Análisis por citometría de flujo de células madre y progenitoras hematopoyéticas de médula ósea murina y células de nicho estromal
Summary
Aquí, describimos un protocolo simple para el aislamiento y tinción de células murinas de médula ósea para fenotipo de células madre hemopoyéticas y progenitoras junto con las células madre endoteliales y mesenquimales de nicho de soporte. También se incluye un método para enriquecer las células ubicadas en las áreas endosteal y central de la médula ósea.
Abstract
La médula ósea (BM) es el tejido blando que se encuentra dentro de los huesos donde se produce principalmente la hematopoyesis, el proceso por el cual se generan nuevas células sanguíneas. Como tal, contiene células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC), así como células estromales de soporte que contribuyen al mantenimiento y regulación de las HSPC. Los trastornos hematológicos y otros trastornos del BM interrumpen la hematopoyesis al afectar a las células hematopoyéticas directamente y/o a través de la alteración del nicho del BM. Aquí, describimos un método para estudiar la hematopoyesis en salud y malignidad a través del análisis fenotípico de HSPC de BM murino y poblaciones de nicho estromal por citometría de flujo. Nuestro método detalla los pasos necesarios para enriquecer las células BM en fracciones endosteal y central BM, así como las estrategias de compuerta apropiadas para identificar los dos tipos clave de células de nicho involucradas en la regulación de HSPC, células endoteliales y células madre mesenquimales. El análisis fenotípico propuesto aquí puede combinarse con mutantes de ratón, modelos de enfermedades y ensayos funcionales para caracterizar el compartimiento HSPC y su nicho.
Introduction
La citometría de flujo es un método invaluable para caracterizar y aislar prospectivamente células inmunes y hematopoyéticas. También se utiliza cada vez más para analizar poblaciones estromales y epiteliales de diferentes tejidos. La célula madre hematopoyética (HSC) tiene propiedades únicas de autorrenovación y multipotencia. En los mamíferos adultos, las HSC residen principalmente en la médula ósea (BM), donde reciben señales de quiescencia y supervivencia del microambiente circundante o nicho1. Las HSC se definen formalmente de acuerdo con los ensayos funcionales2. Sin embargo, varios artículos históricos han demostrado la utilidad de la citometría de flujo para identificar HSC. Mediante el uso de marcadores de superficie celular limitada, es posible discriminar poblaciones hematopoyéticas altamente enriquecidas en HSCs3. La citometría de flujo es, por lo tanto, un método central en el campo de las células madre. Se ha utilizado ampliamente para evaluar el impacto de los tipos de células de nicho putativo y los factores de nicho en las HSC. Al combinar la citometría de flujo con imágenes y ensayos funcionales, se ha demostrado que las HSC están críticamente respaldadas por células madre mesenquimales perivasculares (MSC) y células endoteliales (CE). Las MSC BM son un grupo heterogéneo y tienen diferentes contribuciones de citoquinas4, pero está bien establecido que el receptor de leptina (LepR) + MSC son células de nicho clave1. Las CE BM también son muy heterogéneas y pueden formar parte de sinusoides, arteriolas y vasos tipo H/de transición5. Diferentes estudios han demostrado la contribución matizada de estos diferentes CE. Por ejemplo, las CE sinusoidales endosteal están espacialmente más cerca de las HSC quiescentes6, mientras que las HSC no migratorias con niveles más bajos de especies reactivas de oxígeno se encuentran cerca de las CE arteriolares7. El endosteal versus la ubicación central de los nichos también es muy importante. Los vasos endosteal tipo H están asociados con células del estroma perivascular que se pierden con el envejecimiento, lo que lleva a la pérdida de HSCs8. En la leucemia mieloide aguda, las CE centrales se expanden, mientras que los vasos endosteal y las HSC endosteal se pierden9.
La mayoría de los estudios en el campo se han centrado en la hematopoyesis en sí y en la regulación extrínseca de las HSC de la célula. Sin embargo, se ha reconocido cada vez más la necesidad de caracterizar mejor los nichos que regulan otros progenitores, a saber, los progenitores multipotentes (MPP), particularmente considerando que son los principales impulsores de la hematopoyesis en estado estacionario10. En contraste con una estructura jerárquica fija, estudios recientes han demostrado que la hematopoyesis es un continuo en el que las HSC se diferencian en MPP sesgadas en una etapa temprana11. Los MPP han sido nombrados después de diferentes esquemas de clasificación12, pero un reciente documento de consenso de la Sociedad Internacional de Hematología Experimental (ISEH) propuso que los MPP sean discriminados como MPP tempranos y de acuerdo con su sesgo linfoide (MPP-Ly), megacariocítico y eritroide (MPP-Mk / E) y mieloide (MPP-G / M)13. El uso de la citometría de flujo será fundamental para estudiar más a fondo la importancia de los nichos de BM en la regulación de estas poblaciones. Los métodos actuales de citometría de flujo utilizan estrategias de activación variable para diferenciar las HSPC e identificar las células del estroma, es decir, las CE, utilizando marcadores inconsistentes. El objetivo del método actual es presentar un flujo de trabajo simple y reproducible de tinción de BM para identificar subpoblaciones de HSPC, grupos heterogéneos de CE y MSC LepR +. Creemos que esta técnica, aunque comparable con los métodos previamente reportados (ver, por ejemplo, referencia 14), proporciona un protocolo actualizado y fácil de implementar para el análisis fenotípico de células hematopoyéticas en las dos áreas funcionales de la médula, endosteal y central BM 8,15, así como células de nicho estromal BM.
Protocol
Representative Results
Discussion
Si bien el protocolo descrito es simple y fácil de realizar, se debe prestar especial atención a los pasos específicos. Por ejemplo, al obtener BM enjuagado (paso 5.2), no se debe exceder el volumen o el número de veces indicado para pasar PBS 2% FBS a través del interior de la parte central del hueso, ya que esto podría resultar en una contaminación significativa de la muestra enjuagada por poblaciones de células endosteal.
Se pueden hacer alteraciones al protocolo para facilitar su e…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LM fue apoyado por una subvención del Lady Tata Memorial Trust. JR fue apoyado por una beca de doctorado de la Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT; Beca FCT UI/BD/150833/2021). ML fue apoyado por una beca de doctorado de FCT (FCT fellowship 2021.04773.BD). DD fue apoyado por subvenciones de la Sociedad Americana de Hematología, la Fundación Pablove, FCT (EXPL / MED-ONC / 0522 / 2021) y la Sociedad Portuguesa de Hematología. Catarina Meireles y Emilia Cardoso de TRACY facility en i3s.
Materials
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD54/ICAM-1 antibody | BioLegend | 116114 | |
| APC Streptavidin | BioLegend | 405207 | |
| APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) antibody | BioLegend | 105826 | |
| APC/Cyanine7 anti-mouse CD45 antibody | BioLegend | 103116 | |
| APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody | BioLegend | 116223 | |
| Biotin anti-mouse CD3ε antibody | BioLegend | 100304 | |
| Biotin anti-mouse CD4 antibody | BioLegend | 100404 | |
| Biotin anti-mouse CD8a antibody | BioLegend | 100704 | |
| Biotin anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antibody | BioLegend | 108404 | |
| Biotin anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody | BioLegend | 116204 | |
| Biotin anti-mouse/human CD11b antibody | BioLegend | 101204 | |
| Biotin anti-mouse/human CD45R/B220 antibody | BioLegend | 103204 | |
| Brilliant Violet 510 anti-mouse CD150 (SLAM) antibody | BioLegend | 115929 | |
| Calibrite 2 Color Beads | BD Biosciences | 349502 | |
| Collagenase IV | Merck Life Science | C1889 | |
| Dispase II | Merck Life Science | D4693 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin | ThermoFisher Scientific | 10500064 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14175095 | |
| Mouse Leptin R Biotinylated Antibody | R&D systems | BAF497 | |
| NucBlue Fixed Cell Reagent (DAPI) | ThermoFisher Scientific | R37606 | DAPI reagent |
| PE anti-mouse endomucin antibody | ThermoFisher Scientific | 12-5851-82 | |
| PE anti-mouse Flk2 (CD135) | ThermoFisher Scientific | 12-1351-82 | |
| PE/Cyanine7 anti-mouse CD31 antibody | BioLegend | 102524 | |
| PE/Cyanine7 anti-mouse CD48 antibody | BioLegend | 103424 | |
| PerCP anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) antibody | BioLegend | 108122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) tablets | Merck Life Science | P4417 | |
| Purified anti-mouse CD16/32 antibody | BioLegend | 101302 | |
| RBC lysis buffer 10x | BioLegend | 420302 | |
| Zombie Violet Fixable Viability Dye | BioLegend | 423114 | fluorescent dye |
Referências
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