Summary
Здесь представлен протокол для генерации формалин-фиксированных, парафиновых клеточных гранул для иммуногистохимии.
Abstract
Положительный и отрицательный контроль с известной экспрессией целевых белков необходим для разработки иммуногистохимических (IHC) анализов. В то время как тканевые элементы управления полезны для хорошо охарактеризованных белков с определенными паттернами тканевой и клеточной экспрессии, они менее подходят для первоначальной разработки анализов IHC для новых, плохо охарактеризованных или повсеместно экспрессируемых белков. Альтернативно, из-за их стандартизированной природы, клеточные гранулы, включая линии раковых клеток с определенными уровнями экспрессии белка или транскрипта (например, высокая, средняя и низкая экспрессия), трансфектированные чрезмерно экспрессирующие клеточные линии или клеточные линии с генами, удаленными с помощью технологий клеточной инженерии, таких как CRISPR, могут служить ценными элементами контроля, особенно для первоначальной характеристики и отбора антител. Для того, чтобы эти клеточные гранулы использовались при разработке анализов IHC для закрепленных формалином, парафиновых тканей, они должны быть обработаны и внедрены таким образом, чтобы повторить процедуры, используемые для обработки тканей. Этот протокол описывает процесс создания и обработки элементов управления гранулами с фиксацией формалина и парафином, который может быть использован для разработки метода IHC.
Introduction
Иммуногистохимия (IHC) является одним из наиболее часто используемых анализов в исследовательской и диагностической патологии. В зависимости от контекста и анализа, IHC используется для оказания помощи в диагностике рака 1,2, прогнозировании ответа на лечение 3,4, идентификации патогенов5, характеристики типов клеток в больных тканях6 и изучения биологических путей и тканевых реакций 7,8. Во всех ситуациях основной принцип анализа IHC заключается в том, что антитело связывается конкретно с интересующей мишенью, чаще всего с белком, и это событие связывания впоследствии визуализируется в разделе9 ткани. Тем не менее, одной из самых больших проблем любого анализа IHC является обеспечение того, чтобы антитела специально обнаруживали цель, представляющую интерес10. Специфичность антител является проблемой в большинстве иммуноанализов, но иммуногистохимия предлагает уникальные проблемы в том, что нет вторичных показателей, таких как молекулярная масса, для дифференциации между специфической и неспецифической маркировкой. Это особенно проблематично при оценке плохо охарактеризованных или вездесущих мишеней, которые не имеют четко определенных моделей клеточной локализации. Поэтому надежные средства контроля, которые могут помочь охарактеризовать специфичность связывания, имеют решающее значение при разработке нового анализаIHC 10.
Для мишеней, которые четко определены с характерными паттернами клеточной экспрессии, контроль тканей часто используется в разработках метода IHC. Основываясь на богатстве предыдущих данных, можно определить, маркирует ли антитело ткань, клетку и субклеточный компартмент, в котором, как известно, оно экспрессируется, и что оно не маркирует компоненты ткани там, где оно не должноприсутствовать 11. Тем не менее, тканевые элементы управления имеют ограниченное применение для плохо охарактеризованных, новых мишеней без известных паттернов экспрессии или для белков, которые широко экспрессируются и не имеют четких паттернов экспрессии. В обоих этих сценариях отсутствие четко определенного паттерна выражения делает невозможным различение специфической маркировки от неспецифической маркировки в тканях. В этих ситуациях клеточные гранулы предлагают ценную альтернативу контролю IHC. Контроль клеточных гранул может включать: рак или другие клеточные линии, которые имеют эндогенные или внутренние/неиндуцированные уровни экспрессии интересующего белка и экспрессия белка которых может характеризоваться западным блоттингом, проточным цитометрическим анализом или экстраполироваться из транскрипционного профилирования; инженерные клеточные линии, которые либо чрезмерно экспрессируют интересующий белок, либо удаляют кодирующий ген интереса; или клетки, которые были обработаны в определенных условиях, чтобы индуцировать экспрессию белка или сигнальные события, представляющие интерес (например, фосфорилирование)10,12. Хорошо охарактеризованные уровни экспрессии белка в клеточных линиях также позволяют оценить чувствительность анализа с помощью панели клеточных линий с высокой, средней, низкой и отсутствующей экспрессией белка. Кроме того, инженерные клеточные гранулы могут быть ценными видовыми специфическими средствами контроля для ветеринарных видов, для которых может быть ограниченная характеристика или доступные тканевые элементыконтроля 13. В то время как клеточные гранулы имеют свои ограничения, такие как ограниченный протеом, присутствующий в клеточных линиях, который не будет отражать разнообразный протеом в тканях, они служат подходящими средствами контроля для подтверждения того, что антитело может обнаружить интересующую мишень, а также исключить неизбирательное связывание первичным антителом, вторичным антителом или другими регентами в анализе10.
Большинство тканей при диагностической и исследовательской патологии фиксируются в нейтральном буферизованном формалине, обезвоживаются в серии спиртов, очищаются в ксилоле, обрабатываются и внедряются в парафиновый воск. Фиксация формалина поперечными связями белков, а также фиксация и каждый дополнительный этап обработки тканей могут непосредственно влиять на белки и способность антител обнаруживать их 9,14. Поэтому важно, чтобы любые средства контроля, используемые в анализе IHC, проходили те же процедуры фиксации, обработки тканей и внедрения. В этой статье описываются уникальные соображения по обработке и внедрению культивируемых клеток для использования в качестве средств контроля для разработки анализов IHC в закрепленных формалином парафиновых внедренных тканях, причем методология в первую очередь фокусируется на обработке и обработке клеточной гранулы в гистологической лаборатории.
Protocol
1. Клеточная пеллетная подготовка
- В четырех-восьми 150 мм2 или восьми х T175 колбах выращивают клетки в среде и условиях, рекомендуемых для клеточной линии до 80%-90% слияния. Например, вырастите 293T-клетки в модифицированной среде Dulbecco's Eagle's Medium (DMEM) с 10% фетальной бычьей сывороткой и 2 мМ L-глутамина15.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки следует выращивать с использованием условий и среды, необходимых для интересующей клеточной линии16. Эти условия могут варьироваться в зависимости от клеточной линии, но последующие методы гранулирования должны быть адаптированы для клеточных линий независимо от условий культивирования. - Как только клетки окажутся вблизи слияния (80%-90%), аспирируйте питательную среду вакуумной пипеткой и промойте клетки в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS).
- Добавьте 5 мл 5-10 мМ ЭДТА в каждую колбу и инкубируйте колбы при 37 °C в течение 5-10 мин. Осторожно постучите по боковой стороне колбы, чтобы выбить клетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте трипсин, так как это может расщеплять поверхностные эпитопы, которые могут негативно повлиять на некоторые антигены.- После того, как клетки смещены, добавьте 5 мл питательной среды, используемой для клеточной линии (например, DMEM для клеток 293T) в каждую колбу, затем переместите клетки в конические трубки объемом 50 мл.
- Центрифугировать конические трубки при 930 х г при комнатной температуре в течение 5 мин. После центрифугирования удаляют среду и ЭДТА вакуумной аспирацией пипетки.
- Промыть гранулы клеток в 10-20 мл 1x PBS и, если используется несколько пластин или колб, объединить ячейки из пластин или колб (приблизительно шесть колб T175 в эксперименте, изображенном на рисунке 1) в одну коническую трубку объемом 50 мл.
- Центрифугируйте трубку при 930 х г в течение 5 мин. Аспирировать PBS после центрифугирования вакуумной пипеткой.
- Держите ячейку гранулированной трубки на влажном льду до фиксации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки охлаждаются, чтобы ограничить деградативную активность ферментов и свести к минимуму аутолиз клеток и связанные с ним изменения белка, включая изменения в локализации белка.
2. Фиксация ячейки гранулы
- Выполните фиксацию, добавив 30 мл 10% нейтрального буферизованного формалина к грануле ячейки 3 мл, чтобы создать фиксаторное отношение к ячейке 10: 1 (об:об).
- Переверните плотно закрытую трубку объемом 50 мл несколько раз, пока клетки не окажутся полностью в суспензии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образование конденсированной клеточной гранулы перед полной фиксацией может привести к неравномерной фиксации, что приводит к появлению артефактов во время последующих процедур окрашивания и иммуномаркировки. - Дайте клеточной суспензии отстояться на ночь при комнатной температуре.
- Повторно инвертируйте трубку на следующий день, чтобы повторно суспендировать клетки, увеличивая отношение поверхности к объему, чтобы улучшить фиксацию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вихрь гранулы клетки не требуется и не рекомендуется, так как это может привести к повреждению клеток.
3. Обрезка и переработка клеточных гранул
- После 24 ч фиксации центрифугируют коническую трубку объемом 50 мл при 930 х г при 5 °С в течение 10-15 мин. Убедитесь, что трубки плотно закрыты, распределены поровну и сбалансированы в центрифуге.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время фиксации может быть изменено, чтобы отразить время фиксации ткани, используемое лабораторией, или требования конкретных экспериментальных условий. - После центрифугирования убедитесь, что клетки образуют видимую гранулу. Удалите фиксатор путем декантирования и/или тщательного аспирирования стерильной переносной пипеткой.
- Добавьте расплавленный (40-60 °C) гель на основе гидроксиэтилагарозы (см. Таблицу материалов) в гранулу ячейки в соотношении 1:4 (об:об.) геля к гранулам ячейки.
- Используя чистый 5-дюймовый, 2-миллиметровый наконечник Стерлинга с глазом, промытым водопроводной водой, осторожно перемешайте расплавленный гель в неподвижную ячейку гранулы, создавая равномерную суспензию фиксированных клеток в расплавленном геле на дне конической трубки объемом 50 мл (рисунок 1A).
- Поместите колпачковую коническую трубку объемом 50 мл с расплавленным гелем, смешанным с неподвижной ячейкой гранулы, на влажный лед в течение 5-10 минут, чтобы затвердеть гелеобразную клеточную гранулу.
- Используя чистый микропаток, осторожно извлеките гранулу из конической трубки, поместив шпатель вдоль боковой стороны трубки и осторожно используя гранулу, не прокалывая ее. Поместите гранулу на биопсийную бумагу.
- Используя чистый микропаток, обрежьте гранулу ячейки на ломтики толщиной 4-5 мм, чтобы каждый срез мог поместиться в тканевую кассету размером 26 мм х 26 мм х 5 мм (рисунок 1B).
- Поместите отдельные ломтики гелевых гранул в центр куска биопсийной бумаги. Сложите два противоположных конца биопсийной бумаги поверх гранулы, обернув ее. Поместите обернутые гранулы в тканевую кассету размером 26 мм x 26 мм x 5 мм. Закройте крышку, обжав развернутые стороны обертывания биопсии тканевой кассетной крышкой (рисунок 1С).
- Поместите обрезанную ячейку гранулированной кассеты в реторту тканевого процессора, заполненную 10% нейтральным буферизованным формалином, и выполняйте короткую график обработки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Короткий график обработки состоит из 30 мин в каждой реторте, начиная с 10% нейтрального буферизованного формалина, обезвоживания через серию все более градуированных спиртов, очищенных в трех изменениях ксилолов и заканчивая инфильтрацией парафина в двух изменениях расплавленной инфильтрации / встраивания парафина 60 ° C (температура плавления 56 ° C).
4. Встраивание клеточной гранулы
- Поместите обработанные кассеты в зону хранения центра встраивания.
- Откройте крышку тканевой кассеты и аккуратно разверните биопсийную бумагу.
- Поместите ячейку гранулы в небольшую одноразовую форму для встраивания размером 15 мм x 15 мм, вырезанную стороной вниз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшая встраиваемая форма позволяет разместить до трех секций гранул клеток на одном незапятнанном слайде ткани для анализов IHC. - Осторожно удерживая гранулу клетки в нижней части формы щипцами, добавьте 62 °C тканевую инфильтрацию / встраивая парафин в форму, покрывая ячейку гранулы.
- Переместите форму в холодный блок, чтобы начать затвердевать парафин. Отрегулируйте гранулы клеток, пока парафин затвердевает, чтобы зафиксировать их в соответствующем положении в нижней части формы.
- Снимите крышку с кассеты. Поместите кассету снизу вниз поверх формы для встраивания и добавьте дополнительный расплавленный парафин, чтобы покрыть кассету.
- Когда парафин заполнен поверх тканевой кассеты, верните форму в холодный блок для затвердевания17,18.
5. Секционирование ячейки гранул
- Используйте вращающийся микротом, установленный при толщине сечения 20 мкм, чтобы обрезать блок гранул ячейки до тех пор, пока вся поверхность парафинового блока и гранула ячейки не будут захвачены в ленту парафинового сечения. Это называется «лицом» к блоку.
- Охладите и замочите облицованные блоки гранул на лотке для ледяной ванны в течение 5-15 минут, чтобы охладить и увлажнить блок перед секционированием.
ПРИМЕЧАНИЕ: Когда блок гидратирован, гранула клетки будет полупрозрачной в парафиновой ленте. Если непрозрачно, требуется больше замачивания, и артефакты могут присутствовать. - Секционирование парафиновой ленты ячейки гранулированного блока толщиной 4 мкм или другой желаемой толщины в режиме непрерывного разреза с использованием ротационного микротома.
- Поместите парафиновые ленты на водяную плавающую ванну при температуре 42 °C.
- Подберите парафиновые секции, приготовленные с помощью ротационного микротома, из плавающей ванны на положительно заряженные слайды.
- Поместите первую секцию в верхней части слайда в пределах границы обшивки и окрашивания, поместив вторую под ней, а третью секцию гранул ячейки ниже (рисунок 1D).
- После секционирования высушите горки при комнатной температуре (около 23 °C) в течение 24 ч, затем 60 °C в течение 30 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: После выпечки слайдов при 60 °C секции гранул клеток могут быть использованы с любым стандартным протоколом IHC, включая протоколы с использованием извлечения антигена на основе тепла и ферментов9.
Representative Results
После добавления геля на основе агарозы клеточная гранула должна образовывать твердую студенистую массу, поддающуюся обработке (рисунок 1В). После внедрения гранула будет иметь консистенцию, похожую на твердую ткань, и ее должно быть относительно легко регулярно разрезать на микротоме. Как только клеточные гранулы внедрены, они могут быть использованы в гистологии и экспериментах IHC идентичным образом, как закрепленные формалином, парафиновые ткани. Это включает в себя использование термоиндуцированного эпитопа или ферментативного извлечения антигена с косвенными методами хромогенного обнаружения (например, с использованием вторичного антитела с обнаружением пероксидазы хрена и диаминобензидина, как показано на Фиг.2 и Фиг.3) с использованием коммерческих платформIHC 9. Гистологически клетки должны быть равномерно распределены по всему участку с минимальным слипанием клеток, хотя адгезивные клетки могут поддерживать свои клеточно-клеточные взаимодействия в грануле. Эта дисперсия позволяет различать отдельные клетки, хотя это различие будет значительно зависеть от размера клеток и относительной плотности в грануле геля. Ядро, цитоплазма и клеточная мембрана более отчетливы и их легче визуализировать при дисперсии (рисунок 2). На рисунке 2 три клеточные линии иммуномаркированы для фактора транскрипции TEAD. Иммуномаркировка визуализируется с помощью коричневого диаминобензидина (DAB) хромогена. Клеточные линии имеют различные уровни экспрессии транскрипционного фактора TEAD, начиная от отсутствия экспрессии (рисунок 2A) до слабой экспрессии (рисунок 2B) и сильной экспрессии (рисунок 2C). В этом примере маркировка наблюдается в ядре, как и следовало ожидать от фактора транскрипции, и отсутствует в цитоплазме и клеточной мембране, которые видны, но не имеют маркировки (рисунок 2). Ячейки гранул могут быть включены в микрочипы гранул (рисунок 3) на стандартных слайдах размером 23 мм x 75 мм x 1 мм. Включение гранул клеток в микрочип позволяет оценивать элементы управления с различными уровнями экспрессии на одном слайде. В этом примере эмбриональные стволовые клетки мышей с дефицитом PEG10 (слева) служат отрицательным контролем, а клетки 293T, которые чрезмерно экспрессируют PEG10 (правая, коричневая иммуномаркировка), служат положительным контролем в микрочипе (рисунок 3). Нет никаких вариаций в тканях и процедурах встраивания для клеточных гранул, которые будут включены в микрочипы, и микрочипы могут быть сгенерированы с использованием методов, аналогичных тем, которые используются для тканей19.
Рисунок 1: Клеточная обработка гранул. (А) Клетки гранулируют в конических пробирках по 50 мл и смешивают с гелем. (B) После затвердевания гранулы последовательно нарезаются, чтобы поместиться в тканевую кассету размером 26 мм x 26 мм x 5 мм. (C) Клеточные гранулы заворачивают в биопсийную бумагу перед помещением в тканевой процессор. (D) До трех ячеек гранул могут быть последовательно собраны на одном стеклянном гистологическом слайде размером 25 мм x 75 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Клеточные гранулы с различными уровнями экспрессии белка или транскрипта могут быть использованы для оценки динамического диапазона анализа. Клеточные гранулы иммуномаркируются для транскрипционного фактора TEAD и демонстрируют различные уровни экспрессии TEAD. (A) Клетки DAUDI не имеют экспрессии TEAD и не имеют иммуномаркировки в цитоплазме или ядре. Синее пятно является гематоксилиновым контрокрастью ядра. (B) Клетки 293T демонстрируют слабую ядерную маркировку (коричневый диаминобензидин (DAB) хромоген) фактора транскрипции TEAD. (C) Клетки Detroit 562 сильно экспрессируют TEAD, о чем свидетельствует интенсивная коричневая маркировка в ядре. Маркировка внутри ядра, но не цитоплазмы (от белого до серого региона вокруг коричневого ядра), демонстрирует соответствующую маркировку иммуногистохимического анализа. Обратите внимание, что во всех трех клеточных линиях клетки диспергированы, что позволяет визуализировать отдельные клетки, включая их ядерные и цитоплазматические морфологии. Шкала = 25 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Микрочип клеточных гранул, созданный с использованием нескольких клеточных гранул с различными уровнями экспрессии белка, позволяет одновременно оценивать элементы управления на одном слайде. Эмбриональные стволовые клетки мышей с дефицитом PEG10 (слева) и 293T-клетки, чрезмерно экспрессирующие PEG10 (справа), иммуномаркируются для PEG10. В то время как сильная маркировка (коричневый хромоген DAB) наблюдается в клетках 293T, чрезмерно экспрессирующих PEG10, маркировка не проявляется в клетках с дефицитом PEG10. Синим цветом обозначено встречное пятно гематоксилина. Шкала = 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Discussion
Этот протокол описывает методологию генерации формалин-фиксированных, парафин-внедренных клеточных гранул, которые могут быть использованы в качестве средств контроля для последующей иммуногистохимии и исследований гибридизации in situ. Гистологические методологии, описанные в этом протоколе, применимы к разнообразному спектру раковых и первичных клеточных линий и в первую очередь адаптируют рутинные методы гистологии для получения этих гранул17,18. При обработке и внедрении гранулы могут использоваться аналогично тканям. Это включает в себя использование их с термоиндуцированными и ферментативными протоколами извлечения антигенов для экспериментов по иммуногистохимии. Одной из целей методологий, используемых в этом протоколе, является сохранение морфологии и антигенности клеток на протяжении всего процесса. Поэтому ЭДТА, которая является относительно мягкой с точки зрения изменений как морфологии, так и антигенности, используется для отделения клеток. Это не означает, что другие подходы, такие, как физическое разрушение, нежизнеспособны; однако любой подход к отделению клеток должен гарантировать, что клетки не будут повреждены в процессе. Второй целью этого протокола является фиксация и обработка клеток таким же образом, как и ткани, с использованием того же фиксирующего, фиксирующего соотношения, графика обработки (фиксация, обезвоживание, очистка и инфильтрация парафина) и методов внедрения, чтобы они могли служить сопоставимыми средствами контроля для последующих анализов. Следовательно, подходы к фиксации и обработке, используемые для генерации клеточных гранул, должны имитировать подходы, используемые для тканей.
Протокол, описанный в этом отчете, не адаптирован для обработки клеток с инфекционными агентами, такими как клетки, инфицированные патогенными бактериями или вирусами, поскольку клетки отделяются, собираются и центрифугируются перед фиксацией. Исследователи могут рассмотреть протоколы для фиксации клеток перед отслоением, но это потребует дальнейшей оптимизации для сбора клеток, не нарушая морфологию клеток. Кроме того, время фиксации и условия обработки клеток с инфекционными агентами требуют дополнительных соображений, основанных на инфекционном агенте и связанных с ним институциональных протоколах биобезопасности.
Гранулы клеток, фиксированные формалином, встроенные в парафин, уникально выгодны тем, что имеют четко определенные уровни экспрессии белка10. В то время как раковые и эндогенные клеточные линии предлагают выбор клеток с различными уровнями экспрессии белка, технологии генной инженерии позволяют ученым моделировать экспрессию белка путем чрезмерной экспрессии белков, представляющих интерес, и использования технологий CRISPR для иссечения или вставки кодирующих генов, представляющих интерес20,21 . Недостатком чрезмерно экспрессированных белков в клеточных линиях является то, что они являются плохими показателями чувствительности анализа, поскольку они могут не представлять эндогенные уровни белка22. Напротив, как эндогенные клеточные линии, так и линии раковых клеток могут лучше представлять эндогенные уровни экспрессии, а CRISPR-опосредованная делеция кодирующего гена в родственной линии может служить соответствующим отрицательным контролем. Кроме того, эндогенные клеточные линии или линии раковых клеток с различными уровнями экспрессии белка идеально подходят для экспериментов по титрованию, чтобы выбрать окончательные разведения антител и лучше понять чувствительность анализа (рисунок 2). Решение о том, какие клеточные линии использовать, должно основываться на индивидуальных экспериментальных потребностях и часто будет использовать комбинацию подходов.
В дополнение к оценке того, может ли антитело обнаружить интересующий белок, панель клеточных линий может быть использована для определения специфичности антитела. Например, панель клеточных линий, которые индивидуально экспрессируют семейство тесно связанных белков, может быть использована для проверки того, является ли антитело специфичным для отдельного белка или обнаруживает ли оно также другие тесно связанные белки. Более сложные средства контроля могут включать использование клеточных линий, которые экспрессируют, либо через подделку CRISPR, либо через чрезмерную экспрессию, белки с точечными мутациями, которые не могут подвергаться специфическим сигнальным событиям, которые обнаруживаются (например, мутация в конкретных участках фосфорилирования при оценке фосфоспецифического антитела). Хотя это более сложные подходы, они могут быть необходимы для подтверждения того, что антитело используется только в определенных обстоятельствах10.
Важно отметить, что генетические манипуляции с клеточными линиями могут не генерировать однородную клеточную популяцию. Например, эффективность трансфекции при сверхэкспрессии клеточных линий обычно не составляет 100%, и некоторые клетки могут не чрезмерно экспрессировать интересующий белок. Включение FLAG или связанного тега в трансфекцию, которая может быть обнаружена стандартными методами, может быть полезно для оценки эффективности трансфекции клеточной линии23. Это может быть полезно как для определения того, была ли трансфекция успешной, так и для исключения отсутствия обнаружения из-за экспрессии белка, так и для того, чтобы служить ориентиром для ожидаемой доли клеток, которые должны экспрессировать интересующий белок.
Гибридизация in situ (ISH) также может быть полезным инструментом для характеристики экспрессии генов-мишеней в клеточных гранулах и информирования о разработке методаIHC 10. При скрининге антител может быть информативно знать, когда транскрипт и, следовательно, потенциальный белок могут быть обнаружены. Кроме того, скрининг клеточных гранул ISH может быть полезен для разработки метода ISH. Хотя специфичность реже является проблемой для анализов ISH, по-прежнему важно иметь соответствующие средства контроля и аналогичные соображения для разработки и использования средств контроля, которые могут быть применены к исследованиям ISH.
Тканевые микрочипы создаются путем удаления стержней из донорских блоков и переноса этих ядер, часто в виде сетки, в парафиновый блок реципиента. В конце концов, блок получателя содержит спектр образцов в одном блоке, что позволяет всем образцам в блоке проходить идентичные процедуры IHC и позволяет проводить прямое сравнение нескольких образцов на одном слайде24,25. Поскольку клеточные гранулы представляют собой относительно однородные популяции, они могут быть точно представлены ядрами диаметром 1 мм, что делает их идеальными кандидатами для включения в аналогичные массивы. Используя клеточный грануляционный массив, можно включить клеточные гранулы с различными уровнями экспрессии, клеточные гранулы, которые уникально экспрессируют родственные белки, и клеточные гранулы, которые экспрессируют ортологи интересующего белка от разных видов в одном слайде (рисунок 3). Это позволяет одновременно быстро оценивать все клеточные гранулы в однородных условиях, сводя к минимуму использование реагентов25.
Для этого протокола рекомендуется минимальный объем гранул стартовой ячейки 2 мл, собранных из восьми колб T175. Этот объем позволяет производить и архивировать блоки гранул с несколькими ячейками, так что элементы управления гранулами ячейки могут быть стандартизированы в течение более длительных периодов времени, а из данной гранулы могут быть созданы несколько массивов гранул ячеек. Более низкие объемы клеточных гранул могут быть использованы при работе с первичными клеточными линиями, полученными от пациента, медленно растущими клеточными линиями или когда условия ограничивают объем образца. Конечно, более низкие стартовые объемы будут потенцировать негативное влияние от любой потери клеток во время фиксации и приготовления гранулы и ограничат материал, доступный для последующих процессов. Особенно важно соблюдать осторожность при удалении фиксатора после центрифугирования, чтобы свести к минимуму любые связанные с этим потери. Для меньших объемов образцов для гранулирования ячеек может использоваться центрифужная трубка объемом 1,5 мл. Эти трубки могут быть продольно разделены пополам лезвием для обработки.
Подобно фиксации тканей, фиксация клеток в этой грануле имеет решающее значение для последующих оценок IHC. Чтобы достичь полной фиксации, мы используем, по крайней мере, соотношение формалина к грануле клетки 10: 1 и инвертируем коническую трубку для поддержания клеток в суспензии. Если клетки не находятся в суспензии в момент фиксации, существует риск неполной или неадекватной фиксации, что повлияет на последующую иммуномаркировку. Часто это проявляется в виде сильной маркировки на периферии и потери маркировки в центре гранулы или маркировки переменной интенсивности по всей грануле.
Этот протокол использует гистоген, который в основном состоит из гидроксиэтилагарии, как для связывания клеточной гранулы, так и для обеспечения равномерного распределения клеток по всей клеточной грануле. Без него клетки уплотняются и теряют свои цитоморфологические детали. Эти цитоморфологические детали часто важны во время скрининга антител, поскольку они предоставляют дополнительную информацию о том, маркируется ли антитело в соответствующем субклеточном компартменте (например, ядро, цитоплазма или плазматическая мембрана). Напротив, слишком много геля может привести к снижению плотности клеток внутри гранулы, что приводит к широкому распределению клеток и снижению количества клеток на секцию.
Этот протокол может регулярно использоваться для разработки средств контроля IHC. Материалы, необходимые для создания этих гранул, распространены в исследовательских лабораториях биологии и гистологии, а методы просты и легко адаптируются. В то время как клеточные гранулы имеют ограничения в качестве контроля IHC, они служат отличными инструментами для первоначального скрининга антител и дополняют другие средства контроля тканей.
Disclosures
Все авторы являются сотрудниками Genentech/Roche и, как таковые, являются акционерами Roche.
Acknowledgments
Мы хотели бы отметить сотрудничество наших коллег из исследовательской организации Genentech, и особенно лабораторий Pathology core (P-core), которые внесли свой вклад в разработку этих методов на протяжении многих лет.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | |
| 50 mL Conical Tube | Becton Dickinson Labware | #0747-1886 | |
| 70% Ethanol | Koptec | V1401 | |
| 95% Ethanol | Koptec | V1101 | |
| Biopsy Wraps | Surgipath Medical Industries, Inc | #01090 | |
| Costar Stripette serological pipette 10mL | Corning | CLS4101 | |
| Flex 100 | Epredia | 8101 | |
| Flex 95 | Epredia | 8201 | |
| Histogel | Thermo Scientific | #R904012 | |
| Leica Automated Rotary Microtome | Leica | RM2255 | |
| Micro Spatula, rounded and tapered ends | Tedd Pella | #13510 | |
| NanoZoomer 2.0 HT whole slide imager | Hamamatsu | ||
| Paraplast Tissue Infiltration/Embedding Paraffin | Surgipath | 39601006 | |
| Pipette Controller | CAPP | PA-100 | |
| Reagent Alcohol | Epredia | 9111 | |
| Sterling Probe 5” 2mm Tip with Eye | Roboz Surgical Instrument Co., Inc | #RS-9522 | |
| Superfrost Plus positively charged microscope slides | Thermo Scientific | 6776214 | |
| Tissue cassettes; PrintMate Slotted Cassette | Epredia | B851120WH | |
| TMA Tissue Grand Master | 3DHistech LTD | ||
| Xylenes | VWR | 89370-088 |
References
- Wennerberg, A. E., Nalesnik, M. A., Coleman, W. B. Hepatocyte paraffin 1: a monoclonal antibody that reacts with hepatocytes and can be used for differential diagnosis of hepatic tumors. American Journal of Pathology. 143 (4), 1050-1054 (1993).
- Chu, P. G., Ishizawa, S., Wu, E., Weiss, L. M. Hepatocyte antigen as a marker of hepatocellular carcinoma. American Journal of Surgical Pathology. 26 (8), 978-988 (2002).
- Cobleigh, M. A., et al. Multinational study of the efficacy and safety of humanized anti-HER2 monoclonal antibody in women who have HER2-overexpressing metastatic breast cancer that has progressed after chemotherapy for metastatic disease. Journal of Clinical Oncology. 17 (9), 2639-2648 (1999).
- Vogel, C. L., et al. Efficacy and safety of trastuzumab as a single agent in first-line treatment of HER2-overexpressing metastatic breast cancer. Journal of Clinical Oncology. 20 (3), 719-726 (2002).
- Webster, J. D., Miller, M. A., DuSold, D., Ramos-Vara, J. A. Effects of prolonged formalin fixation on the immunohistochemical detection of infectious agents in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Veterinary Pathology. 47 (3), 529-535 (2010).
- Havnar, C., et al. Characterization of tumor-immune microenvironment by high-throughput image analysis of CD8 immunohistochemistry combined with modified Masson's trichrome. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 69 (9), 611-615 (2021).
- Newton, K., et al. RIPK1 inhibits ZPB1-driven necroptosis during development. Nature. 540 (7631), 129-133 (2016).
- Webster, J. D., Solon, M., Haller, S., Newton, K. Detection of necroptosis by phospho-RIPK3 immunohistochemical labeling. Methods in Molecular Biology. 1857, 153-160 (2018).
- Ramos, J. A., Miller, M. A., et al. When antibodies and antigens get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry-the red, brown, and blue technique. Veterinary Pathology. 51 (1), 42-87 (2014).
- Webster, J. D., Solon, M., Gibson-Corley, K. N. Validating immunohistochemistry assay specificity in investigative studies: consideration for a weight of evidence approach. Veterinary Pathology. 58 (5), 829-840 (2021).
- Ramos-Vara, J. A., et al. American association of veterinary laboratory diagnosticians subcommittee on standardization of immunohistochemistry suggested guidelines for immunohistochemical techniques in veterinary diagnostic laboratories. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 20 (4), 393-413 (2008).
- Dominguez, S., et al. Genetic inactivation of RIP1 kinase does not ameliorate disease in a mouse model of ALS. Cell Death and Differentiation. 28 (3), 915-931 (2021).
- Lean, F. Z. X., et al. Differential susceptibility of SARS-CoV-2 in animals: evidence of ACE2 host receptor distribution in companion animals, livestock and wildlife by immunohistochemical characterization. Transboundary and Emerging Disease. , 14232 (2021).
- Dunstan, R. W., Wharton, K. A., Quigley, C., Lowe, A. The use of immunohistochemistry for biomarker assessment-can it compete with other technologies. Toxicologic Pathology. 39 (6), 988-1002 (2011).
- Atcc.org. , Available from: http://www.atcc.org (2022).
- Thermo Fisher Scientific. Cell Culture Basics Handbook. , Gibco. (2020).
- Carson, F. Histotechnology: A Self-Instructional Text, 2nd Ed. , ASCP Press. Chicago, IL. (1997).
- Suvarna, S. K., Layton, C., Bancroft, J. D. Tissue Processing. Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques, 7th Ed. Spencer, L. T., Bancroft, J. D. , Churchill Livingstone-Elsevier. China. (2013).
- Dancau, A. M., Simon, R., Mirlacher, M., Sauter, G. Tissue Microarrays. Cancer Gene Profiling. , Humana Press. New York. 53-65 (2016).
- Jinek, M., et al. Programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife. 2, 00471 (2013).
- Hewitt, S. M., Baskin, D. G., Frevert, C. W., Stahl, W. L., Rosa-Molinar, E. Controls for immunohistochemistry: The Histochemical Society's standards of practice for validation of immunohistochemical assays. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 693-697 (2014).
- Ferrando, R., Newton, K., Chu, F., Webster, J., French, D. Immunohistochemical detection of FLAG-tagged endogenous proteins in knock-in mice. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (4), 244-255 (2015).
- Kononen, J., et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nature Medicine. 4 (7), 844-847 (1998).
- Moch, H., Kononen, J., Kallioniemi, O. P., Sauter, G. Tissue microarrays: what will they bring to molecular and anatomic pathology. Advances in Anatomic Pathology. 8 (1), 14-20 (2001).
