישות חשוב מאוד. כלי דם מסוג H אנדוסטלים קשורים לתאי סטרומה פריווסקולריים שאבדו עם ההזדקנות, מה שמוביל לאובדן HSCs8. בלוקמיה מיאלואידית חריפה, ECs מרכזיים מורחבים, בעוד כלי אנדוסטל ו- HSCs אנדוסטליים הולכים לאיבוד9.
רוב המחקרים בתחום התמקדו בהמטופויזה עצמה ובוויסות החיצוני של התא של HSCs. עם זאת, יותר ויותר הוכר כי יש צורך לאפיין טוב יותר את הנישות המווסתות אבות אחרים, כלומר אבות רב-פוטנטיים (MPPs), במיוחד בהתחשב בכך שהם הנהגים העיקריים של hematopoiesis במצב יציב10. בניגוד למבנה היררכי קבוע, מחקרים אחרונים הראו כי המטופויזיס הוא רצף שבו HSCs מתמיינים ל-MPPs מוטים בשלב מוקדם11. MPPs נקראו על שם תוכניות סיווג שונות12, אך נייר קונצנזוס שנערך לאחרונה על ידי האגודה הבינלאומית להמטולוגיה ניסויית (ISEH) הציע MPPs להיות מופלים כמו MPPs מוקדם ועל פי הלימפה שלהם (MPP-Ly), megakaryocytic ו erythroid (MPP-Mk/E), ומיאלואיד (MPP-G/M)הטיה 13. השימוש בציטומטריית זרימה יהיה קריטי בהמשך המחקר על חשיבותן של נישות BM בוויסות אוכלוסיות אלה. שיטות ציטומטריית זרימה נוכחית משתמשות באסטרטגיות gating משתנות כדי להתמיין HSPCs ולזהות תאי סטרומה, כלומר ECs, באמצעות סמנים לא עקביים. מטרת השיטה הנוכחית היא להציג תהליך עבודה פשוט וניתן לשחזור של צביעת BM כדי לזהות תת-אוכלוסיות HSPC, קבוצות הטרוגניות של ECs ו- LepR+ MSCs. אנו מאמינים כי טכניקה זו, למרות שניתן להשוות אותה לשיטות שדווחו בעבר (ראה, למשל, הפניה 14), מספקת פרוטוקול מעודכן וקל ליישום לניתוח פנוטיפי של תאים המטופויטיים בשני אזורי מח המוח הפונקציונליים, אנדוסטל ו- BM 8,15 מרכזי, כמו גם תאי נישה סטרומה BM.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעוד שהפרוטוקול המתואר הוא פשוט וקל לביצוע, יש להקדיש תשומת לב מיוחדת לשלבים ספציפיים. לדוגמה, בעת קבלת BM סמוק (שלב 5.2), אין לחרוג מהנפח או מספר הפעמים המצוינות כדי להעביר PBS 2% FBS דרך החלק הפנימי של החלק המרכזי של העצם, מכיוון שהדבר עלול לגרום לזיהום משמעותי של הדגימה הסמוקה על ידי אוכלוסיות ת?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LM נתמך על ידי מענק מקרן הזיכרון ליידי טאטא. JR נתמך על ידי מלגת דוקטורט מ- Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT; ממשק משתמש של מלגת FCT/BD/150833/2021). ML נתמכה על ידי מלגת דוקטורט של FCT (מלגת FCT 2021.04773.BD). DD נתמך על ידי מענקים מהאגודה האמריקאית להמטולוגיה, קרן Pablove, FCT (EXPL/MED-ONC/0522/2021) והאגודה הפורטוגזית להמטולוגיה. אנו מודים לתמיכה של ד”ר קטרינה מיירלס ואמיליה קרדוסו ממתקן TRACY ב-i3s.
Materials
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD54/ICAM-1 antibody | BioLegend | 116114 | |
| APC Streptavidin | BioLegend | 405207 | |
| APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) antibody | BioLegend | 105826 | |
| APC/Cyanine7 anti-mouse CD45 antibody | BioLegend | 103116 | |
| APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody | BioLegend | 116223 | |
| Biotin anti-mouse CD3ε antibody | BioLegend | 100304 | |
| Biotin anti-mouse CD4 antibody | BioLegend | 100404 | |
| Biotin anti-mouse CD8a antibody | BioLegend | 100704 | |
| Biotin anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antibody | BioLegend | 108404 | |
| Biotin anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody | BioLegend | 116204 | |
| Biotin anti-mouse/human CD11b antibody | BioLegend | 101204 | |
| Biotin anti-mouse/human CD45R/B220 antibody | BioLegend | 103204 | |
| Brilliant Violet 510 anti-mouse CD150 (SLAM) antibody | BioLegend | 115929 | |
| Calibrite 2 Color Beads | BD Biosciences | 349502 | |
| Collagenase IV | Merck Life Science | C1889 | |
| Dispase II | Merck Life Science | D4693 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin | ThermoFisher Scientific | 10500064 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14175095 | |
| Mouse Leptin R Biotinylated Antibody | R&D systems | BAF497 | |
| NucBlue Fixed Cell Reagent (DAPI) | ThermoFisher Scientific | R37606 | DAPI reagent |
| PE anti-mouse endomucin antibody | ThermoFisher Scientific | 12-5851-82 | |
| PE anti-mouse Flk2 (CD135) | ThermoFisher Scientific | 12-1351-82 | |
| PE/Cyanine7 anti-mouse CD31 antibody | BioLegend | 102524 | |
| PE/Cyanine7 anti-mouse CD48 antibody | BioLegend | 103424 | |
| PerCP anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) antibody | BioLegend | 108122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) tablets | Merck Life Science | P4417 | |
| Purified anti-mouse CD16/32 antibody | BioLegend | 101302 | |
| RBC lysis buffer 10x | BioLegend | 420302 | |
| Zombie Violet Fixable Viability Dye | BioLegend | 423114 | fluorescent dye |
Referências
- Comazzetto, S., Shen, B., Morrison, S. J. Niches that regulate stem cells and hematopoiesis in adult bone marrow. Developmental Cell. 56 (13), 1848-1860 (2021).
- Purton, L. E., Scadden, D. T. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell Stem Cell. 1 (3), 263-270 (2007).
- Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Asada, N., et al. Differential cytokine contributions of perivascular haematopoietic stem cell niches. Nature Cell Biology. 19 (3), 214-223 (2017).
- Mosteo, L., et al. The dynamic interface between the bone marrow vascular niche and hematopoietic stem cells in myeloid malignancy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 635189 (2021).
- Christodoulou, C., et al. Live-animal imaging of native haematopoietic stem and progenitor cells. Nature. 578 (7794), 278-283 (2020).
- Itkin, T., et al. Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis. Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).
- Kusumbe, A. P., et al. Age-dependent modulation of vascular niches for haematopoietic stem cells. Nature. 532 (7599), 380-384 (2016).
- Duarte, D., et al. Inhibition of endosteal vascular niche remodeling rescues hematopoietic stem cell loss in AML. Cell Stem Cell. 22 (1), 64-77 (2018).
- Busch, K., et al. Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo. Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).
- Laurenti, E., Gottgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
- Pietras, E. M., et al. Functionally distinct subsets of lineage-biased multipotent progenitors control blood production in normal and regenerative conditions. Cell Stem Cell. 17 (1), 35-46 (2015).
- Challen, G. A., Pietras, E. M., Wallscheid, N. C., Signer, R. A. J. Simplified murine multipotent progenitor isolation scheme: Establishing a consensus approach for multipotent progenitor identification. Experimental Hematology. 104, 55-63 (2021).
- Mayle, A., Luo, M., Jeong, M., Goodell, M. A. Flow cytometry analysis of murine hematopoietic stem cells. Cytometry A. 83 (1), 27-37 (2013).
- Kusumbe, A. P., Ramasamy, S. K., Adams, R. H. Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone. Nature. 507 (7492), 323-328 (2014).
- Hawkins, E. D., et al. Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data. Nature Protocols. 2 (9), 2057-2067 (2007).
- Akinduro, O., et al. Proliferation dynamics of acute myeloid leukaemia and haematopoietic progenitors competing for bone marrow space. Nature Communications. 9 (1), 519 (2018).
- Beerman, I., et al. Functionally distinct hematopoietic stem cells modulate hematopoietic lineage potential during aging by a mechanism of clonal expansion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (12), 5465-5470 (2010).
- Gomariz, A., et al. Quantitative spatial analysis of haematopoiesis-regulating stromal cells in the bone marrow microenvironment by 3D microscopy. Nature Communications. 9 (1), 2532 (2018).
- Xu, C., et al. Stem cell factor is selectively secreted by arterial endothelial cells in bone marrow. Nature Communications. 9 (1), 2449 (2018).
- Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936 (2016).
- Wang, Y., et al. Ephrin-B2 controls VEGF-induced angiogenesis and lymphangiogenesis. Nature. 465 (7297), 483-486 (2010).
- DeFalco, J., et al. Virus-assisted mapping of neural inputs to a feeding center in the hypothalamus. Science. 291 (5513), 2608-2613 (2001).
- Boyer, S. W., Schroeder, A. V., Smith-Berdan, S., Forsberg, E. C. All hematopoietic cells develop from hematopoietic stem cells through Flk2/Flt3-positive progenitor cells. Cell Stem Cell. 9 (1), 64-73 (2011).
- Siegemund, S., Shepherd, J., Xiao, C., Sauer, K. hCD2-iCre and Vav-iCre mediated gene recombination patterns in murine hematopoietic cells. PLoS One. 10 (4), 0124661 (2015).
